菊酯类农药降解菌株及其菌剂和应用的制作方法

文档序号:471522
菊酯类农药降解菌株及其菌剂和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种菊酯类农药降解菌株,其为奇异变形杆菌(Proteus?mirabilis)JZB42C001,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC?No.8585。上述菌株来源于北京郊区农田土壤中。本发明还公开了一种包含上述菌株的菌剂以及其在降解残留菊酯方面的应用。该奇异变形杆菌JZB42C001对基础无机盐培养液中浓度为100mg/L的三氟氯氰菊酯降解率达71.6%;对于基础无机盐培养液中浓度为100mg/L的联苯菊酯降解率达到61.5%;对于基础无机盐培养液中浓度为100mg/L的高效氯氰菊酯降解率达到87.6%。
【专利说明】菊酯类农药降解菌株及其菌剂和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物降解农药残留领域,具体而言,涉及一种菊酯类农药降解菌株及其菌剂和应用。
【背景技术】
[0002]据报道我国农药土壤污染高达1.4亿亩,蔬菜、水果中农药残留超标问题成为制约我国农产品出口的贸易壁垒,急慢性中毒事件也时有发生。有机磷、菊酯、氨基甲酸酯、杂环类等农药的广泛、大剂量使用不仅严重影响农产品的食品安全和质量,也引起了土壤、地表水和地下水的污染。
[0003]菊酯类农药已成为我国出口的蔬菜、水果中主要农药残留之一,引起急慢性中毒事件也越来越多,对人类、水生生物和自然环境造成很大危险。据资料报道,2003年世界拟除虫菊酯杀虫剂的销售额为13.0亿美元,位列杀虫剂第二位。菊酯类农药有蓄积毒性,长期接触会引起慢性疾病,如能刺激乳腺癌细胞增殖和P52基因的表达,具有拟雌激素活性,而且对鱼类,蛘类等水生生物也有很高的毒性。
[0004]三氟氯氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂,广泛应用于农作物及家庭卫生害虫防除。三氟氯氰菊酯具有对光、热稳定的特点,在环境中半衰期较长,很难在自然条件下快速降解,加之长期频繁使用,有关其农药残留超标问题日趋严重,当前农产品质量与安全问题,越来越引起社会的广泛关注。
[0005]而以微生物为主体的生物修复技术可用于降解多种有机污染物,具有安全、高效、无二次污染、费用低等优点,是国际上残留农药处理技术研究的前沿和热点。有关菊酯类农药微生物降解的报道并不多。如研究表明假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、肠杆菌属(Ehterobacte sp.)、产喊杆菌属(Alcaligenes sp.)和芽抱杆菌属(Bacillus sp.)等对拟除虫菊酯类农药具有较好的降解作用。王兆守等从茶叶中分离到一株标号为clf6经鉴定为假单胞菌属的菌株可有效地降解联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯,降解率分别为55.645^44.56^^^152.19 %。许育新等分离得到的红球菌Rhodoco-ccus sp.CDT3和辛伟等分离到的蜡状芽孢杆菌BaciIluscereus TR2均可以降解氯氰菊酯。因此,开展拟除虫菊酯类农药微生物修复技术研究,筛选不同类型的三氟氯氰菊酯的高效降解微生物菌株,可为减低土壤或作物中三氟氯氰菊酯残留提供有效手段,为保障农产品安全和农田环境安全提供技术支持。
[0006]但是,目前的菌株普遍存在对三氟氯氰菊酯降解效率低的缺陷,而且利用微生物实现对农药进行降解,机理十分复杂,具有很强的针对性。目前未见变形杆菌属菌株降解拟除虫菊酯农药的报道。

【发明内容】

[0007]针对现有技术的缺陷,本发明的第一目的在于提供一种菊酯类农药降解菌株。
[0008]本发明的第二目的在于提供一种含有上述菌株的菌剂。[0009]本发明的第三目的在于提供上述菌株或菌剂的应用。
[0010]为了实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:
[0011]—种菊酯类农药降解菌株,其为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) JZB42C001,该菌株已于2013年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其简称为CGMCC,保藏号为CGMCC N0.8585,其保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号,中国科学院微生物研究所。
[0012]上述菌株来 源于北京通州区种植蔬菜的农田土壤中,经过富集、分离和纯化得到,其对菊酯类农药或杀虫剂有很强的降解作用。
[0013]上述菌株的特征如下:
[0014]I)形态学特征:该菌在固体培养基中,形态呈明显的多形性,可为杆状、球杆状、球形、丝状等,大小(0.4~0.6) μ mX (1.0~3.0) μ m,无荚膜,不形成芽孢,有周身鞭毛。
[0015]2)生理生化特征:革兰氏阴性,吲哚试验阴性,明胶液化、硫化氢、苯丙氨酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶阳性。麦芽糖发酵阴性,氧化酶阴性,水杨苷水解阴性,七叶苷水解阴性,乙酰甲基醇(VP)阴性,甲基红(MR)阳性。
[0016]3)上述菌株的16S rDNA鉴定:
[0017]PCR扩增奇异变形杆菌JZB42C001菌株16S rDNA约1.5kb,测序结果显示具有序列表中SEQ ID N0.1的核苷酸序列,将其用BLAST软件与GenBank中的序列进行同源性比对,发现该菌与奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的同源性最高,达到99%。
[0018]本发明参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠,蔡妙英)变形杆菌属特征,并结合上述形态特征、生理生化特征和16SrDNA基因序列相似性,将本发明菌株JZB42C001鉴定为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)。
[0019]本发明奇异变形杆菌JZB42C001在好氧条件下可以利用菊酯作为唯一碳源,该菌可在普通固/液培养基或LB固/液培养基上生长,也可在含有菊酯浓度为I~100mg/L的基础无机盐液体培养基中培养,生长温度为25~30°C,pH为7~8,最适生长温度为30°C,最适pH为7。
[0020]一种含有上述菌株的菌剂,优选地,该菌剂是通过以下方法获得的:将纯化后的奇异变形杆菌JZB42C001接种于普通液体培养基或LB液体培养基中,在25~30°C、180r/min条件下培养24~48h,然后在4~5°C条件下离心8~12min以收集沉淀物菌体,用0.1mol/L的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液洗涤菌体,再用0.lmol/L的Na2HPO4~KH2PO4缓冲液将菌体稀释成菌体悬浊液,所述菌体悬浊液即菌剂,更优选地,所述菌剂中奇异变形杆菌JZB42C001的浓度为1.0X IO7CFU.mr1。其中,所述0.lmol/L的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液的配制如下:按体积比为61:39量取0.2mol/L的Na2HPO4和0.2mol/L的NaH2PO4,混合均匀后调整ρΗ=7.0,得到0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4缓冲液;然后用蒸馏水将0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4缓冲液稀释成 0.1moI/LNa2HPO4-KH2PO4 缓冲液。
[0021]上述菌株在降解残留菊酯方面的应用。
[0022]上述菌剂在降解残留菊酯方面的应用。
[0023]在上述菌剂的应用中,作为一种优选实施方式,所述菌剂在降解残留菊酯方面的应用具体方法为:将菌剂均匀喷洒于被处理物表面,其中菌剂使用浓度为0.5-5.0X 107CFU/g,所述菌剂在25~30°C条件下于所述被处理物表面停留1_10天,更优选停留4-6天。
[0024]所述菊酯优选选自三氟氯氰菊酯、联苯菊酯和高效氯氰菊酯中的一种或多种。
[0025]本发明的有益效果:该奇异变形杆菌JZB42C001对土壤、水果、蔬菜或水体中残留的菊酯降解效果好,对于基础无机盐培养液中浓度为100mg/L的三氟氯氰菊酯,采用本发明菌株处理5天后降解率达到71.6% ;对于基础无机盐培养液中浓度为100mg/L的联苯菊酯,采用本发明菌株处理5天后降解率达到61.5% ;对于基础无机盐培养液中浓度为IOOmg/L的高效氯氰菊酯 ,采用本发明菌株处理5天后降解率达到87.6%。
【专利附图】

【附图说明】
[0026]图1为奇异变形杆菌JZB42C001菌株在三氟氯氰菊酯浓度为100mg/L的无机盐培养液中、不同培养时间内菌株的生长情况以及对三氟氯氰菊酯的降解效果;
[0027]图2为在三氟氯氰菊酯不同初始浓度下,菌株对三氟氯氰菊酯的降解曲线。
[0028]图3为本发明奇异变形杆菌JZB42C001的电镜扫描照片。
【具体实施方式】
[0029]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将采用实施例的方式对本发明进行详细说明。
[0030]本发明中使用的各种培养基均采用常规方法配制,实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法,均参照SambrookJ等主编,科学出版社,2002,分子克隆实验指南(第三版)。
[0031]本发明中使用的各种培养基的配制方法如下:
[0032]富集培养基:蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g,蒸懼水补至1000mL,调pH至7.0,高压灭菌20min。
[0033]普通固体培养基:蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g,琼脂15g、蒸懼水补至1000mL,调pH至7.0,高压灭菌20min,然后倒平板。
[0034]普通液体培养基:蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g,蒸懼水补至1000mL,调pH至
7.0,高压灭菌20min。
[0035]基础无机盐培养基:lgΝΗ4Ν03、0.5g MgSO4.7Η20、0.5g(NH4)2S04、0.5g ΚΗ2Ρ04、0.5gNaCl> 1.5g K2HPO4、蒸懼水补至1L,调pH至7.0,高压灭菌20min。
[0036]分离培养基:lgNH4NO3^0.5g MgSO4.7Η20、0.5g(NH4)2S04、0.5gKH2P04、0.5g NaCl、
1.5g K2HPO4> 15g琼脂、蒸懼水补至1L,调pH至?.0,高压灭菌20min,然后倒平板。
[0037]LB液体培养基:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g,蒸馏水补至1L,调pH至
7.0,高压灭菌20min。
[0038]LB固体培养基:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC110g,15g琼脂、蒸馏水补至1L,调pH至7.0,高压灭菌20min,然后倒平板。
[0039]0.lmol/L Na2HPO4-KH2PO4 缓冲液(ρΗ=7.0)的配制依次如下:
[0040]1)0.2mol/L Na2HPO4 的配制:取 71.6g Na2HPO4-12H20 溶于 1000mL 蒸馏水;
[0041]2) 0.2mol/L NaH2PO4 的配制:取 31.2g NaH2P04_2H20 溶于 1000mL 蒸馏水;
[0042]3) 0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4 缓冲液(ρΗ=7.0)的配制:取 0.2moI/LNa2HPO4 溶液61mL、0.2mol/L NaH2PO4溶液39mL,将二者混合均匀,调节pH至7.0 ;
[0043]4)取 0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4 缓冲液(ρΗ=7.0) 50mL,然后用蒸馏水稀释为 IOOmL即成为 0.1moI/LNa2HPO4-KH2PO4 缓冲液(pH=7.0)。
[0044]实施例1:奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) JZB42C001的分离、纯化
[0045]将来源于北京郊区且施用过三氟氯氰菊酯的菜田土壤样品分成2份,每份10g,在无菌操作条件下,分别加到IOOmL含有三氟氯氰菊酯的富集培养基中(其中,三氟氯氰菊酯在富集培养基中的浓度为50mg/L),在30°C下180r/min的摇床上培养7d ;之后按10%的接种量(本实施例中“10%的接种量”是指接种液与被接种培养基的体积比)将其转接到下一批含有三氟氯氰菊酯的富集培养基(其中,该批富集培养基中,三氟氯氰菊酯的浓度为100mg/L)中,继续培养7d ;之后再按10%的接种量转接到含三氟氯氰菊酯的富集培养基(三氟氯氰菊酯在富集培养基中的浓度为200mg/L)中,再培养7d ;接着按10%的接种量转接到含三氟氯氰菊酯的基础无机盐培养基(三氟氯氰菊酯在基础无机盐培养基浓度为250mg/L)中,继续培养7d ;再按10%的接种量转接到含三氟氯氰菊酯的基础无机盐培养基(三氟氯氰菊酯在基础无机盐培养基浓度为250mg/L)中,继续培养7d ;然后从两份培养液中各取0.1mL分别转接到各自的平板上,涂布平板,置于30°C恒温培养箱中培养48h,选取不同形态特征的单菌落接种于含三氟氯氰菊酯的分离培养基(三氟氯氰菊酯在分离培养基中的浓度为250mg/L)上,采用平板划线法分别进行3次分离纯化。纯化后选取平板上长势较好的单菌落菌株进行编号,其中一株定名为JZB42C001,将其保藏于具有普通固体培养基的斜面试管中。[0046]实施例2:奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) JZB42C001 的 16S rDNA 鉴定
[0047]1、PCR模板的获取:其包括两种方法,一种是提取基因组DNA以将其作为PCR模板,另一种是直接热处理菌液以将热处理后的菌液作为PCR模板。下面对两种方法均做一介绍。
[0048]I)提取基因组DNA,采用溶菌酶加10%SDS法,具体如下:
[0049](a)将纯化后的该菌接种于LB液体培养基中,在28°C条件下180r/min的摇床上培养24h,然后取新鲜培养菌液2ml,12000rpm,离心l_2min,弃去上清;
[0050](b)再向沉淀物中加入lmL、lXTE(pH8.0)buffer混匀洗漆,12000rpm,离心l-2min,弃去上清;
[0051](c)再向沉淀物中加入400 μ L、5XTE(pH8.0)buffer混匀洗漆,12000rpm,离心l-2min,弃去上清;
[0052](d)再向沉淀物中加入50μ L、20mg/ml溶菌酶溶液,37°C水浴30_60min ;
[0053](e)加入 50μ LU0wt%SDS,20y L 蛋白酶(20mg/ml),55°C水浴 60min ;
[0054](f)加入500yL酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1)混匀,12000rpm,离心IOmin ;
[0055](g)取上清液转入新离心管中,加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1),混匀,12000rpm,离心 IOmin ;
[0056](h)取上清液转入新离心管中(1.5ml),加入2倍上清液体积的无水乙醇,轻混匀直至 DNA 沉淀,12000rpm,离心 IOmin ;
[0057](i)弃去上清液,70%乙醇洗漆,12000rpm,离心10min ;[0058](j)弃去上清液,操作台晾干,至DNA透明;
[0059](k)加入50 μ L灭菌水,0.5 μ L RNase,混匀,_20°C冰箱保存,备用。
[0060]2)直接热处理获得PCR模板,具体如下:将纯化后的该菌种接种于LB固体培养基上,28°C培养24h,然后用无菌枪头蘸取少量菌体,混匀在100 μ LddH2O中,沸水处理2min后12000rpm离心5min,上清液即为PCR扩增模板。本实施例采用了该方法获得PCR模板。
[0061]2、PCR
[0062]PCR 引物采用 16S rDNA 通用引物 27F(5' -GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3/,即序列表中 SEQ ID N0.2)和 1492R (5' -ACG GAT ACC TTG TTA CGA CTT-3',即序列表中 SEQ ID N0.3)。
[0063]PCR 反应体系 25μ L:2XTaq PCR Mixl2.5 μ L,引物 27F1 μ L,引物 1492R1 μ L,ddH208.5 μ L,DNA 模板 2 μ L。
[0064]PCR 程序:94°C 5min ;94°C 40s, 55°C 40s, 72°C 90s, 30 个循环;72°C IOmin0
[0065]PCR结束后采用1%琼脂糖凝胶电泳,PCR产物为1.5kb,经纯化回收后连接到T载体上克隆,经蓝白筛选后提取质粒,将其送至中美泰和生物技术(北京)有限公司测序,测序结果显示具有序列表中SEQ ID N0.1的核苷酸序列,将其用DNAMAN version5.2.2和BLAST软件与GenBank中的序列进行同源性比对,发现该菌与奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)的同源性最高,达到99%。
[0066]实施例3:奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)JZB42C001菌株形态特征及生理生化特征测定
[0067]将纯化后的菌株JZB42C001接种在LB固体培养基上,28°C培养48h后电镜观察菌株形态特征,取纯化的菌株生长的对数期进行革兰氏、荚膜等染色,生理生化特征测定参照《常见细菌系统鉴定手册》。其结果为:该菌形态呈明显的多形性,参见图3,可为杆状、球杆状、球形、丝状等,大小(0.4~0.6) μ mX (1.0~3.0) μ m,无荚膜,不形成芽孢,有周身鞭毛,革兰氏阴性,吲哚试验阴性,明胶液化阳性,硫化氢阳性,其他生理生化特性见表1。
[0068]表1菌株JZB42C001的生理生化特性
[0069]
【权利要求】
1.一种菊酯类农药降解菌株,该菌株为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)JZB42C001,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCCN0.8585。
2.一种含有权利要求1所述菌株的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂,其特征在于,该菌剂是通过以下方法获得的:将纯化后的奇异变形杆菌JZB42C001接种于普通液体培养基或LB液体培养基中,在25~30°C、180r/min条件下培养24~48h,然后在4~5°C条件下离心8~12min以收集沉淀物菌体,用0.lmol/L的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液洗涤菌体,再用0.lmol/L的Na2HPO4~KH2PO4缓冲液将菌体稀释成菌体悬浊液,所述菌体悬浊液即为所述菌剂;其中,所述0.lmol/L的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液的配制如下:按体积比为61:39量取0.2mol/L的Na2HPO4和0.2mol/L的NaH2PO4,混合均匀后调整pH=7.0,得到0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4缓冲液;然后用蒸馏水将 0.2moI/LNa2HPO4-KH2PO4 缓冲液稀释成 0.1moVLNa2HPO4-KH2PO4 缓冲液。
4.根据权利要求3所述的菌剂,其特征在于,所述菌剂中奇异变形杆菌JZB42C001的浓度为 1.0XlO7CFU.mL'
5.权利要求1所述菌株在降解残留菊酯方面的应用。
6.权利要求2-4任一所述菌剂在降解残留菊酯方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述应用的具体方法如下:将菌剂均匀喷洒于被处理物表面,其中菌剂使用浓度为0.5-5.0X107CFU/g,所述菌剂在25~30°C条件下于所述被处理物表面停留1-10天。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述菌剂在所述被处理物表面停留4-6天。
9.权利要求5-8任一所述的应用,其特征在于,所述菊酯选自三氟氯氰菊酯、联苯菊酯和高效氯氰菊酯中的一种或多种。
【文档编号】C12R1/37GK103911319SQ201410088205
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】陈莉, 李文华, 贾春红, 卢彩鸽, 余苹中, 朱晓丹, 赵尔成, 贺敏 申请人:北京市农林科学院
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