一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用，本发明提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒抗原。该疫苗组合物能有效诱发抗体产生，对猪产生有效的保护，并能作为标记疫苗以有效区分野毒株和疫苗株。
【专利说明】一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、及其制备的疫苗组合物，以及制备方法和应用，属于动物病毒学领域。
【背景技术】
[0002]伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae) α亚科中的猪疱疫病毒I型(Suid herpesvirus I strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。
[0003]研究表明亚单位疫苗能够给免疫动物提供相应的保护，亚单位疫苗是利用基因工程方法将病原保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。目前发现伪狂犬病毒糖蛋白中的gB、gC、gD均能使机体产生中和抗体，这些抗体无论是在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和PRV的能力。“伪狂犬病亚单位疫苗研究进展”(杨承槐，娄高明，谌南辉《江西畜牧兽医杂志》2004年第3期)公开了在伪狂犬病病毒目前已发现的11种糖蛋白中，gB、gC、gD均能诱导机体产生中和抗体。在没有补体的参与下，gB、gC、gD的单 克隆抗体能中和PRV。猪和小鼠注射抗gB、gC、gD的单克隆抗体均能抵抗PRV强毒的攻击。因此，gB、gC、gD是研制PRV亚单位疫苗的首选蛋白。糖蛋白gD是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标，能诱导较好的保护反应。US6858385和US6521231公开了利用猪伪狂犬病病毒gD蛋白可以制备疫苗用于猪伪狂犬病的预防。
[0004]用于根除计划的疫苗的一个重要的因素是血清学标记，目前所有的PRV血清学检测方法中，gE-ELISA是最有效的区分野毒株和疫苗株的方法。因此gE缺失疫苗有利于伪狂犬的根除计划。在美国和欧共体等发达国家已经明确规定仅能使用伪狂犬gE基因缺失疫苗。专利申请CN103305474A提供的猪伪狂犬的变异株灭活疫苗，由于其不能识别野毒株和疫苗株感染，因此在生产实践中存在相当的局限。
【发明内容】
[0005]为解决现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种猪伪狂犬病病毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒株具有编码序列表SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列gD糖蛋白的核苷酸序列，并且不含编码gE糖蛋白的核苷酸序列。
[0006]可选择地，所述猪伪狂犬病病毒具有SEQ ID N0.1的氨基酸序列或与其共有98%以上同源性的氨基酸序列表示的gD糖蛋白，且不含gE糖蛋白。
[0007]可选择地，所述猪伪狂犬病病毒可包含具有SEQ ID N0.2的氨基酸序列或其片段共有95%以上核苷酸同源性的gB蛋白。
[0008]可选择地，所述猪伪狂犬病病毒可包含具有SEQ ID N0.3的氨基酸序列或其片段共有95%以上核苷酸同源性的gC蛋白。
[0009]本发明术语“gD糖蛋白”，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为gp50蛋白。
[0010]本发明术语“同源性”在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的网址上可获得:http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi,或者见，例如，Altschul S.F.etal, J.Mol.Biol.,215:403-410(1990) ；Stephen F.et al, Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997))，Clustalff2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得:http://www.ej1.ac.uk/Toolsa/clustalw2/,另见，例如，Higgins D.G.et al,Methods in Enzymology,266:383-402(1996) ；Larkin M.A.et al, Bioinformatics(Oxford, England),23(21):2947-8(2007));和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得:http://tcoffee.vital-1t.ch/cg1-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi,另见，例如，Poirot 0.et al,Nucleic Acids Res.,31 (13):3503-6 (2003) ；Notredame C.et al,J.Mol.Boil.,302(1):205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。
[0011]本发明的另一目的是提供一种猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE基因缺失株，其中，所述HN1201株的gE基因缺失株不含编码gE糖蛋白的核苷酸序列。
[0012]优选地，所述猪伪狂犬病病毒株为通过基因工程手段去掉gE基因HN1201株(Pseudorabies virus, strain HN1201)或其培养物，所述的猪伪狂犬病毒HN1201株(Pseudorabies virus strain HN1201)保藏号为 CCTCC N0.V201311 ;保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉.武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。
[0013]所述术语“培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异，优选地，所述培养物是5-35代以内的培养物。
[0014]优选地，所述HN1201株的gE基因缺失株染色体gE基因部位核苷酸序列为编码序列表SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0015]本发明的再一目的是提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒抗原、亚单位抗原。
[0016]优选地，本发明的疫苗组合物包含所述猪伪狂犬病病毒或其抗原作为活性成分。用于疫苗的组合物的猪伪狂犬病病毒具有SEQ ID N0.1的氨基酸序列或与其共有98%以上同源性的氨基酸序列表示的gD糖蛋白，且不含gE糖蛋白。[0017]用于本发明的抗原是指病毒组分的抗原部分，它引起免疫应答，并可包含具有与SEQ ID N0.1的氨基酸序列。
[0018]可选择地，抗原可包含具有SEQ ID N0.2的氨基酸序列或其片段共有95%以上核苷酸同源性的gB蛋白。
[0019]可选择地，抗原可包含具有SEQ ID N0.3的氨基酸序列或其片段共有95%以上核苷酸同源性的gC蛋白。
[0020]优选地，所述疫苗组合物包括≤106 0TCID50/ml的所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒抗原。
[0021]所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。
[0022]优选地，本发明的疫苗组合物可包含每头份IO6 tlTCID5ci量的猪伪狂犬病病毒。当猪伪狂犬病病毒以少于106_tlTCID5tl的量使用时，疫苗不能有效刺激抗体产生。另一方面，超过的量可能是不经济的。
[0023]优选地，所述疫苗组合物包括≤25 μ g/ml的所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的gD蛋白抗原。
[0024]此外，本发明的猪伪狂犬疫苗可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括猪伪狂犬病的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。本发明所用的术语“联合疫苗”用于指从本发明的猪伪狂犬病病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指的是从病毒和细菌制备的疫苗。
[0025]优选地，所述疫苗组合物还包括介质、佐剂、赋形剂。
[0026]本发明的疫苗组合物还可包含介质、佐剂和/或赋形剂。生理盐水或蒸馏水可用作介质。用于疫苗组合物的佐剂的例子包括弗氏的不完全佐剂或完全佐剂、氢氧化铝凝胶、植物油或矿物油等。赋形剂的例子包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾，但不限于此。在实践中，本领域技术人员已知的用于疫苗制备的所有物质均可适用于本发明的疫苗组合物。
[0027]本发明的又一目的是提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括:(I)培养增殖所述猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物；(2)收获所述增殖的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物，灭活；(3)加入佐剂，混匀。
[0028]具体地，所述方法为:(I)将猪伪狂犬病病毒疫苗株接种于各自的易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞；收获细胞培养物；
[0029](2)用甲醛溶液、BPL(i3-丙内酯)或BEI (二乙烯亚胺)处理来自步骤(1)的病毒；
[0030]所述易感细胞可以是传代细胞系，也可以是原代细胞。适合于猪伪狂犬病病毒的易感细胞包括但不限于，ST细胞系(ATCC编号:CRL-1746)、PK-15细胞系(ATCC编号:CCL-33)、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系(ATCC编号:CRL_12219)、牛肾细胞MDBK细胞系(ATCC编号:CCL-22)、牛睾丸传代细胞BT细胞系(ATCC编号:CRL_1390)、Vero细胞系(ATCC编号:CCL-81)、BHK-21细胞系(ATCC编号:CCL_10)、猪肾传代细胞系(如:1BRS_2，见例如，DECASTRO, M.P.1964.Behavior offoot and mouth disease virus in cell culture:susceptibility of the IB_RS_2swine cell line.Arquivos Instituto Biologica31:63-78)、兔肾传代细胞系(RK，如:ATCC编号:CCL_106)等传代细胞系，或者鸡胚成纤维细胞和猪肾细胞等原代细胞。原代细胞可以通过本领域公知的方法，用动物体内的组织进行分离和制备。
[0031]可将根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。
[0032]本发明的还一目的在于提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括:
(I)表达所述猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的gD蛋白抗原；(2)收获所述表达的gD蛋白抗原；(3)加入佐剂，混匀。
[0033]本发明的还提供了所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病的药物中的应用。
[0034]本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”用于指由猪伪狂犬毒感染引起的疾病。它的例子包括发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀、体温升高，一旦发病，怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎或繁殖障碍，但不限于此。
[0035]本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1猪伪狂犬病病毒HN1201株重组转移载体构建示意图；
[0037]图2猪伪狂犬病病毒HNl201株gE基因删除及重组位置；
[0038]图3通过PCR方法确认猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株，其中，从左至右:第一泳道为gE缺失的第一代病毒vPRV-gE—Pl基因组用引物进行PCR扩增后的电泳结果；第二泳道为gE缺失的第二代传代病毒vPRV-gE — P2基因组用引物进行PCR扩增后的电泳结果；第三泳道为gE缺失的第三代传代病毒vPRV-gE—P3基因组用引物进行PCR扩增后的电泳结果；第四泳道为猪伪狂犬病病毒HN1201株病毒基因组用引物进行PCR扩增后的电泳结果；最右的泳道为Marker。
[0039]序列表中:
[0040]序列I为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gD氨基酸序列；
[0041]序列2为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gB氨基酸序列；
[0042]序列3为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gC氨基酸序列；
[0043]序列4为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gD核苷酸序列；
[0044]序列5为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gB核苷酸序列；
[0045]序列6为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gC核苷酸序列；
[0046]序列7为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株未缺失gE前gE核苷酸序列；
[0047]序列8为猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE氨基酸序列；
[0048]序列9为猪伪狂犬病病毒HN1201株部分gE缺失后剩余的gE核苷酸序列；
[0049]序列10为猪伪狂犬病病毒HN1201株部分gE缺失后剩余的gE氨基酸序列。【具体实施方式】
[0050]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0051]本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。
[0052]本发明中所述的“TCID5(i” (50%tissue culture infective dose)是指半数细胞培养物感染量，是表不病毒感染力的一种表不方式。
[0053]MEM液体培养基(液)用购自美国Life Technologies公司的MEM干粉培养基按照其说明书配制。
[0054]本发明的DMEM培养基参照GB/T18641-2002附录A配制方法配制。
[0055]本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline)的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
[0056]实施例1、病毒的采集分离
[0057]从来自河南的疑似猪伪狂犬感染的样本中分离样本无菌采集猪脑组织，以1: 10(体积比)加入MEM培养液,研磨,制备组织悬液,经反复3次冻融后,2000r/min离心15min,收集上清液，再经0.2 μ m滤膜滤器过滤，在PK-15细胞上传代37°C培养lh，换加含2%犊牛血清的MEM培养液，37°C培养5日。收获含毒培养液，经2次冻融后，收毒，换加含2%犊牛血清的MEM培养液。采用猪伪狂犬病病毒PCR检测试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)检测猪伪狂犬病病毒，结果为阳性；对分离的病毒利用利用PCR试剂盒进行外源病毒的检测(猪蓝耳病病毒RT-PCR检测试剂盒、猪细小病毒PCR检测试剂盒猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公产品)，PCR检测结果均为阴性，表明毒种纯净。
[0058]将分离到的伪狂犬病毒提交保藏，所述猪伪狂犬病毒株为HN1201株(Pseudorabies virus, strain HN1201 )，保藏号为 CCTCC N0.V201311 ;保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉.武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。
[0059]实施例2、分离病毒的遗传特性
[0060]通过基因分析来确定实施例1中分离的病毒的遗传特性。利用在PK15细胞上分离的猪伪狂犬病病毒基因组DNA做模板，使用表1所示的引物进行PCR。分别使用PrimerPremier5.0来设计用于扩增gB、gC、gD基因的引物序列。
[0061]以提取的基因组DNA为模板，制备PCR扩增体系如下:模板DNA100 μ g，PrimerSTARHS DNA Polymerase (2.5U/ μ I) 0.5 μ 1, 2XPrimerSTAR GC Buffer25 μ 1，上下游引物各I μ I (IOpmol/μ I), dNTP Mix (2.5mM each)4 μ I,并用蒸懼水将体积补足 50 μ I。进行两步PCR反应:在98°C变性lOsec，然后在68°C退火和延伸(按照lkb/min计算所需时间)，共30个循环。在4°C终止PCR反应。通过在含有溴化乙锭的1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析所得的PCR产物。 PCR产物进行序列测定。用Lasergene软件分析所得到的序列数据。
[0062]表1PCR引物序列
[0063]
【权利要求】
1.一种猪伪狂犬病病毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒株具有编码序列表SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列gD糖蛋白的核苷酸序列，并且不含编码gE糖蛋白的核苷酸序列。
2.一种猪伪狂犬病病毒HNl201株的gE基因缺失株，其中，所述HNl201株的gE基因缺失株不含编码gE糖蛋白的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE基因缺失株，其中，所述HNl201株的gE基因缺失株染色体gE基因部位核苷酸序列为编码序列表SEQ ID N0.10所示氨基酸序列的核苷酸序列。
4.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1~3任一项所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒抗原、亚单位抗原。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括≥1060TCID50/ml的权利要求1~3任一项所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒抗原。
6.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括>25μ g/ml的权利要求I~3任一项所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的gD蛋白抗原。
7.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括介质、佐剂、赋形剂。
8.一种制备权利要求4所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括: (O培养增殖所述猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物； (2)收获所述增殖的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物，灭活； (3)加入佐剂，混匀。
9.一种制备权利要求4所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括: (1)表达所述猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的gD蛋白抗原； (2)收获所述表达的gD蛋白抗原； (3)加入佐剂，混匀。
10.根据权利要求4~7所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病的药物中的应用。
【文档编号】C12N7/00GK103923884SQ201410059931
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】张许科, 孙进忠, 田克恭, 谭菲菲 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司