一种用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料及其制备方法和应用，本发明的一种菌株复合载体材料，是由阿特拉津降解菌株以及载体材料通过造粒制得，其中所述的载体材料由膨润土、珍珠岩粉以及腐植酸组成。研究表明，本发明的菌株复合载体材料能够有效提升菌种对高温和紫外线的耐受力，且对土壤中的阿特拉津能够达到完全降解，同时对土壤微生物多样性扰动较小。因此，本发明所制备得到的用于土壤有机物污染修复的菌株复合载体材料为阿特拉津污染土壤的修复提供了技术支持，有效解决了阿特拉津污染土壤修复的问题，同时也为其它种类土壤有机污染的生物修复提供了参考。
【专利说明】一种用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于土壤有机物污染修复的载体材料及其制备方法和应用，特别涉及一种用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料及其制备方法和应用。本发明属于土壤修复【技术领域】。
【背景技术】
[0002]土壤污染及其对整个生态系统的负面效应是当代人类面临的主要问题之一(Umaret al., 2012; Yergeau et al.，2013)。阿特拉津(atrazine)是目前世界销售额最大的18个除草剂品种之一 (Siripattanakul et al., 2009; Khan et al.，2013),在土壤中的半衰期长，容易对一些后巷敏感作物产生药害(Anderson and Georgeson, 1989;Mandelbaum etal.，1995)，导致土壤微生物氧化损伤(Zhang et al.，2012a; 2012b)，引起土壤微生物群落多样性降低(Moreno et al., 2007; Briceno et al.，2010),已被列为环境荷尔蒙的可疑物质(Cooper et al., 2000;Laws et al.，2000;Walid et al., 2010;Swain et al，2013),且对动物细胞具有遗传学毒性(瞿建宏和吴伟，2002; Gammon et al.，2005)。我国从20世纪80年代初，开始在华北和东北地区的玉米田广泛使用阿特拉津(Shen and Liu, 1992; Ye etal.，1999)，吉林吉化、河北宣化和浙江长兴有全国三大阿特拉津生产厂家，每年阿特拉津原粉年产量可达数万吨，阿特拉津在东北地区使用更加广泛，仅辽宁一省就有5.3 X105hm2土地在使用阿特拉津除草，使用量超过1600t (司友斌和孟雪梅，2007)，我国已经将阿特拉津列为52种优先控制污染物之一 (Huang et al.，2013)。
[0003]阿特拉津的非生物降解研究主要集中在光氧化(Chan et al.，2004)、Fe (II)-H2O2原位化学氧化(Mecozzi et al.，2006)、UV_H202高级氧化(高燕飞等，2010)和微波(MW)/UV/H202共同处理(Chen et al., 2010)等方面，但是该类方法操作复杂且耗能较高，在实际应用中受到了限制。由于生物修复有机污染的温和性和多样性，兼具有成本低、操作简便、无二次污染及处理效果好等优点，能达`到对污染土壤永久清洁修复的目的，是目前最有效、最可靠和最有前景的有机污染物修复手段(Gao et al.，2011)。因此，阿特拉津的生物修复已经成为了农药污染控制领域的研究热点。
[0004]目前，约有20多个种属的微生物能降解阿特拉津，主要包括细菌、真菌、放线菌等(董春香和蒋桂兰，2001; Seybold et al.，2001;郭火生等，2012; Zhanget al.，2012;王志刚等，2013)，并且在降解菌廉价发酵培养基的研究开发方面也取得了重要成果(Zhang etal.，2012c;王洋等，2013)，但是对于修复菌剂研发与应用研究在国内外报道还比较少，本研究旨在研发阿特拉津修复菌株复合载体材料及其制备方法，并对修复效果和土壤微生物多样性的响应开展了研究工作，为阿特拉津污染土壤的修复提供技术支持，为其它种类土壤有机污染的生物修复提供参考。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供一种用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料；
[0006]本发明的目的之二是提供一种制备上述菌株复合载体材料的方法；
[0007]本发明的目的之三是提供所制备得到的菌株复合载体材料在土壤有机物污染修复中的应用。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用的技术手段为:
[0009]本发明的一种用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料，其特征在于由阿特拉津降解菌株以及载体材料通过造粒制得，其中所述的载体材料由膨润土、珍珠岩粉以及腐植酸组成。
[0010]在本发明中，优选的，按重量计，所述的载体材料中膨润土、珍珠岩粉以及腐植酸的比例为 0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，更优选为 1:0.5:0.5。
[0011]在本发明中，优选的，所述的膨润土的粒径为325目，所述的珍珠岩粉的粒径为90目，所述的腐植酸的粒径为60目。
[0012]在本发明中，优选的，所述的阿特拉津降解菌株为阿特拉津降解菌DNS32，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC N0.5365，保藏日期为2011年10月21日。该菌株已记载在申请号为201110371730.9，发明名称为“一株阿特拉津降解菌”的专利申请中，并于2012年06月13日公开。
[0013]在本发明中，优选的，所述的阿特拉津降解菌株按照1.0X IO7-L OX IO9CFU -g^1载体材料的比例，更优选的，是按照2.0X IO8CFU.g—1载体材料的比例滴加到载体材料中进行造粒，造粒完成后，自然风干至含水量为30%，即得。
[0014]在本发明中，优选的，所述`的造粒采用圆盘机造粒，圆盘造粒机的直径为2.5m,造粒盘转速为22r.mirT1,造粒盘倾角为45°~55°。
[0015]进一步的，本发明还提供了一种制备以上任一项所述的用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0016](I)活化阿特拉津降解菌株DNS32的斜面菌种，在基础培养基中发酵培养24h，OD为0.8时，以发酵培养基体积的1%为接种量接种于发酵培养基中，25°C，120r.mirT1摇瓶发酵48h，至生物量为6 X IO8CFU.md X IO8CFU.mL—1，得到阿特拉津降解菌菌剂；
[0017](2)将膨润土、珍珠岩粉以及腐植酸均匀混合制备得到载体材料；
[0018](3)按照 1.0X IO7-L OX IO9CFU.g-1 载体材料的比例，优选按照 2.0XlO8CFU.g-1载体材料的比例，将步骤(1)制备得到的菌剂滴加到载体材料中在圆盘上进行造粒；所述的造粒采用圆盘机造粒，圆盘造粒机的直径为2.5m,造粒盘转速为22r.mirT1,造粒盘倾角为45°~55°，造粒完成后，自然风干至含水量为30%，即得用于土壤有机物污染修复的菌株复合载体材料。
[0019]在本发明所述的方法中，优选的，所述的基础培养基中含有K2HPO4L 6g.?ΛKH2PO40.4g.L-1, MgSO40.2g.L-1, NaCl0.1g.I71，葡萄糖 3.0g.I71,阿特拉津 0.1g.L-1,调PH为7.0,蒸馏水定容至1000ml ;所述的发酵培养基中含有:玉米粉39.494g.L_\大豆粉25.638g.ΙΛ CaC033g.?Λ Κ2ΗΡ043.265g.?Λ MgSO4.7Η200.2g.?Λ NaCl0.2g.L'i周 pH为7.0，蒸馏水溶解定容至1000ml。
[0020]在本发明所述的方法中，优选的，按重量计，所述的载体材料中膨润土、珍珠岩粉以及腐植酸的比例为0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，更优选为1:0.5:0.5。
[0021]再进一步的，本发明还提出了所述的菌株复合载体材料在土壤有机物污染修复中的应用，所述的有机污染物主要包括阿特拉津。
[0022]本发明采用正交试验方法，以阿特拉津降解菌株的存活率为目标形状，参考材料成球率，同时结合原料成本、价格和收益等统筹考虑选取合适的用量，从而对选用的膨润土、珍珠岩粉、腐植酸混合用量进行优化，此外，结合本发明的制备工艺制备得到了适用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料。接着本发明发明人进行了不同温度和紫外线照射时间对载体内菌株存活率影响的研究，结果表明本发明的菌株复合载体材料能够有效提升菌种对高温和紫外线的耐受力，且当膨润土、珍珠岩粉和腐植酸质量比为1:0.5:0.5时效果最佳。
[0023]将采用最佳配比得到的载体材料添加到发酵菌体中制备得到菌株复合载体材料，进行土壤修复试验。结果表明，按照菌株复合载体材料与修复土体的质量百分比计算，在菌株复合载体材料(载体菌剂)的添加量为0.1%和0.5%的处理中，35d时，阿特拉津基本完全降解，而采用自由菌处理的对照组阿特拉津残留量均>16%，说明吸附载体增强了菌株的修复活力；通过检测修复过程中土壤微生物Shannon多样性指数和均匀度发现添加0.1%载体菌剂处理对土壤微生物多样性扰动较小。因此，综合比较阿特拉津降解效果、微生物群落多样性变化及成本等因素，确定0.1%的载体菌剂添加量为最佳修复处理添加量。
[0024]综上，本发明所制备得到的用于土壤有机物污染修复的菌株复合载体材料为阿特拉津污染土壤的修复提供了技术支持，有效解决了阿特拉津污染土壤修复的问题，同时也为其它种类土壤有机污染的生物修复提供了参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为在15°C (a)、25°C (b)、40°C (c)和60°C (d)条件下不同载体中菌体存活率；
[0026]图2为不同载体抗紫外线能力检测；
[0027]图3为阿特拉津在不同处理中的残留曲线；
[0028]图4为生物修复对土壤微生物Shannon多样性指数和均匀度的影响。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0030]实施例1用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料的制备
[0031]1、菌种与培养基
[0032]Acinetobacter sp.DNS32为本实验室分离获得的一株阿特拉津降解菌株(郭火生等，2012;王志刚等，2013) ，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC N0.5365，保藏日期为2011年10月21日。该菌株已记载在申请号为201110371730.9，发明名称为“一株阿特拉津降解菌”的专利申请中，并于2012年06月13日公开。
[0033]基础培养基(g? L—1) ：K2HP041. 6，KH2P040. 4，MgS040. 2，NaClO. 1，葡萄糖 3. 0，阿特 拉津0. 1，pH7. 0，蒸馏水定容至1000ml ；
[0034]发酵培养基（Zhanget al. , 2012) (g ? I71):玉米粉 39. 494，大豆粉 25. 638， CaC0s3, K2HP043. 265，MgS04 ? 7H200. 2，NaClO. 2，pH7. 0，蒸馏水溶解定容至 1000ml。
[0035]2、方法
[0036](1)活化阿特拉津降解菌株DNS32的斜面菌种，在基础培养基中发酵培养24h，0D 为0. 8时，以发酵培养基体积的1%为接种量接种于发酵培养基，25°C，120r ? min—1摇瓶发 酵48h，至生物量为7. 2X108CFU ? mL—1左右，得到阿特拉津降解菌菌剂；
[0037](2)将膨润土（325目)、珍珠岩粉（90目)、腐植酸(生物腐植酸> 40%,生化黄腐 酸≤20%，60目）按照重量比为1:0. 5:0. 5混合均匀制备得到载体材料；
[0038](3)按照2. OX 108CFU .g—1载体材料的比例，将步骤（1)制备得到菌剂滴加到载体 材料中在圆盘上进行造粒；所述的造粒采用圆盘机造粒，圆盘造粒机的直径为2. 5m，造粒 盘转速为22r ^化―1，造粒盘倾角为45°?55°，造粒完成后，自然风干至含水量为30%，即 得用于土壤有机物污染修复的菌株复合载体材料。
[0039]实施例2用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料的制备
[0040]1、菌种与培养基
[0041]同实施例1。
[0042]2、方法
[0043](1)活化阿特拉津降解菌株DNS32的斜面菌种，在基础培养基中发酵培养24h，0D 为0. 8时，以发酵培养基体积的1%为接种量接种于发酵培养基，25°C，120r ? min—1摇瓶发 酵48h，至生物量为8X 108CFU ? mL—1左右，得到阿特拉津降解菌菌剂；
[0044](2)将膨润土（325目)、珍珠岩粉（90目）、腐植酸(生物腐植酸> 40%,生化黄腐 酸≤20%，60目）按照重量比为0. 5:1:0. 5混合均匀制备得到载体材料；
[0045](3)按照IX 108CFU 载体材料的比例，将步骤（1)制备得到菌剂滴加到载体材 料中在圆盘上进行造粒；所述的造粒采用圆盘机造粒，圆盘造粒机的直径为2. 5m，造粒盘 转速为22r ^化―1，造粒盘倾角为45°?55°，造粒完成后，自然风干至含水量为30%，即得 用于土壤有机物污染修复的菌株复合载体材料。
[0046]实施例3用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料体系的建立及其在降 解阿特拉津中的应用
[0047]1 材料与方法（Materials and methods)
[0048]1. 1菌种与培养基
[0049]同实施例1，
[0050]1. 2菌剂制备与生物量测定
[0051]活化斜面菌种Acinetobacter sp. DNS32，在基础培养基中发酵培养24h，0D为0. 8 时，按照体积百分比为1%接种于发酵培养基，25°C，120r ? mirT1摇瓶发酵48h，生物量约为 7. 2X108CFU ? mL'按照2. OX 108CFU ? g—1载体材料的比例在圆盘上滴加进行造粒。圆盘 造粒机的直径为2. 5m,造粒盘转速为22r ? mirT1,造粒盘倾角为45°?55° ,造粒结束后， 自然风干至含水量为30%，根据进料量和成球质量计算材料成球率。[0052]采用正交试验方法，对选用的3种载体材料一膨润土(325目)、珍珠岩粉(90目)、腐植酸(生物腐植酸> 40%，生化黄腐酸> 20%, 60目)的混合用量进行试验，因素水平见表1。采用基础培养基，进行10倍梯度稀释，每个梯度设定5个平行，进行平板计数计算Acinetobacter sp.DNS32的存活率。在广口瓶内避光室温放置45d后，测定存活率，选取存活率较好的3个载体配比处理，设定3个平行，在广口瓶中分别在15°C、25°C、40°C、60°C条件下储存，放置0d、5d、10d、15d、20d后测定菌株存活率。同时，把3个载体配比处理均匀平铺在培养皿上，每个处理3个平行，置于波长312nm紫外灯下IOcm处，分别照射Omin、20min、40min、60min和80min,测定菌株存活率。
[0053]表1因素质量比例水平
【权利要求】
1.一种用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料，其特征在于由阿特拉津降解菌株以及载体材料通过造粒制得，其中所述的载体材料由膨润土、珍珠岩粉以及腐植酸组成。
2.如权利要求1所述的用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料，其特征在于按重量计，所述的载体材料中膨润土、珍珠岩粉以及腐植酸的比例为0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，优选 1:0.5:0.5。
3.如权利要求2所述的用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料，其特征在于所述的膨润土的粒径为325目，所述的珍珠岩粉的粒径为90目，所述的腐植酸的粒径为60目。
4.如权利要求1所述的用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料，其特征在于所述的阿特拉津降解菌株为阿特拉津降解菌DNS32，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC N0.5365，保藏日期为2011年10月21日。
5.如权利要求1或4所述的用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料，其特征在于所述的阿特拉津降解菌株按照1.0X IO7-L OX IO9CFU.g—1载体材料的比例，优选按照2.0X IO8CFU.g—1载体材料的比例滴加到载体材料中进行造粒，造粒完成后，自然风干至含水量为30%，即得。
6.如权利要求1或5所述的用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料，其特征在于所述的造粒采用圆盘机造粒，圆盘造粒机的直径为2.5m,造粒盘转速为22r.mirT1,造粒盘倾角为45°~55°。
7.制备权利要求1-6任一项所述的用于阿特拉津污染土壤修复的菌株复合载体材料的方法，其特征在于包括以下步骤: Cl)活化阿特拉津降解菌株DNS32`的斜面菌种，在基础培养基中发酵培养24h，OD为0.8时，以发酵培养基体积的1%为接种量接种于发酵培养基中，25°C，120r -min^1摇瓶发酵48h，至生物量为6 X IO8CFU.md X IO8CFU.πι?Λ得到阿特拉津降解菌菌剂； (2)将膨润土、珍珠岩粉以及腐植酸均匀混合制备得到载体材料； (3)按照1.0X IO7-L OX IO9CFU.g—1载体材料的比例，优选按照2.0X IO8CFU.g—1载体材料的比例，将步骤(1)制备得到的菌剂滴加到载体材料中在圆盘上进行造粒；所述的造粒采用圆盘机造粒，圆盘造粒机的直径为2.5m,造粒盘转速为22r.mirT1,造粒盘倾角为45°~55°，造粒完成后，自然风干至含水量为30%，即得用于土壤有机物污染修复的菌株复合载体材料。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述的基础培养基中含有K2HPO4L6g.L—1，KH2PO40.4g.L-1, MgSO40.2g.L-1, NaCl0.1g.I71，葡萄糖 3.0g.I71,阿特拉津 0.1g.L-1,调PH为7.0,蒸馏水定容至1000ml ;所述的发酵培养基中含有:玉米粉39.494g.L_\大豆粉25.638g.ΙΛ CaC033g.?Λ Κ2ΗΡ043.265g.?Λ MgSO4.7Η200.2g.?Λ NaCl0.2g.L'i周 pH为7.0，蒸馏水溶解定容至1000ml。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于按重量计，所述的载体材料中膨润土、珍珠岩粉以及腐植酸的比例为0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，优选为1:0.5:0.5。
10.权利要求1-6任一项所述的菌株复合载体材料在阿特拉津污染土壤修复中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK103882003SQ201410087829
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】张颖, 王志刚, 姜昭, 孟庆娟, 王蕾, 冯程程 申请人:东北农业大学