一种可去除随机整合的位点特异性整合载体及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种可去除随机整合的位点特异性整合载体及其构建方法和应用，包括pUC?ori、attB序列和多克隆位点MCS，在attB序列上下游分别设有第一loxP序列和第一rox序列，CMV启动子连接在第一loxP序列的上游，负筛选基因与第一rox序列相连接，负筛选基因下游还连接有内核糖体结合位点IRES2，IRES2下游为荧光标记基因，荧光标记基因下游为MCS，MCS上下游分别设有第二rox序列和第二loxP序列，并且分别与第一rox序列和第一loxP序列方向相同，MCS下游为正筛选元件。本发明为在细胞筛选中提供剔除随机整合重组细胞而直接筛选出假attP位点特异整合的重组细胞的新的应用。
【专利说明】一种可去除随机整合的位点特异性整合载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一种位点特异性整合的表达载体，特别涉及一种可去除随机整合的位点特异性整合载体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]转基因动物的研究现在正是科学研究中的热点。然而，现有的转基因动物生产技术仍然存在一定弊端:外源基因的随机插入带来的位置效应，即外源基因随机插入到与细胞重要生命活动相关的基因内部引起其异常表达，或者外源基因插入异染色质区造成外源基因表达沉默。
[0003]近年来，链霉菌噬菌体(pC31整合酶因为其可以介导带有attB位点的转基因质粒在哺乳动物基因组假attP位点整合，而且该整合具有单向整合、无需外界化学能源和辅助因子、胜任大片段基因有效整合、外源基因可长期高效表达等特点[Calos MP.The φ€31integrase system for gene therapy.Curr Gene Ther,2006,6 (6):633 - 645.],已经越来越多的用于转基因研究。而有关假attP位点在基因组分布规律方面的研究表明，假attP位点多位于基因间或基因内含子内，整合很少发生在基因的外显子中[ThyagarajanB, Liu Y, Shin S, Lakshmipathy U, Scheyhing K, Xue H, EllerstlOITl C, Strehl R, HyllnerJj Rao MS, Chesnut JD.Creation of engineered human embryonic stem cell linesusing (pC3 I integrase.Stem Cells, 2008，26 (I): 119 - 126.] 0 而且，整合位点不偏好于转录起始位点[Chalberg TWj Portlock JLj Olivares EC, Thyagarajan B, Kirby PJ，HillmanRTj Hoelters J，Calos MP.1ntegration specificity of phage CpC3 I integrase in thehuman genome.J Mol Biol，2006，357 (I): 28 - 48.]，从这方面来讲，(pC31 整合酶介导的整合潜在的安全隐患较随机插入和病毒载体系统要小的多。
[0004]然而，(pC31整合酶介导的整合反应中也存在不同程度的随机整合事件[Thyagarajanj B.，01 ivares, E.C.，HoIlis，R.P.，Ginsburg，D.S.&Calos，Μ.P.Site-specific genomic integration in mammalian cells mediated by phagephiC31integrase.Molecular and cellular biology21，3926-3934，]，这些随机整合大大降低了 q>C31整合酶介导的位点特异性整合准确性，并且为该方法的安全性带来不确定的隐患；而常规方法只能通过PCR等分子生物学手段鉴定，并人为地舍弃cpC31整合酶介导的整合反应中存在随机整合的重组细胞，此方法费时费力。
[0005]体细胞核移植技术作为转基因动物生产的有效有段，其突出优点是将基因转移提前到体细胞培养阶段，可以有效的提高转基因动物的出生率和控制生产成本[M.B.Wheelerand E.M.Walters.Transgenic technology and applications in swine.Theriogenology2001，56 (8): 1345-1369]，但是核供体细胞的准备一般需要经过药物筛选，而最终转基因细胞中抗生素筛选标记的残留，对转基因动物安全及环境安全造成了潜在的威胁，而其余载体骨架来源于细菌成分，宿主往往通过表观遗传学修饰(如甲基化)使转基因表达不稳定甚至沉默。随着人们对生物安全性的关注，载体骨架序列(被称为“垃圾DNA”)和选择标记基因的安全性已成为农业转基因生物安全性评价的重要对象之一。鉴于此，一种有效的筛选假attP位点整合重组细胞并切除包含筛选标记及载体骨架的系统迫切的需要用于转基因动物生产过程中。
【发明内容】
[0006]本发明解决的问题在于提供一种可去除随机整合的位点特异性整合载体及其构建方法和应用，克服现有基因整合和筛选方面存在的缺陷，剔除cpC31整合酶介导的整合反应中随机整合重组细胞而直接筛选出假attP位点特异整合的重组细胞，为体细胞核移植构建转基因克隆胚提供无载体骨架和筛选标记的核供体细胞，提高转基因动物生产的安全性。
[0007]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0008]—种可去除随机整合的位点特异性整合载体,包括pUC or1、attB序列和多克隆位点MCS，在attB序列上下游分别设有第一 1xP序列和第一 rox序列，CMV启动子连接在第一 1xP序列的上游,负筛选基因与第一 rox序列相连接,负筛选基因下游还连接有内核糖体结合位点IRES2，IRES2下游为荧光标记基因，荧光标记基因下游为MCS，MCS上下游分别设有第二 rox序列和第二 1xP序列，并且分别与第一 rox序列和第一 1xP序列方向相同，MCS下游为正筛选元件。
[0009]所述的多克隆位点MCS包括以下限制性内切酶识别位点:Pvu1、SpeI, AscI, PacI和 AgeI。
[0010]所述的负筛选基因的开放阅读框为HSVtk开放阅读框，负筛选基因与第一 rox序列之间还通过linker相连 接，荧光标记基因的开放阅读框为AcGFPl-Nuc开放阅读框，其终止子为Sv40终止子；正筛选元件为KanR/neoR表达元件。
[0011]所述的第一 1xP序列、attB序列、第一 rox序列、linker和tk负筛选基因在CMV启动子作用下融合表达loxP-attB-rox-linker-tk ;突光标记基因在CMV启动子作用下转录后由IRES2募集核糖体翻译灭光指不蛋白；所述的CMV启动子为组成型Pcmv IE启动子。
[0012]所述的loxP-attB-rox-linker-tk融合基因，根据linker不同分为三种:LAR-Nul1-tk,LAR- (Gly4Ser)3_tk 和 LAR_P2A_tk。
[0013]所述的第一 1xP序列、attB序列和第一 rox序列连接之后的序列如SEQ.1D.N0.1所示；
[0014]所述的第二 rox序列、MCS和第二 1xP序列连接之后的序列如SEQ.1D.N0.2所示。
[0015]一种可去除随机整合的位点特异性整合载体的构建方法，包括以下步骤:
[0016]I)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.1D.N0.1所示的两端含有HindIII和SalI酶切位点及第一 1xP序列和第一 rox序列的attB序列，得到LAR序列；
[0017]2)用HindII I/Sal I双酶切LAR序列克隆入pGEM_3Z载体获得pGEM-LAR载体
[0018]3)退火合成带有Sall/BamHI粘性末端的linker序列，分别克隆入Sall/BamHI双酶切的 pGEM-LAR 载体分别获得 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR- (Gly4Ser) 3 和 pGEM_LAR_P2A 载体；
[0019]4)分别 NcoI 单酶切 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR- (Gly4Ser) 3 和 pGEM_LAR_P2A 载体，回收300bp左右片段，分别克隆入pORF-HSVtk载体，分别获得pLARNtk，pLARGtk和pLARPtk 载体；
[0020]5)通过SOE-PCR方法，克隆获得两端含有NotI酶切位点及第二 1xP序列的MCS，克隆入 pIRES2-AcGFPl-Nuc 载体获得 pIAN-MCSL ；
[0021]6)通过PCR获得两端带有PvuI和SpeI酶切位点的SV40终止子和第二 rox序列，克隆入PIAN-MCS载体中获得PIAN-RMCSL ；
[0022]7) NheI 单酶切 pLARNtk，pLARGtk 和 pLARPtk 载体，回收 1500bp 左右片段，分别克隆入 pIAN-RMCSL 载体，获得 pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和pLARPtk-1AN-RMCSL。
[0023]所述的可去除随机整合的位点特异性整合载体在哺乳动物细胞筛选中提供剔除随机整合重组细胞而直接筛选出假attP位点特异整合的重组细胞的应用。
[0024]可去除随机整合的位点特异性整合载体在进行细胞转染之后，进行药物筛选，获得表达载体稳定转染的重组细胞；然后对其进行Cre重组剪切1xP序列和Dre重组剪切rox序列的处理，获得假attP位点特异整合的无抗生素筛选标记无质粒骨架的重组细胞。
[0025]所述的Cre重组剪切1xP序列和Dre重组剪切rox序列的处理为:
[0026]对药物筛选后的重组细胞进行包含Cre元件和Dre元件的表达载体的转染,或者将其在含有连接有穿膜肽的Cre重组酶和Dre重组酶的环境中进行孵育。
[0027]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:`[0028]1、本发明提供的可去除随机整合的位点特异性整合载体，在进行细胞转染后，在链霉菌噬菌体(pC31整合酶介导下，大部分能够位点特异性地整合到真核细胞基因组内假attP位点，其分布偏向于基因间或基因内含子内的转录活跃的区域，避免了质粒随机插入引起的基因表达沉默和其他安全隐患，从而使得转基因持续高效表达。
[0029]2、本发明提供的可去除随机整合的位点特异性整合载体，由于正负筛选标记的设计，能够通过G418和GCV进行药物筛选，获得既具有G418抗性(提示稳定整合)又不表达HSVtk (提示无随机整合事件)的阳性细胞克隆，并且辅以荧光指示蛋白提示瞬时转染效率和排除对GCV药物不敏感的随机整合重组细胞。
[0030]3、本发明提供的可去除随机整合的位点特异性整合载体，在筛选获取阳性的重组细胞后，通过对Cre重组剪切1xP和Dre重组剪切rox，去除两个同向1xP之间的CMV启动子、正筛选元件及其他载体骨架，并且去除两个rox之间的负筛选标记和荧光指示蛋白，从而获得无质粒骨架和筛选标记的假attP位点整合的转基因重组体，排除了筛选标记对转基因动物安全和环境安全的影响，也避免了由于载体骨架在宿主细胞体内引起的转基因沉默或表达不稳定。
[0031 ] 4、本发明提供的可去除随机整合的位点特异性整合载体,针对载体整合位点、转基因表达水平、筛选标记和载体骨架残留等问题，可应用于为体细胞核移植构建转基因克隆胚提供无载体骨架和筛选标记的核供体细胞，从而建立一种无载体骨架和筛选标记的转基因动物安全培育体系，可用于开展动物转基因研究。【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为载体pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL构建的凝胶电泳检测图；
[0033]图2 为 pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL 载体中不同 linker 的测序结果；
[0034]图3为本发明载体系统构成图；
[0035]图4 为 Western Blotting 检测不同 pLAR-linker-1AN-RMCSL 表达载体转染HEK293细胞后tk融合蛋白的表达情况；
[0036]图5为免疫染色法检测不同pLAR-linker-1AN-RMCSL表达载体转染HEK293细胞后tk融合蛋白的表达及亚细胞定位情况。
[0037]图6为不同pLAR-linker-1AN-RMCSL表达载体转染HEK293细胞后tk融合蛋白对不同GCV浓度的细胞毒性检测。
【具体实施方式】
[0038]本发明提供的可去除随机整合的位点特异性整合载体，该载体系统能够在链霉菌噬菌体(pC31整合酶的介导下，位点特异性地整合到真核细胞基因组内假attP位点，从而使得转基因持续高效表达，解决载体整合位点、转基因表达水平的问题；然后经药物正负筛选得到剔除了随机整合事件参与的阳性细胞后，在Cre和Dre重组剪切的作用下切除筛选标记和其他载体骨架，最终得到无筛选标记和载体骨架的转基因细胞，用于体细胞核移植，生产无筛选标记和载体骨架的转基因动物，从而提高转基因动物安全性，为开展动物转基因研究提供有价值的技术平台。下面结合具体的载体的构建和检测对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0039]一种可去除随机整合的位点特异性整合载体的构建方法，包括以下步骤:
[0040]I)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.1D.N0.1所示的两端含有HindIII和SalI酶切位点及第一 1xP序列和第一 rox序列的attB序列，命名为LAR ;具体操作为:
[0041 ] 将引物LAR_F1和LAR_R1通过退火合成片段LARl ；
[0042]以载体pARNG (参见见专利ZL201110259942.8—“一种基于假attP位点整合的通用型表达载体及其构建方法和应用”)为模板，通过引物LAR_F2和LAR_R2扩增获得300bp左右片段LAR2 (见图Ι-a，泳道I)；
[0043]以LARl和LAR2为模板，通过弓丨物LAR_F1和LAR_R2扩增得到381bp的LAR片段(见图Ι-a，泳道2)
[0044]LAR Fl:ccaagcttcc atggtagcta gcataacttc gtatagcata cattatacgaagttatagg ；
[0045]LAR Rl:ggtggcccta taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgctagctaccatggaag c ；
[0046]LAR F2:ttatagggcc accatgcccg ccgtgaccg ；
[0047]LAR R2:cgacgtcgac taactttaaa taattggcat tatttaaagt taagatgtaggtcacggtc ；
[0048]2)用HindII I/Sal I双酶切LAR序列和pGEM_3Z载体，凝胶回收LAR片段和载体骨架片段，4°C过夜连接，得到重组载体pGEM-LAR ；
[0049]酶切鉴定如图Ι-b所示，其中泳道I为Hindlll/Sall双酶切pGEM_3Z载体(阴性对照)，只有一条2743bp的条带，而泳道2为Hindlll/Sall双酶切pGEM-LAR重组载体，可切出2743bp (pGEM-3Z载体骨架)和381bp (LAR片段)两条带。
[0050]3)退火合成带有Sall/BamHI粘性末端的3种linker序列，分别克隆入Sall/BamHI 双酶切的 pGEM-LAR 载体获得 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR-(Gly4Ser)3 和PGEM-LAR-P2A载体；测序结果如图2所示。
[0051]其中，Null的 linker 序列为 ccatgg ；
[0052](Gly4Ser) 3 的 linker 序列为 ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggttcc ;
[0053]P2A 的 linker 序列为 ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggAggagaaccctggaccc ；
[0054]4) NcoI 单酶切 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR-(Gly4Ser) 3 和 pGEM_LAR_P2A 载体，回收400bp左右片段，分别克隆入pORF-HSVtk载体，获得pLARNtk，pLARGtk和pLARPtk载体；
[0055]酶切鉴定结果如图Ι-c所示:泳道I为NcoI单酶切pORF-HSVtk载体(阴性对照)，只得到一条4373bp条带，泳道2-4分别为NcoI单酶切p LARNtk, pLARGtk和pLARPtk重组载体，分别得到4373bp和400bp左右两条带。
[0056]5)通过SOE-PCR方法，克隆获得两端含有NotI酶切位点及第二 1xP序列的MCS，克隆入pIRES2-AcGFPl-Nuc载体获得pIAN-MCSL ;具体操作如下: [0057]将引物MCS_F1和MCS_R1通过SOE-PCR的方法合成片段MCSl (图l_d，86bp);该步骤SOE-PCR所用的模板为引物本身，如MCS_F1/MCS_R1本身既是引物也是模板，由于这两对引物有15_20bp的反向互补序列，退火时互补序列结合，PCR时在Taq酶作用下延伸补齐片段，形成下一轮SOE-PCR的模板；
[0058]以片段MCSI为模板，MCS_F I和MCS_R2为引物，通过SOE-PCR的方法合成片段MCS (127bp,图Ι-d)，其序列具体如SEQ.1D.N0.2所示，其中LoxP序列为ataacttcgtatagcataca ttatacgaag ttat ；
[0059]MCS Fl:ataagaatgc ggccgctcgc gatcgcgact agactagtct agttg ；
[0060]MCS Rl:cgaagttatc gaccggtagc ccttaattaa ggttggcgcg ccaactagactagtctagtc gcgat ；
[0061]MCS R2:atagtttagc ggccgcataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttatcgaccggt ；
[0062]6)通过PCR获得两端带有PvuI和SpeI酶切位点的SV40终止子和第二 rox序列，克隆入PIAN-MCSL载体中获得PIAN-RMCSL ；
[0063]双酶切鉴定结果如图Ι-e所示:泳道I为Pvul/Spel双酶切pIAN-MCSL载体，只得到5524bp —条带；泳道2为Pvul/Spel双酶切pIAN-RMCSL重组载体，得到5524bp和280bp两条带。
[0064]7) NheI 单酶切 pLARNtk，pLARGtk 和 pLARPtk 载体，回收 1500bp 左右片段，分别克隆入 pIAN-RMCSL 载体，获得 pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和pLARPtk-1AN-RMCSL 重组载体；
[0065]双酶切鉴定结果如图l_f所示，泳道I为NheI单酶切pIAN-RMCSL载体(阴性对照)，只得到一条5804bp的条带；泳道2-4为NheI单酶切pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和 pLARPtk-1AN-RMCSL 重组载体，分别得到 5804bp 和 1500bp 的两条带。
[0066]所构建的通用型表达载体pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL载体，其构成图如图3所示，包括pUC or1、attB序列和多克隆位点MCS，在attB序列上下游分别设有第一 1xP序列和第一 rox序列，CMV启动子连接在第一 1xP序列的上游，负筛选基因与第一 rox序列相连接，负筛选基因下游还连接有内核糖体结合位点IRES2, IRES2下游为荧光标记基因，荧光标记基因下游为MCS，MCS上下游分别设有第二 rox序列和第二 1xP序列，并且分别与第一 rox序列和第一 1xP序列方向相同，MCS下游为正筛选元件。
[0067]其中pUC ori是质粒的复制原点，为了质粒能在细菌里复制扩增，来源于pEGFP-Cl载体；attB序列在链霉菌噬菌体(pC31整合酶的介导下可与真核细胞基因组中假attP位点(pseudo attP)发生同源重组,从而使得载体pARNG位点特异性地整合入真核细胞基因组中的转录活跃区，有利于转基因持续高效表达；多克隆位点MCS包含5个稀有的限制性内切酶识别位点，用于目的基因元件的克隆；
[0068]CMV组成型启动子(来源于pIRES2_AcGFPl_Nuc载体)与attB序列相连接，attB序列下游插入两个同向的rox兀件，rox序列之间为linker-tk-1RES2-AcGFPl-Nuc_SV40polyA元件，两个rox元件下游设有多克隆位点MCS，MCS下游为两个同向的LoxP元件，两个LoxP元件之间包含KanR/neoR表达元件、pUC ori和CMV启动子。
[0069]表达载体pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL整合到真核细胞之后，经过G418药物筛选，获得具有G418抗性的阳性细胞克隆，其中:位点特异性整合的重组细胞由于attB位点发生断裂，TK基因(负筛选标记)不表达，因此在GCV药物筛选下依然存活；而随机整合的重组细胞attB位点不发 生断裂，TK基因在CMV启动子作用下持续表达，随机整合重组细胞在GCV药物筛选压力下细胞死亡。在获得位点特异性整合的重组细胞后，用Cre重组酶和Dre重组酶处理阳性细胞克隆，去除两个同向LoxP之间的TK筛选标记、绿色荧光蛋白基因和两个rox序列之间的neo筛选标记、CMV启动子和其他载体骨架。
[0070]所述的第一 1xP序列、attB序列和第一 rox序列连接之后的序列如SEQ.1D.N0.1所示；
[0071]所述的第二 rox序列、MCS和第二 1xP序列连接之后的序列如SEQ.1D.N0.2所示。
[0072]下面说明所构建的pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL载体在筛选位点特异性整合的无抗生素筛选标记的转基因细胞的应用，具体包括通过细胞培养、转染、荧光筛选的操作。
[0073]1、基于瞬时转染细胞，对tk融合蛋白表达的检测
[0074]I)宿主细胞的准备
[0075]将HEK293细胞接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，将接种细胞的6孔培养板放入37°C、5%C02培养箱中。待细胞生长至70%-90%汇合率时进行转染。
[0076]2)转染复合物的准备
[0077]a.准备6个1.5mL无菌离心管,分别加入200 μ I Opt1-MEM培养基；
[0078]b.向离心管中分别加入pIRES2-AcGFPl_Nuc质粒载体(2 μ g，阴性对照)、pORF-HSVtk-1AN 质粒载体(2 μ g,将 HSV-1tk 开放阅读框克隆入 pIRES2-AcGFPl_Nuc 载体)、pLARNtk-1AN-RMCSL 质粒载体(2 μ g)、pLARGtk-1AN-RMCSL 质粒载体(2 μ g)和pLARPtk-1AN-RMCSL 质粒载体(2 μ g)；[0079]c.短暂轻柔涡旋(不超过10s);
[0080]d.分别加入 8 μ I X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent ；
[0081]e.短暂轻柔涡旋；
[0082]f.室温(15°C _25tO 孵育 15_30min。
[0083]3)将转染复合物依次逐滴加入6孔培养板的细胞中，分别标记IAN、HSVtk,LARNtk、LARGtk 和 LARPtk ；
[0084]4)孵育细胞36h后，将进行了不同重组方案的重组细胞进行以下检测:
[0085]a、将重组的细胞分别用于Western Blotting检测。收集各组细胞于ImL预冷的PBS溶液中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，60 μ I Western及IP细胞裂解液(碧云天)重悬细胞，加入 cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche)调整至工作浓度，冰上裂解30min，将全蛋白加入上样缓冲液，100°C变性5min，12%的SDS-PAGE凝胶电泳，然后将样品通过半干法从SDS-PAGE凝胶上转移至PVDF膜上，一抗4°C过夜孵育，洗涤，二抗孵育2.5h，洗涤后使用eECL Western Blot Kit高灵敏度化学发光检测试剂盒曝光。
[0086]检测HSV-ltk: 一抗:Goat polyclonal antibody against HSV-1thymidinekinase (Santa Cruz 公司)；二抗:HRP_labeled Donkey Ant1-Goat IgG (H+L)(碧云天)。
[0087]检测GAPDH:—抗:Rabbit polyclonal antibody against GAPDH(Sigma 公司)；二抗:HRP_labeled goat ant1-rabbit IgG (H+L)(碧云天)。
[0088]Western Blotting 检测结果如图 4 所不:以 Goat polyclonal antibody againstHSV-1thymidine kinase作为一抗进行We`stern blotting检测，阴性对照IAN中未检测到任何条带；阳性对照HSVtk和样品LARPtk中均检测到大小约为40kDa的条带；LARNtk和LARGtk中检测到大小约为55kDa的条带，同时检测到较低分子量的条带，可能为融合蛋白降解产物(用星状符号标记)；GAPDH作为Western blot蛋白质标准化的内参。
[0089]b、将重组的细胞用于免疫荧光染色，PBS清洗三次，选用免疫染色固定液(碧云天)室温固定IOmin, PBS振洗三次,每次5min ;用免疫染色封闭液(含Triton X-100,碧云天)室温封闭60min,PBS振洗5min ;加入稀释成工作浓度的Goat polyclonal antibody againstHSV-1thymidine kinase 一抗,4°C过夜孵育,次日用PBS振洗三次,每次5min ;加入稀释成工作浓度的含有Cy3标记的驴抗山羊IgG(H+L)抗体(碧云天)，常温避光孵育60min，孵育结束后用PBS振洗三次，每次5min ;加入稀释成工作浓度的DAPI复染细胞核，常温避光孵育5min，孵育结束后去除染色液，PBS清洗后荧光显微镜下观察各种tk融合蛋白的细胞亚定位情况。
[0090]结果如图5所示:阴性对照IAN中检测不到任何荧光信号；阳性对照HSVtk中检测到HSV-1tk基因的表达，野生型HSV-1tk主要分布于细胞质中；样品LARNtk、LARGtk和LARPtk中均检测到tk融合蛋白表达，且tk融合蛋白主要分布于细胞质中；此外，样品LARNtk、LARGtk和LARPtk中均可观察到绿色荧光蛋白(AcGFP1-Nuc)表达，主要分布于细胞核。
[0091]以上检测结果证明:
[0092]将pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL (pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 或pLARPtk-1AN-RMCSL)转染HEK293细胞后，tk融合蛋白表达，且主要分布于细胞质中。
[0093]C、将转染后的细胞中表达绿色荧光蛋白(AcGFP1-Nuc)的重组细胞通过BDFACSAria流式细胞仪(BD公司)分选出来，并以5.0XlO3细胞/孔的密度接种于96孔板，然后加入不同浓度(0，0.01, 0.1, I, 10, and20 μ g/mL)的GCV。4天后，按照WST-1细胞增殖与毒性检测试剂盒(碧云天)说明检测不同tk融合蛋白对GCV的敏感程度。
[0094]结果如图6所示:转染pIRES2-AcGFPl_Nuc空载体的重组细胞对GCV不敏感，即便在10 μ g/mL高浓度的GCV作用4天后只显示出2.76%的细胞死亡率；而转染pORF-HSVtk-1AN、pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和 pLARPtk-1AN-RMCSL 载体的重组细胞在10 μ g/mL高浓度的GCV作用下，均显示出细胞毒性，GCV处理4天后后几乎所有细胞死亡；。而当GCV作用浓度减小到0.1 μ g/mL时，LARPtk组中有51.1±4.0%细胞死亡，细胞死亡率显著高于 LARNtk (28.5 ±7.7%, P=0.001)和 LARGtk 组(34.8 ±4.5%, P=0.032)，提示其对GCV更为敏感。
[0095]3、去除随机整合的位点特异性整合的转基因细胞的筛选:
[0096]待细胞生长至70%_90%汇合率，使用电穿孔转染方法对HEK293细胞进行pLARNtk-1AN-RMCSL 质粒载体、pLARGtk-1AN-RMCSL 质粒载体和 pLARPtk-1AN-RMCSL 质粒载体分别同phiC31整合酶mRNA共转染。[0097]由于通用型表达载体pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和pLARPtk-1AN-RMCSL包含G418抗性基因neoR，稳定整合到基因组上的neoR基因的阳性细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而为转染的正常细胞会被该药物杀死。
[0098]通用型表达载体转染HEK293细胞24h后在含血清的DMEM细胞培养液中添加终浓度为最小致死浓度(400 μ g/ml)的G418进行筛选；以未转染的HEK293成纤维细胞为阴性对照，其细胞培养液加有同样浓度的G418。转染细胞G418筛选12d后，对照组的细胞全部死亡；对表现为G418抗性的转染阳性重组细胞在荧光显微镜下进行观测，观察荧光指示蛋白AcGFP1-Nuc是否表达。
[0099]由于attB序列连接在CMV启动子和tk融合蛋白-1RES2-AcGFPl_Nuc阅读框之间，因此由phiC31整合酶介导的位点特异性整合会导致attB序列断裂，从而使得tk融合蛋白以及AcGFPl-Nuc荧光蛋白不表达，即只发生位点特异性整合的重组细胞对GCV药物不敏感和在荧光显微镜下检测不到绿色荧光；而整合反应中涉及的随机整合则不会影响CMV-tk融合蛋白-1RES2-AcGFPl-Nuc表达，从而导致涉及随机整合的重组细胞会在荧光显微镜下可检测到绿色荧光并在GCV药物作用下产生细胞毒性而死亡。
[0100]根据这一特性，设计两种筛选方法:
[0101]a.G418 (400 ~600 μ g/mL)单一药物筛选；
[0102]b.G418 (400 ~600 μ g/mL)和 GCV (I ~10 μ g/mL)正负双筛选。
[0103]G418单一药物筛选可得到荧光蛋白表达(GFP+)和荧光蛋白不表达(GFP-)的单克隆，而G418和GCV正负双筛选只得到GFP-的单克隆。通过计数，可见:
[0104]表1不同pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL载体转染HEK293细胞后形成克隆数对比
[0105]
【权利要求】
1.一种可去除随机整合的位点特异性整合载体，其特征在于，包括pUC or1、attB序列和多克隆位点MCS，在attB序列上下游分别设有第一 1xP序列和第一 rox序列，CMV启动子连接在第一 1xP序列的上游，负筛选基因与第一 rox序列相连接，负筛选基因下游还连接有内核糖体结合位点IRES2，IRES2下游为荧光标记基因，荧光标记基因下游为MCS，MCS上下游分别设有第二 rox序列和第二 1xP序列，并且分别与第一 rox序列和第一 1xP序列方向相同，MCS下游为正筛选元件。
2.如权利要求1所述的可去除随机整合的位点特异性整合载体，其特征在于，所述的多克隆位点MCS包括以下限制性内切酶识别位点:Pvu1、Spel、Asc1、PacI和Agel。
3.如权利要求1所述的可去除随机整合的位点特异性整合载体，其特征在于，所述的负筛选基因的开放阅读框为HSVtk开放阅读框，负筛选基因与第一 rox序列之间还通过linker相连接，荧光标记基因的开放阅读框为AcGFPl-Nuc开放阅读框，其终止子为Sv40终止子；正筛选元件为KanR/neoR表达元件。
4.如权利要求1或3所述的可去除随机整合的位点特异性整合载体，其特征在于，第一1xP序列、attB序列、第一 rox序列、I inker和tk负筛选基因在CMV启动子作用下融合表达loxP-attB-rox-linker-tk ;突光标记基因在CMV启动子作用下转录后由IRES2募集核糖体翻译突光指示蛋白；所述的CMV启动子为组成型Pcmv IE启动子。
5.如权利要求3所述的可去除随机整合的位点特异性整合载体，其特征在于，所述的 loxP-attB-rox-1 inker-tk 融合基因，根据 linker 不同分为三种:LAR-Null_tk、LAR-(Gly4Ser)3_tk 和 LAR_P2A_tk。
6.如权利要求1所述的可去除随机整合的位点特异性整合载体，其特征在于，所述的第一 1xP序列、attB序列和第一 rox序列连接之后的序列如SEQ.1D.N0.1所示；· 所述的第二 rox序列、MCS和第二 1xP序列连接之后的序列如SEQ.1D.N0.2所示。
7.—种可去除随机整合的位点特异性整合载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.1D.N0.1所示的两端含有HindIII和SalI酶切位点及第一 1xP序列和第一 rox序列的attB序列，得到LAR序列； 2)用Hindlll/Sall双酶切LAR序列克隆入pGEM_3Z载体获得pGEM_LAR载体 3)退火合成带有Sall/BamHI粘性末端的linker序列，分别克隆入Sall/BamHI双酶切的 pGEM-LAR 载体分别获得 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR-(Gly4Ser) 3 和 pGEM_LAR_P2A 载体； 4)分别NcoI 单酶切 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR-(Gly4Ser) 3 和 pGEM_LAR_P2A 载体，回收300bp左右片段，分别克隆入pORF-HSVtk载体，分别获得pLARNtk，pLARGtk和pLARPtk载体； 5)通过SOE-PCR方法，克隆获得两端含有NotI酶切位点及第二1xP序列的MCS，克隆入 pIRES2-AcGFPl-Nuc 载体获得 pIAN-MCSL ； 6)通过PCR获得两端带有PvuI和SpeI酶切位点的SV40终止子和第二rox序列，克隆入 ρ IAN-MCS 载体中获得 ρ IAN-RMCSL ； 7)NheI单酶切pLARNtk，pLARGtk和pLARPtk载体，回收1500bp左右片段，分别克隆入PIAN-RMCSL 载体，获得 pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和 pLARPtk-1AN-RMCSL。
8.权利要求1所述的可去除随机整合的位点特异性整合载体在哺乳动物细胞筛选中提供剔除随机整合重组细胞而直接筛选出假attP位点特异整合的重组细胞的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，可去除随机整合的位点特异性整合载体在进行细胞转染之后，进行药物筛选，获得表达载体稳定转染的重组细胞；然后对其进行Cre重组剪切1xP序列和Dre重组剪切rox序列的处理，获得假attP位点特异整合的无抗生素筛选标记无质粒骨架的重组细胞。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的Cre重组剪切1xP序列和Dre重组剪切rox序列的处理为: 对药物筛选后的重组细胞进行包含Cre元件和Dre元件的表达载体的转染,或者将其在含有连接有穿膜肽的Cre重组酶和Dre重组酶的环境中进行孵育。
【文档编号】C12N15/85GK103820494SQ201410073055
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】张涌, 余源, 李仲夏, 佟琪, 王易之, 王勇胜, 刘军, 权富生, 郭泽坤 申请人:西北农林科技大学, 杨凌科元克隆股份有限公司