沙漠齿肋赤藓实时荧光定量pcr内参分子的筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种沙漠齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，该方法利用齿肋赤藓转录组数据库，选取15个内参候选基因，以15个内参基因为模板设计实时荧光定量PCR的内参基因特异引物，选取受10种非生物胁迫和没有胁迫（对照）的齿肋赤藓配子体为实验材料进行荧光定量PCR实验，运用geNorm，NormFinder和Refinder软件进行荧光定量数据的分析，从而筛选出齿肋赤藓开展各种非生物胁迫下荧光定量研究的最适合，最稳定的内参分子是CDPK和α-TUB2。用本发明所述方法可避免不同非生物胁迫下的齿肋赤藓配子体材料在RNA质量，产量及反转录效率等上的存在的误差，能更好的对实时荧光定量检测的数据进行校正和标准化，提高了该种基因定量研究的准确性和可靠性。
【专利说明】沙漠齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种适用于沙漠藓类齿肋赤藓各种非生物胁迫下实时荧光定量PCR研究的内参分子的筛选方法。
【背景技术】
[0002]干旱，高盐等非生物胁迫是限制植物生长发育和作物产量的主要因素，每年导致作物减产达50%以上。随着全球气候变暖，温室效应和土地沙漠化的加剧，干旱问题将日益突出，干旱对农业生产的影响也将更加严重。目前，利用干旱胁迫相关基因提高植物的抗旱能力，已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研究方向。
[0003]干旱区植物在长期进化过程中积累的抗干旱基因资源是开展种质创新的源动力。干旱区严酷的自然环境孕育了特殊，天然，珍稀的逆境植物资源。荒漠极端耐旱藓类齿肋赤藓即为典型代表。齿肋赤藓(Syntrichia caninervis Mitt.)隶属丛藓科、赤藓属,为典型的变水植物，是构成藓类结皮的优势种，自然干燥状态下呈灰黑色，似一层“壳”分布在沙漠表面，形成有重要生态意义的苔藓生物结皮，不仅具有较强的抗逆能力，而且在维持荒漠生态系统的稳定性和受损生态系统的恢复重建中起着重要的作用。此外，一旦遇到降水，齿肋赤藓即在30s内迅速通过再水化过程而“复原”呈鲜活的绿色，并开始执行光合作用，其独特的生理特性及抗旱性和耐热性的分子调控机制已成为国内外相关科学的研究热点。同时，长期的环境压力使得该种具有极好的抗旱，抗高温等抵抗多种非生物胁迫的能力，其体内必定蕴含着丰富的抗逆基因资源。目前，从极端抗旱藓类齿肋赤藓中发掘优质抗逆基因资源已经展开，特别是齿肋赤藓转录组数据库的建立，更是为该种的基因研究提供了很好的平台。目前，从齿肋赤藓中克隆，分析ALDH，HSP70, DREB等家族基因的工作正在展开。而要了解齿肋赤藓的抗逆机制以及挖掘丰富的抗逆基因资源，很关键的一个方法就是要分离这些基因并迅速、准确地定量检测抗旱基因在各种非生物胁迫下的表达。传统的印迹杂交，生物芯片技术和RT-PCR等手段在实时、定量检测抗旱基`因表达量上，或存在缺陷，或价格昂贵、费时费力。随着分子生物学各项技术的发展，实时荧光定量PCR已经成为目前基因表达定量检测的主要方法，该法不仅灵敏度高，样品消耗量少，能检测出低丰度靶基因表达量，定量线性宽，但是实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上依赖于筛选适合的内参基因对数据进行校正和标准化，从而避免不同标本在RNA的产量、质量及逆转录率上可能存在的差别。因此，合适稳定的内参基因的选择则是齿肋赤藓抗逆机制和抗逆基因研究的基础。
[0004]以往对内参基因的稳定性研究证实，任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的植物或特定实验因素作用下的相对恒定，在其他类型的植物中或不同实验处理下稳定性则很可能是变化的。若盲目的参考别的物种中稳定的一个内参或或几个内参基因，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能得到错误甚至是相反的结论。近年来，内参基因的稳定性问题近年来越来越受争议和关注。随着人们对内参基因稳定行问题的越来越重视，目前，已开发出基于Excel程序多种软件，用于评价内参基因的稳定性和变异系数，其中应用最普遍的为GeNorm和NormFinder程序。[0005]综上所述，荒漠极端耐旱藓类齿肋赤藓是研究沙漠藓类抗逆机制和挖掘优良抗逆基因的好材料。研究和筛选齿肋赤藓中最稳定的内参基因是进行该种基因定量研究(荧光定量PCR实验)的先决条件。近年来，做为极端抗旱藓类的齿肋赤藓的分子水平工作陆续展开，从齿肋赤藓中已克隆出一些抗逆基因，如乙醛脱氢酶基因ALDH21 (NCBI登录号:GQ245973)，特别是近年来本课题组对齿肋赤藓转录组，蛋白组等高通量测序结果的相继获得，更是加快了齿肋赤藓的分子研究工作。很多抗逆基因的特性和功能亟待研究，但关于该种的内参基因的序列资料未见报道，最合适内参分子的研究和筛选工作更是空白。因此，本发明就旨在找到一种在非生物胁迫条件下齿肋赤藓开展实时荧光定量PCR研究最稳定，最合适的内参分子的筛选方法，为以后大规模开展抗逆基因特性及功能研究奠定基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于，提供一种沙漠齿肋赤藓实时突光定量PCR内参分子的筛选方法，该方法利用实时荧光定量PCR方法研究苔藓植物抗逆相关基因功能时，缺少适用的、可靠的、表达恒定的内参分子，提出了一种适用于沙漠藓类齿肋赤藓在非生物胁迫条件下开展实时荧光定量PCR研究的最稳定，最合适的内参分子的筛选方法；利用齿肋赤藓转录组测序得到的数据库，选取了 15个齿肋赤藓候选内参基因，并以这些基因序列为基础设计实时荧光定量PCR的内参基因特异引物。选取受10种非生物胁迫和没有胁迫(对照)的齿肋赤藓为实验材料进行突光定量PCR实验验证,运用三大内参稳定性评估软件包括geNorm,NormFinder和Refinder进行突光定量数据的分析,从而筛选出齿肋赤藓开展各种非生物胁迫下荧光定量研究的最适合，最稳定的内参分子。运用本发明所述方法筛选的内参分子，可避免在多种非生物胁迫下齿肋赤藓样本在RNA产量，质量及反转录效率上可能存在的差另O，能更好的对实时荧光定量PCR检测出的数据进行校正和标准化，提高对该种基因定量研究的准确性和可靠性。
[0007]本发明所述的一种沙漠藓类齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，按下列步骤进行:`[0008]a、利用齿肋赤藓转录组测序数据，挑选15个齿肋赤藓内参候选基因，并以挑选的15个齿肋赤藓序列为基础设计了 15对实时荧光定量PCR的内参基因引物，其中15个内参基因的核苷酸序列及设计的15对实时荧光定量PCR引物序列为:
[0009]> 序列 I 齿肋赤藓 SyntrichiacaninervisActin (ACT)核苷酸序列
[0010]ATGGCTGATGCTGAGGATGTCCAGCCTTTGGTGTGCGACAATGGATCGGGGATGGTTAAGGCCGGATTCGCCGGAG
[0011]ATGACGCCCCGCGTGCCGTATTTCCCAGCATTGTTGGGCGCCCGAGACACACCGGTGTGATGGTGGGCATGGGACA
[0012]GAAAGACGCGTATGTGGGCGACGAGGCGCAGTCCAAGAGGGGTATCCTGACGCTGAAGTACCCGATCGAGCACGG
[0013]CGTGGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTGCGTGTGGCCCCCGA
[0014]GGAGCACCCGGTGCTGCTCACGGAGGCGCCTCTCAATCCCAAGGCCAACAGGGAGAAGATGACGCAGATCATGTT
[0015]CGAGACCTTCAACGTGCCGGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCGGTGCTGTCGCTGTACGCCAGTGGGCGAACCACC
[0016]GGAATTGTGCTGGATAGTGGAGACGGTGTGACTCACACAGTGCCCATCTATGAGGGGTACGCCTTGCCTCACGCCA
[0017]TTCTGCGGCTG
[0018]GACTTGGCCGGTCGCGACTTGACGGACGCGCTGATGAAGATTCTGACGGAGCGTGGTTACTCGTTCACCACCACGG
[0019]CCGAGCGCGAGATCGTGCGTGACATGAAGGAGAAGCTGGCGTACGTGGCAATCGACTTTGAGCAGGAGCTCGACA
[0020]CAGCGCGCTCATCGTCCTCGCTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCGGACGGGCAGGTGATCACGATCGGCGCGGAGC
[0021]GGTTCAGGTGCCCGGAGGTGCTGTTCAACCCGTCGCTGATCGGGATGGAAGCTGCGGGCATTCACGAGACCACTTA
【权利要求】
1.一种沙漠藓类齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，其特征在于按下列步骤进行:a、利用齿肋赤藓转录组测序数据，挑选15个齿肋赤藓内参候选基因，并以挑选的15个齿肋赤藓序列为基础设计了 15对实时荧光定量PCR的内参基因引物，其中15个内参基因的核苷酸序列及设计的15对实时荧光定量PCR引物序列为: 序列I齿肋赤藓SyntrichiacaninervisActin核苷酸序列
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述的内参基因为18s核糖体RNA，肌动蛋白，α微管蛋白1，α微管蛋白2，β微管蛋白，甘油醛_3_磷酸脱氢酶I，甘油醛-3-磷酸脱氢酶2，泛素蛋白连接酶1，泛素蛋白连接酶2，钙依赖型蛋白激酶，F-盒蛋白，转录延伸因子，肌动蛋白相关蛋白，SAND蛋白，组蛋白3。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中总共11齿肋赤藓配子体为完全复水24h后的经各种胁迫处理后的去除假根的叶片组织。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中非生物胁迫处理的条件为:分别用20%聚乙二醇6000，250mM氯化钠，100 μ M脱落酸，0.5mM硫酸铜，50mM双氧水，0.5w/m2紫外辐射模拟干旱，高盐，脱落酸，重金属，氧化和紫外胁迫；将齿肋赤藓分别置于温度4°C冰箱和温度42°C光照培养箱模拟低温和高温胁迫；用10%PEG+温度42°C模拟干热混合胁迫，机械损伤胁迫是通过剪断叶片实现；所有处理均是在胁迫6h后取材，且取得的材料立即置于液氮中，并迅速置于温度_80°C冰箱储存。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中实时荧光定量PCR模板均为I μ gRNA反转得到的cDNA的5倍稀释液，且荧光定量程序为:第一步是预变性:温度95°C -30秒；第二步是PCR反应阶段，温度95°C -5秒，温度58°C -60°C，30秒，40个循环，收集荧光信号；第三步是溶解曲线分析，温度65°C _951:，温度651:在30秒逐步升至951:，每0.51:收集一次荧光 信号。
【文档编号】C12Q1/68GK103866007SQ201410057384
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】张道远, 李小双, 李海燕, 杨红兰 申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所