一种检测多子小瓜子的引物、试剂盒及其方法
【专利摘要】本发明提出了一种检测多子小瓜子的引物、试剂盒及其方法。所述引物序列为由SEQ?ID?NO:1-4的4条序列组成。本发明还保护其试剂盒和方法。应用此引物进行LAMP快速检测，具有灵敏度高，特异性强，检测时间短，1小时左右可获得检测结果，比普通PCR检测缩短2～4h。操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，一般技术人员即可完成检测，结果容易辨别，通过不同颜色，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察，安全。
【专利说明】—种检测多子小瓜子的引物、试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】。更具体的涉及一种检测多子小瓜子的引物、试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002]寄生于淡水鱼类的多子小瓜虫属于原生动物门(Portozea),纤毛纲(Ciliata),膜口目(Holotricha),凹口科(Ophryoglenidae),小瓜虫属{Ichthyophthirius)。目前仅多子小瓜虫一种(/.小瓜虫分布在热带、亚热带和温带地区，向北可以一直延伸到北极圈。
[0003]PCR检测技术是根据生物体的特异的基因片段，对生物体进行检测鉴定的技术。该方法已经在人类和动植物的病原检测中广泛应用，具有特异性强、灵敏度高、方便快捷的诸多优点。Sun等(2006)报告了应用特异引物对扩增多子小瓜虫部分ITS-1序列，完整5.8SrDNA序列，以及部分ITS-2序列的PCR方法。该方法使用的正向引物序列为5’ -GTA CTTTAT TTA GGA GGA GGA CT-3’，反向引物序列为 5’ -TGT TTA ACG AGA GAA AAT CAT AAAT-3’，能特异性扩增326 bp左右的目标片段，结合产物测序，可以对多子小瓜虫进行准确的鉴定。
[0004]实时荧光PCR方法因减少了污染环节，PCR检测和结果判定一步完成，比普通PCR更灵敏和快捷，还适合高通量检测，因此在病原检测领域取得了广泛应用。Olivier(2005)报道了 SYBR Green荧光PCR法检测游离在水体中的多子小瓜虫的检测技术。该方法以多子小瓜虫18 S rDNA基因中位于455-647碱基之间的序列设计引物頂RH5’ -AGTGACAAGAAATAGCAAGCCAGGAG-3’ 和 MRrl 5’ -ACCCAGCTAAATAGGCAGAAGTTCAA-3’，不仅可以对多子小瓜虫的感染进行定量分析，还可以在避免损伤鱼体的情况下达到检测的目的。
[0005]以PCR为基础的分子鉴定方法克服了传统形态鉴定上的缺陷，但在应用过程中人们发现PCR技术存在一些不足，如靶基因易被污染，可能引起非特异性扩增，多种因素可以产生抑制扩增反应，扩增反应时间较长，一般需要几小时，需要比较昂贵的PCR仪，不利于在基层实验室推广应用等。2000年，日本学者Notomi等(Loop-mediated isothermalamplification of DNA [J].Nucleic Acids Research, 2000, 28:E63)建立了一种新的
核酸扩增方法-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)
技术，LAMP技术是采用针对靶基因的6个特异部位设定的4条特异性引物(内引物:FIP由FlC和F2组成；BIP由BIC和B2组成，外引物:F3、B3)及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在60-65°C恒温条件下对核酸进行扩增，短时间扩增效率可达到IO9-1Oki个拷贝。该技术克服了 PCR技术的一些缺点。目前已在人类及动植物细菌、病毒、寄生虫、真菌等的检测中取得重要进展，在疫病诊断领域显示出广阔的应用前景。
[0006]多子小瓜虫目前的检测诊断方法有形态学检测方法，普通PCR检测方法，和荧光PCR检测方法三种。上述这三种检测诊断方法分别需使用到光学显微镜、普通PCR仪、荧光PCR仪、电脑等较精密的仪器设备。这些仪器设备不仅价值较高，而且其存放和使用对环境要求较高，不适宜于在水产养殖环境中安置和应用。同时，普通PCR检测方法和荧光PCR检测方法，检测流程较复杂，达不到快速检测诊断的目的。目前，在国内外除开发有适宜于实验室环境检测诊断多子小瓜虫的普通PCR和荧光PCR技术方法外，尚未开发出更快速简便的，适宜于水产养殖等粗放的环境中的多子小瓜虫检测诊断技术。
[0007]
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种更简便，且结果准确的检测多子小瓜子的方法。
[0009]为实现上述目的，本发明提供一种用于检测多子小瓜子的引物，其特征在于，所述引物序列为由SEQ ID NO: 1-4的4条序列组成。
[0010]一种用于检测多子小瓜子的试剂盒，其特征在于，包括所述的引物。
[0011]一种用于检测多子小瓜子的方法，其特征在于，所述方法应用了所述引物或者所述试剂盒。
[0012]所述方法，包括如下步骤，
提取DNA模板；
LAMP PCR扩增:应用权利要求1的引物或者权利要求2的试剂盒进行扩增； 结果判断。
[0013]所述提取DNA模板可以从鱼鳍、鱼鳃、鱼体表刮取物、饲养水体离心收集沉淀等物中提取。
[0014]所述的LAMP PCR 扩增体系为，SEQ ID NO: 1-2 的序列各 0.8 μ mol/L, SEQ IDNO: 3-4 的序列各 0.2 μ mol/L, I U DNA 模板，1.2 mmol/L dNTP, I mol/L 甜菜喊，8U BsmDNA聚合酶，IXBsm buffer,加灭菌双蒸懼水补全到25 μ I。
[0015]所述的LAMP PCR扩增程序为，95°C保温5 min，60 °C保温I h，80 °C保温5 min。
[0016]所述的结果判断为加入显色剂，轻晃混匀，反应液呈浅黄色的为阳性结果，反应液呈橙黄色的为阴性结果。
[0017]所述显色剂为SYBR green I。
[0018]虽然LAMP技术是一项公开的技术方法，但是其具体效用必须通过研究人员，经过自身的创造性思维，学术造诣，研究开发，反复试验等过程，研究建立出创新的，具有科研价值的研究成果，才能使LAMP技术在具体的，特定的领域发挥作用。否则即便人们熟悉LAMP技术，但是依然无法达到检测鉴定生物体的目的，无法解决实际问题。
[0019]本发明的创新点，不在LAMP技术本身，而在于研究开发者通过何种手段，将LAMP技术转变为可以用来检测多子小瓜虫的检测诊断方法，以填补多子小瓜虫现场检测诊断领域的空白。目前，国内外的研究者，均以建立快速、准确的检测诊断手段为目标。一项快速、准确的检测诊断手段的研发和建立需要研究者的不断探索和努力，也能够创造巨大的社会价值和经济价值。所以本发明是以LAMP技术为基本原理，在此基础上开发创造出其他研究者未能实现的，多条新的引物，从而实现了 LAMP方法到检测诊断多子小瓜虫LAMP技术的质的飞跃。如果没有发明人创造性的开发出特殊的引物，LAMP技术只能是一个概念，不能发挥任何价值。[0020]本发明所提供的多子小瓜虫LAMP快速检测方法具有以下优点:
一、灵敏度高，对多子小瓜虫的检测极限可达到I条幼虫水平。
[0021]二、特异性强，所用的特异引物为根据多子小瓜虫的18S rDNA六个不同区域设计出的4条引物，增强了反应的特异性。
[0022]三、检测时间短，I小时左右可获得检测结果，比普通PCR检测缩短24h。
[0023]四、不需要PCR仪，对仪器设备要求低，不需要任何PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅或者保温瓶就可以完成检测。
[0024]五、操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，一般技术人员即可完成检测，结果容易辨别，通过不同颜色，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察。
[0025]六、检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。[0026]综上所述，本发明具有比现有PCR技术检测多子小瓜虫的方法具有更高的特异性、灵敏度和便携性。可以在实际生产中现场应用检测。
[0027]从实施例所得的图1可以看出，结果清晰可辨，简单明了。
[0028]
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1是加荧光染料检测结果图。
【具体实施方式】
[0030]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0031]实施例1:多子小瓜子的检测
DDNA提取:取待测鱼体表刮取物作为样本，按DNA试剂盒方法提取方法或经典的DNA酚氯仿提取法提取DNA作为LAMP检测的DNA模板。已知感染多子小瓜虫的鱼体表刮取物的DNA作为阳性对照，已知健康的鱼体表刮取物的DNA作为阴性对照。
[0032]2)引物设计
多子小瓜虫LAMP引物设计
根据多子小瓜虫18S rDNA (序列号Sequence ID: gb | DQ270016.1 )测序结果为模板，设计以下4条引物，序列如下:
3XGCF3:5，-GAT TAT GTC CCT GCC GTT-3’序列 SEQ ID NO:1
3XGCB3:5，-TCC TCC TCC TAA ATA AAG TAC A_3’序列 SEQ ID NO:2
3XGCFIB: 5’-ACT TOC CM AGC CTT GCG AOC OGT OGC HG TAG TM OG-3，序列SEQ ID NO:33XGCBIP: 5’-AAG TM ACC CTA CCA TTT GGA ACA TTG TGT TAA TGA TCC ATC TGC-3’序列SEQ ID NO:4 (引物合成:厦门精聚科技有限公司)
3) LAMP检测LAMP反应体系配置:引物3XGCF3和3XGCB3各0.8 μ mol/L，引物3XGCFIB和
3XGCBIP 各 0.2 μ mol/L, 1.2 mmol/L dNTP, I mol/L 甜菜碱，8U Bsm DNA 聚合酶，IXBsmbuffer (美国 Thermo 公司)。
[0033]LAMP反应扩增条件:将引物、dNTP、甜菜碱、Bsm buffer、Bsm DNA聚合酶，和I UDNA模板(即步骤I)所得)按比例混合后，95°C保温5 min, 60 °C保温I h，80 °C保温5 min。
[0034]LAMP结果检测:
将上述反应完的体系中加入I μ I的显色剂SYBR green I。轻晃混匀，即可观察,结果见图1。其中I为阳性结果，反应液呈浅黄色，与阳性对照的结果相同。2为阴性结果(阴性对照)，反应液呈橙黄色。
[0035]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范 围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【权利要求】
1.一种用于检测多子小瓜子的引物，其特征在于，所述引物序列为由SEQ ID N0:l-4的4条序列组成。
2.一种用于检测多子小瓜子的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。
3.一种用于检测多子小瓜子的方法，其特征在于，所述方法应用了权利要求1的引物或者权利要求2的试剂盒。
4.权利要求3的检测多子小瓜子的方法，其特征在于，包括如下步骤， 提取DNA模板； LAMP PCR扩增:应用权利要求1的引物或者权利要求2的试剂盒进行扩增； 结果判断。
5.权利要求4的检测多子小瓜子的方法，其特征在于，所述提取DNA模板可以从鱼鳍、鱼鳃、鱼体表刮取物、饲养水体离心收集沉淀等物中提取。
6.权利要求4的检测多子小瓜子的方法，其特征在于，所述的LAMPPCR扩增体系为，SEQ ID NO: 1-2 的序列各 0.8 μ mol/L, SEQ ID NO: 3-4 的序列各 0.2 μ mol/L, I U DNA模板，1.2 mmol/L dNTP, I mol/L 甜菜喊，8U Bsm DNA 聚合酶，IX Bsm buffer,加灭菌双蒸馏水补全到25 μ I。
7.权利要求4的检测多子小瓜子的方法，其特征在于，所述的LAMPPCR扩增程序为，95°C 保温 5 min ,60 °C 保温 I h，80 °C 保温 5 min。
8.权利要求4的检测多`子小瓜子的方法，其特征在于，所述的结果判断为加入显色剂，轻晃混匀，反应液呈浅黄色的为阳性结果，反应液呈橙黄色的为阴性结果。
9.权利要求8的检测多子小瓜子的方法，其特征在于，所述显色剂为SYBRgreen I。
【文档编号】C12Q1/68GK103866020SQ201410090981
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】郭书林 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心