单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及测定方法
【专利摘要】单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及其测定方法，属于分子生物学检验领域。所述试剂盒包括：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂和盒体。所述方法：人类全血基因组DNA提取；多重PCR扩增反应；单链DNA样本分离和纯化；焦磷酸测序与结果分析。用途：希望了解个体对乙醇和叶酸代谢能力情况的健康体检者；预测个体对硝酸甘油代谢能力和疗效，指导心梗患者合理选择和备用血管舒张急救药物；预测个体对叶酸的代谢能力，指导孕产妇和儿童补充适合剂量的叶酸补充剂等。
【专利说明】单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学检验领域，尤其是涉及一种单管联合测定乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因与亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变位点的试剂盒和方法。该技术可应用到临床的检测，流行病学的筛查以及种群基因组差异的研究。尤其是其可应用于临床体检与药物基因组学检测。
【背景技术】
[0002]随着高通量测序的普及以及人类基因组计划的完成，个体化诊疗技术正逐步迈向日常临床诊断与治疗工作，并正逐渐影响着临床诊疗思维和个人健康管理的方式。单核苷酸多态性分析(SNP)是个体化诊疗的重要组成部分，目前主要应用于患者的药物基因组学检测中，对患者的用药剂量与用药周期进行指导。实际上，SNP分析不仅仅能作为有效的药物基因组学标志物，其亦可作为一种优良的疾病筛查与防治标志物在体检中进行应用。
[0003]1、ALDH2基因的临床研究进展
[0004]乙醛脱氢酶ALDH是酒精代谢中将乙醛转化为乙酸的关键酶，位于12号染色体的ALDH2基因是线粒体乙醛脱氢酶的主要编码基因。当ALDH2基因发生错意SNP突变时，其编码合成的ALDH酶活性将发生不同程度的降低。ALDH酶活性的降低将引起机体对乙醛代谢能力的下降，导致大量摄入酒精后血清乙醛浓度的急剧升高，最终导致对肝脏功能的急性损害，并与肝脏、胃、食管等消化系统癌症的发生相关[1_4]。同时，ALDH酶已被证明在重要的急性心血管药物一硝酸甘油的代谢活化通路中扮演着重要的角色，其活性的降低乃至丧失将引起硝酸甘油的疗效降低甚至完全失效[5]。根据美国国立生物信息技术中心NCBI数据库的数据，ALDH2基因的Glu504Lys突变在中国人群中所占比例高达30%，为中国人群最常见的ALDH2点突变。近年来研究还表明，该突变可能与汉族人群中的二型糖尿病和冠心病的发病相关。
[0005]2、MTHFR基因的临床研究进展
[0006]亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR是叶酸代谢中的关键酶之一，可将还原型辅酶I (NADPH)相关的5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸。前者生物学作用为细胞内一碳基团的传递体，参与嘌呤和嘧啶的合成及DNA修复过程；而5-甲基四氢叶酸作为甲基供体，在甲硫氨酸合成酶的催化下将甲基基团提供给同型半胱氨酸生成蛋氨酸，并进一步复甲基化为S-腺苷甲硫氨酸，而参与体内广泛的甲基化反应。当MTHFR基因发生SNP错意突变时，其活性下降将导致体内叶酸代谢过程障碍从而引发多种疾病，包括导致唐氏综合征风险增高和新生儿发育异常[8_1CI]，伴高同型半胱氨酸血症的梗阻性脑卒中[11]，还与深静脉血栓的发生密切相关[12]。根据美国国立生物信息技术中心NCBI数据库的数据，MTHFR基因的C677T单核苷酸SNP多态性在中国人群中最为普遍，汉族人口携带者比率约为27%-46%。
[0007]3、焦磷酸测序方法学的优点[0008]目前，对于单核苷酸多态性SNP的检测技术主要包括基于等位基因特异性杂交的Taqman探针技术，分子信标技术等；基于核酸内切酶的限制性长度多态性技术，引物入侵分析技术等；基于高度特异性DNA连接酶的寡核苷酸连接分析技术；基于引物延伸的直接测序法和等位基因特异性延伸法等。但这些方法大多操作复杂，成本昂贵，因而没有在大规模SNP检测中得到应用。焦磷酸测序法由于其良好的定量性能，无需电泳或荧光标记，易于自动化等优点已成为SNP检测最主要的方法。但是，由于以往的焦磷酸测序中各个位点的扩增反应需要单独进行，这意味着需要检测的项目有几个突变位点，则需要相应数量的扩增反应。这无形中大大的提高了焦磷酸测序检测作为临床检测的成本和价格，被动地将大量需要进行该检测的患者拒之门外。本发明将ALDH2基因与MTHFR基因两个突变点进行单管的多位点扩增反应进行焦磷酸测序的检测，降低了检测的成本、简化了技术流程，从而降低了检测的费用与成本，降低了个体化医学的门槛。
[0009]参考文献:
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[0015]6、薛丽，陈玉国，徐峰，张鹤，江春晓，张运.中国汉族冠心病患者乙醛脱氢酶2基因多态性与心肌梗死的相关性研究.山东大学学报(医学版)，2007，45(8):808_812。
[0016]7、江春晓，陈玉国，张运，徐峰，张鹤，薛丽.中国汉族冠心病患者乙醛脱氢酶2基因多态性与2型糖尿病的关系.中国老年学杂志，2007，27 (4):349_350。
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[0021]12、于海东，郑红，齐华，连建华，贺颖，董子明.同型半胱氨酸代谢酶基因多态性与深静脉血栓的相关性研究.中华医学遗传学杂志，2006，23 (6):635-639。
【发明内容】
[0022]本发明的第一目的在于提供一种单管联合测定乙醛脱氢酶2 (ALDH2)基因与亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变位点的试剂盒。
[0023]本发明的第二目的在于提供一种单管联合测定乙醛脱氢酶2 (ALDH2)基因与亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变位点的方法。
[0024]所述单管联合测定乙醛脱氢酶2 (ALDH2)基因与亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变位点的试剂盒包括:
[0025](I)全血基因组DNA提取试剂:所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司，主要成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB等。
[0026](2)多重PCR扩增引物:所述多重PCR扩增引物包括:`[0027]PCR 引物 I (Seq N01):
[0028]ALDH2Glu504Lys (rs671)上游引物 5，-CAGTCACCCTTTGGTGGCTACA-3，；
[0029]PCR 引物 2 (Seq N02):
[0030]ALDH2Glu504Lys (rs671)下游引物 5，-CCAGCAGGTCCCACACTCAC-3，；
[0031]PCR 引物 3 (Seq N03):
[0032]MTHFR C677T (rsl801133)上游引物 5’ -GGCTGACCTGAAGCACTTGAA-3’ ；
[0033]PCR 引物 4 (Seq N04):
[0034]MTHFR C677T (rsl801133)下游引物 5，-CAAGTGATGCCCATGTCGGT-3，。
[0035]其中引物I和引物3的5’端均进行生物素标记。
[0036](3)多重PCR扩增反应试剂:所述多重PCR扩增反应试剂名为“2X PyroMark PCRMaster Mix”，来自德国QIAGEN公司的PyroMark PCR Kit试剂盒。具体成分主要包括热启动TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg2+、钠离子Na+以及扩增反应特异性增强剂Q-Solution。
[0037](4)单链DNA分离和纯化试剂:所述单链DNA分离和纯化试剂，主要包括购自美国通用健康公司GE Healthcare的高性能链霉亲和素琼脂糖和购自德国QIAGEN公司的PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液IOX浓缩液。
[0038](5)焦磷酸测序引物:所述焦磷酸测序引物包括:[0039]测序引物I (Seq N05):
[0040]ALDH2Glu504Lys (rs671)测序引物 5，-CACACTCACAGTTTTCACTT-3，；
[0041]测序引物2 (Seq N06):
[0042]MTHFR C677T (rsl801133)测序引物 5’ -TGCGTGATGATGAAAT-3’。
[0043](6)焦磷酸测序试剂:所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，购自德国QIAGEN公司，主要包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α -硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物包括焦磷酸测序所有需要的酶，即DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；所述底物复合物为腺苷-5’-磷酸硫酸酐。
[0044](7 )盒体:全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。
[0045]所述单管联合测定乙醛脱氢酶2 (ALDH2)基因与亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变位点的方法，采用所述单管联合测定乙醛脱氢酶2 (ALDH2)与亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变位点的试剂盒，包括如下步骤:
[0046](I)人类全血基因组DNA提取:采用所述单管联合测定乙醛脱氢酶2 (ALDH2)基因与亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变位点试剂盒的全血基因组DNA提取部分试剂，包括利用缓冲液GB和蛋白酶K溶解外周血白细胞，缓冲液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脱液TB洗脱得到DNA成分，整个提取反应以吸附柱CB3为DNA与细胞碎片和DNA与蛋白质分离的介质。
[0047](2)多重PCR扩增反应:采用所述单管联合测定乙醛脱氢酶2 (ALDH2)基因与亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变位点试剂盒的多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂，具体的反应体系和反应条件如表1和表2所示。
[0048]表1多重PCR扩增反应体系
[0049]
【权利要求】
1.单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒，其特征在于包括: (I1)全血基因组DNA提取试剂:所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，主要成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB ； (2 )多重PCR扩增引物:所述多重PCR扩增引物包括: PCR 引物 I (Seq NOl):
ALDH2Glu504Lys (rs671)上游引物 5’ -CAGTCACCCTTTGGTGGCTACA-3’ ； PCR 引物 2 (Seq N02):
ALDH2Glu504Lys (rs671)下游引物 5’ -CCAGCAGGTCCCACACTCAC-3’ ； PCR 引物 3 (Seq N03):
MTHFR C677T (rsl801133)上游引物 5’ -GGCTGACCTGAAGCACTTGAA-3’ ； PCR 引物 4 (Seq N04):
MTHFR C677T (rsl801133)下游引物 5’ -CAAGTGATGCCCATGTCGGT-3’ ； 其中引物I和引物3的5’端均进行生物素标记； (3)多重PCR扩增反应试剂:所述多重PCR扩增反应试剂名为“2XPyroMark PCRMaster Mix”,具体成分包括热启动TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg2+、钠离子Na+以及扩增反应特异性增强剂Q-Solution ； (4)单链DNA分离和纯化试剂:所述单链DNA分离和纯化试剂，包括链霉亲和素琼脂糖、PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液IOX浓缩液； (5)焦磷酸测序引物:所述焦磷酸测序引物包括: 测序引物I (Seq N05):
ALDH2Glu504Lys (rs671)测序引物 5’ -CACACTCACAGTTTTCACTT-3’ ； 测序引物2 (Seq N06):
MTHFR C677T (rsl801133)测序引物 5’ -TGCGTGATGATGAAAT-3’ ； (6)焦磷酸测序试剂:所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α -硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物包括焦磷酸测序所有需要的酶，即DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；所述底物复合物为腺苷_5’ -磷酸硫酸酐； (7)盒体:全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。
2.单管联合测定乙醛脱氢酶2与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的方法，其特征在于采用如权利要求1所述单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒，包括如下步骤: (I)人类全血基因组DNA提取:采用所述单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点试剂盒的全血基因组DNA提取部分试剂，包括利用缓冲液GB和蛋白酶K溶解外周血白细胞，缓冲液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脱液TB洗脱得到DNA成分，整个提取反应以吸附柱CB3为DNA与细胞碎片和DNA与蛋白质分离的介质；(2)多重PCR扩增反应:采用所述单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点试剂盒的多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂，具体的反应体系和反应条件如表1和表2所示； 表1多重PCR扩增反应体系
【文档编号】C12Q1/68GK103834733SQ201410067910
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】叶辉铭, 苏晓崧, 张忠英 申请人:厦门大学附属中山医院, 叶辉铭