一种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒p10蛋白的表达方法
【专利摘要】本发明提供一种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒p10蛋白的表达方法，它包括以下步骤：p10基因的扩增；MnSOD基因的扩增；将p10基因连接到pET-28a(+)载体，构建重组质粒pET-28a-p10；将MnSOD基因连接到重组载体pET-28a-p10中p10基因的羧基端，构建重组质粒pET-28a-p10-MnSOD；转化重组质粒，培养，诱导表达MnSOD融合家蚕核型多角体病毒p10蛋白。该方法得到的MnSOD融合p10蛋白表达在菌体超声后的上清中，解决了p10蛋白连接到MnSOD羧基端后容易降解的问题。
【专利说明】—种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒p10蛋白的表达方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因重组和表达【技术领域】，具体涉及一种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒PlO蛋白的表达方法。
【背景技术】
[0002]家蚕核型多角体病毒的plO基因是病毒的两个极晚期高效表达基因之一。plO基因全长1099bp，含有I个213bp的开放阅读框，编码70个氨基酸，因其蛋白分子量约为IOkDa而得名。
[0003]plO蛋白属于比较小的蛋白，不利于直接获得其晶体，通过把PlO蛋白连接到其他易于结晶和已知三级结构的载体蛋白上进行融合表达，既能有效提高PlO蛋白的表达量，又有利于P ?ο蛋白的结晶和结构解析。
[0004]之前有研究把plO蛋白连接到MnSOD的羧基端进行融合表达，但融合蛋白经过纯化、结晶以及X射线衍射解析出晶体结构后发现，MnSOD羧基端所连接的plO蛋白已经大部分降解了，故无法进一步解析出PlO蛋白的三级结构(参考文献:张小蓓等.MnSOD融合表达家蚕核型多角体病毒PlO蛋白并进行共结晶条件初筛.中国科技论文在线)。究其原因，是因为该方法得到的MnSOD融合plO蛋白表达在菌体超声后的沉淀中，这使得后续的纯化和结晶对融合蛋白的构象破坏严重，从而使无法解析出PlO蛋白的三级结构。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒PlO蛋白的表达方法，该方法得到的MnSOD融合plO蛋白表达在菌体超声后的上清中，解决了 PlO蛋白连接到MnSOD羧基端后容易降解的问题。
[0006]本发明所采用的技术方案为:
[0007]一种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒plO蛋白的表达方法，该方法包括以下步骤:
[0008](I)PlO基因的扩增；
[0009](2 ) MnSOD基因的扩增；
[0010](3)将plO基因连接到pET_28a(+)载体，构建重组质粒pET_28a-plO ；
[0011](4)将MnSOD基因连接到重组载体pET-28a-plO中plO基因的羧基端，构建重组质粒 pET-28a-pIO-MnSOD ；
[0012](5)转化重组质粒，培养，诱导表达MnSOD融合家蚕核型多角体病毒plO蛋白。
[0013]所述步骤(1)中plO基因的扩增具体是指:以pGEX-6p-l_plO重组质粒为模板，以5’ -CCATATGTCAAAGCCTAACGTTTTGAC-3’ (其中下划线为Nde I酶切位点)为上游引物、5’ -CGAAGCTTGGAGTCTGGAGGATCC-3，(其中下划线为HindIII酶切位点)为下游引物，进行PCR扩增，PCR扩增的具体程序为95°C预变性5min、95°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸30s、循环30次、最后72°C延伸lOmin，回收产物，得到plO基因。[0014]所述步骤(2)中MnSOD基因的扩增具体是指:以MnSOD基因为模板，以5’ -CGAAGCTTATGCCATTTGAATTGCC-3’ (其中下划线为 HindIII 酶切位点)为上游引物、5’ -CCCTCGAGTTACTTCGCTTTCGCTTCG-3’ (其中下划线为Xho I酶切位点)为下游引物，进行PCR扩增，PCR扩增的具体程序为95°C预变性5min、95°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸45s、循环30次、最后72°C延伸lOmin，回收产物，得到MnSOD基因。
[0015]所述步骤(3)中构 建重组质粒pET-28a_plO具体是指:plO基因和pET_28a(+)载体利用Nde I和HindIII同时进行双酶切，将酶切回收的产物用Iigationhigh进行连接60min并转化E.coliTGl感受态细胞，挑取单菌落摇菌培养后提取质粒，得到重组质粒pET_28a-plO。
[0016]所述步骤(4 )中构建重组质粒pET-28a-p IO-MnSOD具体是指:MnS0D基因和pET-28a-plO载体利用HindIII和Xho I同时进行双酶切，将酶切回收的产物用Iigationhigh进行连接60min并转化E.coliTGl感受态细胞,挑取单菌落摇菌培养后提取质粒，得到重组质粒pET-28a-pIO-MnSOD。
[0017]所述步骤(5 )中诱导表达具体是指:将重组质粒pET-28a-p IO-MnSOD转化至E.coliBL21中，在含50 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中37 °C，220rpm振荡培养至0D600=0.5，加入终浓度为ImM的IPTG，37°C，220rpm诱导表达4h。
[0018]与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果:本发明通过设计引物，将PlO连接到MnSOD的氨基端，然后通过调整工艺参数，包括PCR具体过程、控制诱导表达的起点和时间以及诱导物的加入浓度，构建了重组表达载体pET-28a-plO-MnSOD，成功使得表达的目标蛋白部分存在于上清溶液中，解决了 plO蛋白连接到MnSOD竣基端后各易降解的问题，为以后研究其三级结构和生物学功能奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1所示的是本发明重组表达载体pET-28a_pIO-MnSOD的测序鉴定结果；
[0020]图2所示的是本发明对重组表达载体pET-28a_p IO-MnSOD的表达产物进行SDS-PAGE鉴定的结果，其中M:蛋白分子标记；I:pET-28a-pIO-MnSOD未诱导对照；2:pET-28a-p IO-MnSOD 诱导表达；3:pET-28a-p IO-MnSOD 诱导表达后上清；4:pET-28a-pIO-MnSOD诱导表达后沉淀；
[0021 ] 图3所示是本发明对重组表达载体pET-28a_p IO-MnSOD的表达产物进行WesternBlotting鉴定的结果,其中M:蛋白分子标记；1:pET_28a-pIO-MnSOD未诱导对照；2:pET-28a-pIO-MnSOD诱导表达后上清；3:pET-28a-pIO-MnSOD诱导表达后沉淀；
[0022]图4所示是本发明对重组表达载体pET-28a_p IO-MnSOD的表达产物进行MS/MS质谱鉴定的结果:A:PBS上清中目的蛋白的肽段二级质谱匹配图；B:PBS沉淀中目的蛋白的肽段二级质谱匹配图。
[0023]序列表信息:
[0024]SEQIDN0.1:ρ10基因的核苷酸序列；
[0025]SEQIDN0.2 =MnSOD基因的核苷酸序列；
[0026]SEQIDN0.3:pIO-MnSOD融合蛋白的氨基酸序列；
[0027]SEQIDN0.4:ρ10基因的上游引物序列；[0028]SEQIDN0.5:plO基因的下游引物序列；
[0029]SEQIDN0.6 =MnSOD基因的上游引物序列；
[0030]SEQIDN0.7 =MnSOD基因的下游引物序列。
【具体实施方式】
[0031]以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属【技术领域】人员通常理解的相同含义。
[0032]1、原材料:
[0033]pGEX-6p-1-plO重组质粒购自特菲(天津)生物医药科技有限公司、pET_28a(+)载体购自Invitrogen公司、E.coliTGl感受态细胞购自Fermentas公司、E.coliBL21购自Fermentas 公司。[0034]2、试剂:
[0035]各内切酶购自Fermentas公司、PCR试剂购自Invitrogen公司、割胶回收试剂盒购自Invitrogen公司、连接酶Iigationhigh购自Τ0Υ0Β0、质粒提取试剂盒购自康为世纪生物科技公司、卡那霉素购自上海恒远生物科技有限公司、LB培养基购自Oxoid公司。
[0036]3、仪器设备:
[0037]PCR仪购自B10METRA公司、摇床购自天津市天拓科学仪器设备有限公司、离心机购自ThermoFisherScientific、超声仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
[0038]实施例1:重组质粒pET-28a_plO的构建
[0039](I) plO基因的扩增:
[0040]扩增plO目的基因，基因序列如SEQIDN0.1所示，引物设计如下:
[0041]Fl: 5’ -CCATATGTCAAAGCCTAACGTTTTGAC-3’ (下划线为 Nde I 酶切位点)；
[0042]Rl: 5，-CGAAGCTTGGAGTCTGGAGGATCC-3，(下划线为 HindIII 酶切位点)。
[0043]以pGEX-6p-l_plO重组质粒为模板，用所设计引物Fl和Rl扩增特异性片段。在50 μ L离心管中，加入下列组分:
【权利要求】
1.一种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒PlO蛋白的表达方法，其特征在于包括以下步骤: (1)PlO基因的扩增； (2)MnSOD基因的扩增； (3)将plO基因连接到pET-28a(+)载体，构建重组质粒pET_28a-plO； (4)将MnSOD基因连接到重组载体pET-28a-plO中plO基因的羧基端，构建重组质粒pET-28a-pIO-MnSOD ； (5)转化重组质粒，培养，诱导表达MnSOD融合家蚕核型多角体病毒PlO蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒plO蛋白的表达方法，其特征在于:所述步骤(1)中PlO基因的扩增具体是指:以pGEX-6p-1-plO重组质粒为模板，以SEQIDN0.4所示为上游引物、SEQIDN0.5所示为下游引物，进行PCR扩增，PCR扩增的具体程序为95°C预变性5min、95°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸30s、循环30次、最后72°C延伸IOmin，回收产物，得到plO基因。
3.根据权利要求1所述的一种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒plO蛋白的表达方法，其特征在于:所述步骤(2)中MnSOD基因的扩增具体是指:以MnSOD基因为模板，以SEQIDN0.6所示为上游引物、SEQIDN0.7所示为下游引物，进行PCR扩增，PCR扩增的具体程序为95°C预变性5min、95°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸45s、循环30次、最后72°C延伸lOmin，回收产物，得到MnSOD基因。
4.根据权利要求1所述的一种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒plO蛋白的表达方法，其特征在于:所述步骤(3)中构建重组质粒pET-28a-plO具体是指:ρ10基因和pET_28a(+)载体利用Nde I和HindIII同时进行双酶切，将酶切回收的产物用Iigationhigh进行连接60min并转化E.coliTGl感受态细胞，挑取单菌落摇菌培养后提取质粒，得到重组质粒pET_28a-plO。
5.根据权利要求1所述的一种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒plO蛋白的表达方法，其特征在于:所述步骤(4)中构建重组质粒pET-28a-plO-MnSOD具体是指:MnS0D基因和pET-28a-plO载体利用HindIII和Xho I同时进行双酶切，将酶切回收的产物用Iigationhigh进行连接60min并转化E.coliTGl感受态细胞,挑取单菌落摇菌培养后提取质粒，得到重组质粒pET-28a-pIO-MnSOD。
6.根据权利要求1所述的一种MnSOD融合家蚕核型多角体病毒plO蛋白的表达方法，其特征在于:所述步骤(5)中诱导表达具体是指:将重组质粒pET-28a-plO-MnSOD转化至E.coliBL21中，在含50 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中37 °C、220rpm振荡培养至0D600=0.5，加入终浓度为ImM的IPTG，37°C、220rpm诱导表达4h。
【文档编号】C12N15/70GK103898147SQ201410068256
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】张耀洲, 王小飞, 谭淑敏, 李 杰, 盖其静 申请人:天津耀宇生物技术有限公司