一种蜡样芽孢杆菌菌株及用途
【专利摘要】本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌菌株（Bacilluscereuszy-1）及其用途，本发明所述的蜡样芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号：NO:M2014007。本发明所述蜡样芽孢杆菌发酵无菌滤液的2倍稀释液对草莓灰霉菌的孢子发芽抑制率为95.2%，发酵无菌滤液的10倍稀释液对菌丝生长的抑制率优于40%嘧霉胺悬浮剂，因此，该菌在农业方面有很大的应用前景。本发明中的技术路线合理，可为大规模工业化生产提供可靠的中试数据和设计依据，为开发相关生物制剂及大田推广应用奠定基础。
【专利说明】一种蜡样芽孢杆菌菌株及用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物【技术领域】，涉及一种细菌在生防领域中的应用，特别涉及蜡样芽孢杆菌菌株在防治草莓灰霉病方面的用途。
【背景技术】
[0002]草莓营养丰富，素有“水果皇后”之称，但由于其组织娇嫩多汁，果皮很薄，因而在采收和贮运中易受到损伤和微生物侵染导致其腐烂变质。其中由灰葡萄孢cinerea Pers ex Fr)引起的灰霉病为草莓生产中最主要的病害之一,严重时可使草莓产量损失达50%以上，这直接影响了生产者的利益，也限制草莓产业的进一步发展。长期以来，控制草莓灰霉病最有效的方法仍然是使用化学杀菌剂，然而，随着抗药性和农药残留等问题的出现以及人们对环保意识的增强，因此安全、低毒的生物防治成为研究的热点。生物防治是目前国际上进行植物病害防治的首选防治措施，这种从自然界中分离、筛选有益微生物并用于病原微生物的拮抗、抑制作用的防治方法，具有高效、无毒、无残留和低成本等特点。从现有植物病害生物防治的研究报道来看，作为生物制剂中的木霉和酵母菌已在灰霉病的防治中发挥重大作用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种提供蜡样芽孢杆菌，使得该菌防治草莓灰霉病的效果与化学药剂效果无明显差异，且具有较高的环境友好的特点。
[0004]为实现上述目的，本发明提供一种从土壤中分离得到的细菌，命名为菌株zy_I，该菌在NA培养基上菌落近圆形，灰白色，不透明，菌落大3-7 mm,边缘不整齐呈扩展状，表面粗糙颗粒状似毛玻璃状或蜡状，不分泌色素；为革兰氏阳性细菌，杆状，1.0~1.3X3.0~5.0μπι，成链，运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显；能耐受7% NaCl的培养，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、麦芽糖发酵阳性、半固体穿刺试验阳性、酪素水解阳性、VP试验阴性、柠檬酸盐利用试验阴性、吲哚试验阴性、蔗糖发酵阴性、乳糖发酵阴性、甘露醇水解阴性。此外，经16SrDNA分析，与菌株zy-Ι同源性高的菌株是芽孢杆菌，结合生理生化特征，鉴定其为蜡样芽孢杆菌。
[0005]本发明所述蜡样芽孢杆菌已于2014年I月6日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉武汉大学)，保藏号:CCTCC NO: M 2014007，名称为:蜡样芽孢杆菌zy-1 (Bacillus cereus zy_l)。
[0006]本发明所述蜡样芽孢杆菌zy-Ι的无菌滤液对草莓灰霉菌的孢子发芽具有显著的抑制效果，与对照相比，菌株zy-Ι无菌滤液的2倍稀释液抑制孢子的发芽率在95.2%，此外，zy-Ι的无菌滤液10倍稀释液的对菌丝生长的抑制效果优于40%的嘧霉胺悬浮剂的800倍稀释液。表明本发明所述的蜡样芽孢杆菌对草莓灰霉菌的孢子和菌丝都有显著抑制效果。
[0007]本发明所述的蜡样芽孢杆菌zy-Ι的无菌滤液对灰霉菌离体叶片活性的测定结果显示，用zy-Ι处理的草莓离体叶片未见发病，与对照相比，可以显著降低病情发生。[0008]从以上技术方案可知:本发明的腊样芽孢杆菌(ifeci77i/5.cereus zy_l)来源可靠，对温度、PH等自然条件的适应范围广，对不良环境的耐受力强，能维持生态平衡，能适应病害生态系统，容易培养和保存，抑制草莓灰霉病菌的效果好，在农业方面有很大的应用前景。该技术路线合理，可为大规模工业化生产提供可靠的中试数据和设计依据，实现液体发酵工业化生产腊样芽孢杆菌cereus zy-Ι),为开发相关生物制剂及大田推广奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为生防菌zy-Ι菌株16SrDNA扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图。M表示DNA分子量；1表示生防菌zy-Ι样品。
[0010]图2为蜡样芽孢杆菌zy-ι无菌滤液2倍稀释液处理(左图)对灰霉菌孢子发芽影响。
[0011]图3蜡样芽孢杆菌zy-ι无菌滤液的10倍稀释液处理(右图)对灰霉病菌菌丝生长影响。
[0012]图4离体叶段测定蜡样芽孢杆菌zy-Ι无菌滤液(右图)对草莓灰霉病的防治效
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【具体实施方式】
[0013]以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于 这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
[0014]实施例1:本发明所述蜡样芽孢杆菌zy-Ι的分离
拮抗菌的分离与纯化:①称取采自湖北省枣阳市的10 g麦田土样，②放置于200 mL的六偏磷酸钠溶液(分散剂)中震荡悬浮5 min，③在悬浮的状态下，吸取20 mL加入80 mL的
0.1%的水琼脂中，震荡悬浮5 min，④在悬浮处于搅拌的状态下，吸取0.3 mL的悬浮液，⑤将0.3 mL的悬浮液按10倍梯度稀释，分别为10_\ 10_2和10_3，⑥将梯度稀释液分别置于80°C的烘箱中30 min,拿出后待冷却后，⑦涂3个平板(每个稀释浓度3个平板)，为1/10的TSA选择性培养基，⑧所有平板置于22°C培养，2-3 d后挑选单菌落，编号保存。在平皿内对峙培养检测其对草莓灰霉病菌的抑制作用，选择形成抑菌带的菌株，命名为菌株zy-Ι。
[0015]实施例2:本发明所述蜡样芽孢杆菌生理生化以及16S rDNA序列的测定 生理生化检测结果:zy-Ι在NA平板培养基上，28°C培养36 h，菌落近圆形，灰白色，
不透明，菌落大，3-7 mm,边缘不整齐呈扩散状，表面粗糙颗粒状似毛玻璃或蜡状，不分泌色素；为革兰氏阳性细菌，杆状，1.0~1.3 X 3.0~5.0 μ m，成链，运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显；能耐受7%NaCl的培养，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、麦芽糖发酵阳性、半固体穿刺试验阳性、酪素水解阳性、VP试验阴性、柠檬酸盐利用试验阴性、吲哚试验阴性、蔗糖发酵阴性、乳糖发酵阴性、甘露醇水解阴性。参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)、《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》，初步鉴定为芽孢杆菌属。
[0016]16SrDNA序列的测定:将zy-Ι菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，180 rpm28°C培养24 h，离心收集菌体。采用上海生工Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(细菌)提取基因组。以提取到的基因组为模板，采用正向引物27bf5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；1492br 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ 对菌株的 16SrDNA 基因进行 PCR 扩增。PCR 条件为:940C 3 min ；94°C 45s，54°C 30s, 72°C I min 30sec，35个循环；72°C延伸 5 min，4°C停止。PCR产物送上海英俊生物技术有限公司测序，长度为1466 bp(图1)。测序结果在Ebiocloud中与 Bacillus cereus 相似性为 99.7%。
[0017]结合菌落形态、生理生化及分子鉴定，将这一菌株记为蜡样芽孢杆菌cereus zy_l)。
[0018]实施例3:本发明所述蜡样芽孢杆菌对草莓灰霉病菌孢子萌发和菌丝生长的试验
1.蜡样芽孢杆菌培养滤液的制备:菌株zy-Ι在28°c振荡培养3 d后，发酵液离心
(12000 r / min, 20 min)，取上清液用细菌过滤器(0.22 μ m)除菌，获得的无菌发酵液。
[0019]采用凹玻片发法进行孢子萌发试验。将草莓灰霉病菌接在PDA平板上、23 °C下培养5d，待其产孢后用无菌水将孢子洗脱下来制成浓度为IO5个/ ml孢子悬浮液，吸取50 μ L无菌发酵液加入到500 μ L离心管中，然后吸取制备好的孢子悬浮液50 μ L，使药液与孢子悬浮液等量混合均匀。吸取上述混合液40 μ L滴到凹玻片上，然后架放与带有浅层水的培养皿中，加盖保湿培养于23°C的培养箱中。每处理重复4次测定。以NA培养基的处理做空白对照。试验结果见表1。从表1看出，蜡样芽孢杆菌zy-Ι无菌滤液2倍稀释液抑制孢子发芽率在95.2%，随着稀释倍数的增加对孢子发芽的抑制率在降低。
[0020]表1蜡样芽孢杆菌zy-Ι无菌滤液对草莓灰霉病菌孢子发芽影响
【权利要求】
1.一种腊样芽孢杆菌zy-1 (5aci77w5.cereus zy_l),其特征在于所述菌种的保藏号为CCTCC NO: M 2014007。
2.如权利要求1 所述的蜡样芽孢杆菌zy-Ι在抑制草莓灰霉病方面的用途。
【文档编号】C12R1/085GK103937699SQ201410061856
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年2月25日 优先权日:2014年2月25日
【发明者】喻大昭, 龚双军, 向礼波, 杨立军, 史文琦, 张学江, 曾凡松, 薛敏峰, 汪华 申请人:湖北省农业科学院植保土肥研究所