永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途

文档序号:471517阅读:349来源:国知局
永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途
【专利摘要】本发明属于细胞工程【技术领域】,具体涉及永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途。本发明要解决的技术问题是为构建永生化人软骨终板干细胞系提供一种有效的制备方法。本发明的技术方案是采用慢病毒转染技术构建永生化人软骨终板干细胞系的制备方法,包括如下步骤:a、构建SV40T抗原病毒载体;b、SV40T抗原基因转染人终板干细胞;c、传代并筛选得到永生化软骨终板干细胞。本发明还提供了由上述方法得到的永生化人软骨终板干细胞系在制备骨组织工程材料中的用途。本发明可应用于组织工程骨的制备,为临床上一系列长骨缺损、骨不连病人提供一种价格低廉、成骨能力强的骨组织工程的种子细胞。
【专利说明】永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞工程【技术领域】,具体涉及永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途。
【背景技术】
[0002]临床上常由于某些原因如外伤、感染、肿瘤等造成开放性骨折、骨不连以及骨缺损,是运动系统疾病中常见和处理困难的疾患,也是患者丧失劳动力的重要原因。解决长骨缺损、骨不连等需要大量具有良好符合人体生物学、生物力学特性的骨移植材料。为此,许多学者进行了相关的研究,取得了一些成绩,但是对于长骨缺损,仍然是运动系统疾病中的难题。随着近年来组织工程技术的兴起,骨缺损的修复研究进入组织工程的时代。目前的组织工程理论认为,种子细胞、支架材料、生长因子是组织工程的三要素。传统上一般选用骨髓间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞,但其面临诸多的局限性,包括手术病人抽取骨髓面临二次创伤,细胞数量受限,是否具备最佳的成骨能力等。比较而言,人软骨终板干细胞(Cartilage Endplate Stem Cells, CESCs)具有取材方便,不会给病人带来二次创伤,易于分离培养,体外增殖能力强,同时具有较强的成骨能力。而且CESCs作为其他非组织工程的种子细胞也具有广阔前景,许多研究证实CESCs具有成体干细胞特性,表现为较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能。由于临床上对骨移植材料的需求量巨大,同时组织工程技术的发展有望实现骨缺损的理想修复。但是分离原代培养的CESCs随着传代次数的提高,其活力越来越差,最终发生凋亡,难以存活,因此构建永生化人退变软骨终板干细胞系具有较强的实用价值,同时为研究人终板干细胞的生物学行为提供标准细胞系,为组织工程基础研究提供平台,为临床应用提供足量种子细胞,并为建立人退变软骨终板干细胞系提供一种有效、可靠的方法。
【发明内容】

[0003]本发明要解决的技术问题是为构建永生化人软骨终板干细胞系提供一种新选择。
[0004]本发明的技术方案是永生化人退变软骨终板干细胞系的制备方法,包括如下步骤:
[0005]将外源性猴肾病毒SV40T抗原基因转染人终板软骨干细胞而诱导获得永生化人终板软骨干细胞系;其中,外源性SV40T抗原基因通过构建成慢病毒颗粒转染人终板软骨干细胞;所述外源性SV40T抗原的核苷酸序列如序列21所示;包括如下步骤:
[0006]a、构建SV40T抗原病毒载体:将表达SV40T抗原基因的逆转录病毒载体和包装载体共转染人胚肾293细胞系HEK293,包装出表达SV40T抗原的逆转录病毒;
[0007]b、慢病毒转染:将人退变软骨终板原代干细胞传至第3代,使细胞密度为3 X IO3/ml,按0.5ml/cm2培养面积添加含4μ g/ml聚凝胺的逆转录病毒,病毒滴度为IX 108TU/ml,感染2天后,换液并添加2ml的0.4mg/ml的潮霉素B筛选14天,形成筛选后的干细胞集落;[0008]C、传代:将筛选后的干细胞集落扩增并进行连续传至30代以上,即得到永生化的人退变软骨终板干细胞系iCESCs,冻存备用。
[0009]其中,步骤b中的人退变软骨终板原代干细胞采用如下方法制备:将手术中遗弃的软骨终板标本,在无菌条件下去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织,得到透明状的软骨终板;机械-胶原酶法获取软骨终板原代细胞。
[0010]其中,步骤b中人退变软骨终板原代干细胞传至第3代的培养条件如下:培养基为90%DMEM/F12,含10%的FBS (胎牛血清),细胞长满接近培养皿80%后传代。
[0011]本发明还提供了由上述方法得到的永生化的人退变软骨终板干细胞系。
[0012]本发明还提供了由上述方法得到的永生化的人退变软骨终板干细胞系在制备骨组织工程材料中的用途。
[0013]本发明的有益效果:本发明方法提供一种永生化的人椎间盘软骨终板干细胞的制备方法。该方法得到的永生化干细胞与原代培养软骨终板干细胞具有相似的生物学特性,能向骨、软骨及脂肪等方向诱导分化,而且较骨髓间充质干细胞具有更强的成骨分化能力,且不具成瘤性。本发明提供了永生化人软骨终板干细胞的制备方法以及在骨组织工程中的应用,主要可应用于组织工程骨的制备,为临床上一系列长骨缺损、骨不连病人提供一种价格低廉、成骨能力强的骨组织工程的种子细胞。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1.琼脂糖悬浮培养筛选CESCs。A.接种于琼脂糖中的单个细胞。B.培养六周后的单细胞克隆(黑色箭头)和单个细胞(红色箭头)。C.单细胞克隆的龙胆紫染色。D.经扩增培养的CESCs。
[0015]图2包装的SV40T抗原慢病毒孔内可见病毒空斑。
[0016]图3转染后形成的单克隆细胞。
[0017]图4单克隆细胞扩大培养后。
[0018]图5iCESCs的干细胞标志物流式细胞术检测。A,B为细胞流式实验的结果。A图纵坐标是对应⑶标志物的荧光强度。浅色线是实验组,深色线是阴性对照组。
[0019]B图的横坐标是标志物的名称,横坐标下面的stem cell markers为干细胞标志物,Percentageof markers为标志物百分比。
[0020]图6iCESCs的体外成骨、成脂及成软骨诱导的组织学及分化相关基因表达的检测。A:正常培养基,茜素红染色,阴性;B:诱导成骨培养基,茜素红,阳性;C:PCR检测成骨相关基因表达情况;D:正常培养基,油红O染色,阴性;E:诱导成脂肪培养基,油红O染色,阳性;F:PCR检测成脂肪相关基因表达情况;G:成软骨诱导培养基,微球培养后成软骨情况:成软骨诱导培养基,微球培养后经阿尔新蓝染色;1:PCR检测成软骨相关基因情况;J:第三代iCESCs倒置显微镜图片;K:成软骨诱导培养基,微球培养后经阿尔新蓝染色后行石蜡包埋切片。
[0021]图7.A图为永生化后第I代。B图为永生化后第10代。C图为永生化后第30代。D图为永生化后第50代。
[0022]图8植入3个月后动物体内L2-L3横突间干细胞-羟基灰石复合物,箭头所示为BM-MSCs-羟基灰石复合物,三角所示为iCESCs-羟基灰石复合物。A:解剖标本,B:标本固定后O
[0023]图9通过Micro-CT分别选取BM-MSCs组和iCESCs组对应解剖位置的相同大小组织块。Micro-CT照片显示如图,图A为MSC成骨,图B为iCESC成骨。其中蓝色代表羟基灰石支架,橙黄色代表新生骨。
[0024]图1OBM-MSCs 组和 iCESCs 组的 TMD 值。(*:P<0.05)
【具体实施方式】
[0025]本发明永生化人终板软骨干细胞体系制备方法及体内植骨实验的实施例,通过目的基因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因慢病毒构建、转染SV40T抗原基因(SV40TAg),成功转然软骨终板干细胞稳定表达SV40T抗原基因,从而获得永生化软骨终板干细胞体系,并通过体内植骨实验证实其具有较强的成骨能力。
[0026]外源性SV40T抗原的核苷酸序列(SEQ ID N0.21):
【权利要求】
1.永生化人退变软骨终板干细胞系的制备方法,其特征在于:将外源性猴肾病毒SV40T抗原基因转染人终板软骨干细胞而诱导获得永生化人终板软骨干细胞系;其中,外源性SV40T抗原基因通过构建成慢病毒颗粒转染人终板软骨干细胞;所述外源性SV40T抗原的核苷酸序列如序列21所示;包括如下步骤: a、构建SV40T抗原病毒载体:将表达SV40T抗原基因的逆转录病毒载体和包装载体共转染人胚肾293细胞系HEK293,包装出表达SV40T抗原的逆转录病毒; b、慢病毒转染:将人退变软骨终板原代干细胞传至第3代,使细胞密度为3X103/ml,按0.5ml/cm2培养面积添加含4 μ g/ml聚凝胺的逆转录病毒,病毒滴度为I X 108TU/ml,感染2天后,换液并添加2ml的0.4mg/ml的潮霉素B筛选14天,形成筛选后的干细胞集落; C、传代:将筛选后的干细胞集落扩增并进行连续传至30代以上,即得到永生化的人退变软骨终板干细胞系,冻存备用。
2.如权利要求1所述的永生化人退变软骨终板干细胞系的制备方法,其特征在于:步骤b中的人退变软骨终板原代干细胞采用如下方法制备:将手术中遗弃的软骨终板标本,在无菌条件下去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织,得到透明状的软骨终板;机械-胶原酶法获取软骨终板原代细胞。
3.如权利要求1或2所述的永生化人退变软骨终板干细胞系的制备方法,其特征在于:步骤b中人退变软骨终板原代干细胞传至第3代的培养条件如下:培养基为90%DMEM/F12,含10%的胎牛血清,细胞长满接近培养皿80%后传代。
4.由权利要求1~3任一项所述的方法得到的永生化的人退变软骨终板干细胞系。
5.由权利要求1~3任一项所述的方法得到的永生化的人退变软骨终板干细胞系在制备骨组织工程材料中的用`途。
【文档编号】C12N15/867GK103865877SQ201410088040
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】黄博, 刘铭汉, 王海, 刘兰涛, 周跃 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院
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