提取结核杆菌dna的方法及检测其多重耐药性的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取结核杆菌DNA的方法以及快速准确检测结核分枝杆菌多重耐药性（multiple?drug?resistence，MDR）的试剂盒。该方法包括从由临床样本提取待检DNA，应用荧光实时定量PCR确定结核分枝杆菌感染、鉴别是否为耐药性及何种耐药性菌株感染，最终确定病原体感染数量。本发明方法可以检测目前已确定可引起结核菌耐药（包括利福平、异烟肼和乙胺丁醇）的全部耐药基因共29个位点，是迄今为止囊括结核耐药基因最全面的快速分子诊断系统。另外通过独特的引物、探针和选择荧光染料标记设计，实现应用多重qPCR检测上述全部耐药基因位点，得到应用简便快速、结果准确可靠，对于快速诊断结核菌感染、确定耐药性从而进行有针对性的治疗具有巨大的实用价值和广阔的应用前景。
【专利说明】提取结核杆菌DNA的方法及检测其多重耐药性的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学检测【技术领域】，尤其是涉及一种提取结核杆菌DNA的方法及快速准确检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒。
【背景技术】
[0002]结核病仍是一个全球性的问题。目前全球约有20亿人被感染，每年新出现结核病患者约800万~1000万,每年因结核病死亡人数约200万~300万，结核病已成为21世纪严重危及人类健康的疾病之一。中国也是结核病发生比较严重的国家之一，有接近一半的人口已经感染了结核病病菌，目前有结核病人500万，每年新增患者150万。
[0003]虽然结核病已经不是过去那种能够让人“十痨九死”的瘟神了，但近20年来结核病在世界范围内出现暴发流行，出现“复燃“，其主要原因是耐药结核病的产生。WH02008年报道显示，全球结核病总耐药率为20.0%，耐多药率为5.3%每年新出现耐多药结核病患者约50万人，广泛耐药结核病(XDR-TB)患者5万人。随着世界范围内的旅行和人口流动的增加，耐药性肺结核病例过去20年来一直呈上升态势，严重地威胁着结核病控制工作已取得的进展。
[0004]耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关。药物靶基因一个或几个核苷酸突变(增加、缺失、替代)，造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列，影响药物与靶位酶结合而产生耐药。因一个基因突变而产生的耐药为单基因型耐药，因多基因型突变而产生的耐药为多基因耐药；对多种药物发生耐药是结核分枝杆菌的不同靶位基因相继发生突变造成的。
[0005]与病毒性传染病如艾滋和肝炎病不同，目前已有多种有效抗结核药物。因此，有效控制结核病的关键在于研发出快速、可靠的耐药结核病检测技术。因为只有快速、准确地检测出病人是否为耐药结核病及对何种药物耐药，病人才能得以及时而且合理的治疗，从而有效地控制住结核病传播。而目前因临床所使用的药敏试验耗时长(6-8周)、费力，病人的病情得不到及时的合理化治疗，根本无法满足目前结核病防治的需要。
[0006]结核病致病原是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, TB)。它是一类单细胞，需氧，革兰氏阳性菌。典型的分枝杆菌通常有一个较厚的、疏水性的细胞壁，缺乏细胞外膜。结核分枝杆菌感染的特殊性给结核病的诊断和有效治疗带来很大的困难，主要表现在:(I)结核菌感染后可能表现出症状，如慢性咳嗽(典型的会痰中带血)，发热，夜间盗汗，疲劳乏力，脸色苍白，消瘦等，但也可能是潜在的和完全无症状。这时应用传统的检测方法常无法诊断或造成假阴性(漏诊)；(2)结核病感染的常规诊断通常依赖于身体检查和实验室检查。身体检查往往仅在结核活动期或感染后期才能发现症状。结核菌素皮试和抗酸性染色方法的特异性不强。肺组织活检，胸腔穿刺术等创伤性检测方法对机体损害较大。最广泛采用的痰液涂片、显微镜下检查确诊结核病检出率很低。而细胞培养的方式由于结核分枝杆菌的特殊结构、生长特性以及在感染个体体内的滴度通常较低等特点，需要较长的细菌培养周期，从临床标本培养结核菌通常需要四到八周之间。在此期间，病人可能病情加重或传染给他人。这使作为传统意义上结核诊断金标准的细胞培养方法在实际操作上存在巨大的局限性，难以有效控制病情发展和传播；(3)更重要的是耐药及多重耐药菌的出现使对结核病的治疗雪上加霜。结核杆菌耐药菌株的出现是基因突变和自然选择的结果。但在实际操作中其根本原因就是由于对耐药性检验不力，对患者感染结核菌耐药性不了解，造成无法选择正确有效的治疗药物。而这基本相当于一个人工选择耐药性结核菌感染的过程，其结果是造成更严重、更难治的耐药菌感染，同时促进了新的耐药菌种的出现和传播。因此可以说，在没有结核菌耐药监测前提下的抗生素治疗，适得其反，弊大于利。
[0007]针对上述问题，对结核病及耐药与多重耐药菌株的快速分子诊断方法是目前结核病防治的关键。分子诊断方法快速，灵敏度高、特异性好、结果准确，非常适于对结核病及耐药与多重耐药病的诊断。荧光定量PCR是目前临床最重要的分子诊断技术。由于其快速，灵敏度高、结果准确，已被广泛地应用到艾滋病，肝炎，和HPV等传染病诊断与普查。但在结核病及耐药与多重耐药分子诊断尚未广泛开展起来。这主要存在以下几个问题:
[0008](1)检验内容有限:目前的方法常仅限于测试是否有结核菌感染，或集中于测试是否为耐利福平耐药，结果非常局限而不够全面。比如美国食品药品管理局(FDA)近年批准的首个用来检测结核菌耐药性的分子诊断试剂盒就是用于检测利福平耐药性的，称为XpertMTB/RIF。诚然，利福平是很重要的结核一线抗生素，但对其它药物耐药和多重结核耐药菌根本无法检测。而常规结核病抗生素治疗一个公认的基本原则就是复合用药。而且单一抗生素用药是造成结核菌产生耐药的重要原因之一。如果仅知道利福平的耐药信息对指导治疗的实用价值是有限的。近年来耐药与多重耐药结核菌感染甚至爆发的出现要求有更先进的方法，全面检测结核感染的耐药信息。
[0009](2)目前市场上基于荧光定量PCR检测的方法多数每个反应仅作单突变点检测。这样或者限制了可以检测突变点的数量，或者试剂过多、操作复杂费时，在实际临床实践中受到制约。多重荧光定量PCR的应用不仅能够检测所有结核菌耐药与多重耐药，而且，大大简化了实验方法。
[0010](3)对于样本的DNA提取缺乏规范有效的方法。结核杆菌DNA的提取一直是困扰结核病分子诊断发展的一个技术难题。
[0011]因此，开发一项崭新的，适合临床结核病防治的荧光定量PCR检测方法是当前急待解决的问题。该方法应该不仅提供从结核菌DNA提取到最终获得结核菌感染与否，耐药与多重耐药与否全部信息，而且要能准确可靠，快速、简便地应用于临床实验室。
【发明内容】
[0012]本发明提供一种提取结核杆菌DNA的方法，以解决现有技术中的DNA提取困难，费时费力等问题。
[0013]本发明提供一种快速准确检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒，以准确可靠，快速、简便地检测结核杆菌耐药性及多重耐药性。
[0014]本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:
[0015]从痰液中提取结核杆菌DNA的方法，包括以下步骤:
[0016]a)、碱处理，将生物样本(痰液)加入NaOH溶液内液化处理；
[0017]b)、一次离心，将上述液化后的生物样本置入离心机内离心，弃上清液；
[0018]c)、Tris缓冲液洗漆沉淀,弃去上清液；[0019]d)、加入DNA提取液，沸水浴5-15分钟；
[0020]e)、二次离心，将上步所得液体置于离心机内离心，收集上清液，即得结核杆菌DNA。
[0021]作为优选的技术方案，所述碱处理中的NaOH溶液的浓度为4%，碱处理的温度为37 °C,碱处理的时间为30分钟。
[0022]作为优选的技术方案，所述一次离心和二次离心的转速均为12000转，时长为10分钟。
[0023]作为优选的技术方案，所述DNA提取液包括以下浓度的组分:
[0024]
【权利要求】
1.提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤: a)、碱处理，将生物样本(痰液)加入NaOH溶液内液化处理； b)、一次离心，将上述液化后的生物样本置入离心机内离心，弃上清液； c)、Tris缓冲液洗漆沉淀,弃去上清液； d)、加入DNA提取液，沸水浴5-15分钟； e)、二次离心，将上步所得液体置于离心机内离心，收集上清液，即得结核杆菌DNA。
2.根据权利要求1所述的提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，所述碱处理中的NaOH溶液的浓度为4%，碱处理的温度为37°C，碱处理的时间为30分钟。
3.根据权利要求1所述的提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，所述一次离心和二次离心的转速均为12000转，时长为10分钟。
4.根据权利要求1所述的提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，所述DNA提取液包括以下浓度的组分:
5.一种检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒，其特征在于，包括:痰液样本液化剂、DNA提取液、qPCR反应液、多重耐药基因检测引物、核苷酸探针、各耐药基因野生型及各耐药基因变异型序列检测标准品； 所述多重耐药基因检测引物的DNA序列为SEQ ID Nos:1_79 ； 所述核苷酸探针的序列为SEQ ID Nos:80-92 ； 所述各耐药基因野生型及各耐药基因变异型序列检测标准品的序列为SEQ ID Nos:93-138。
6.根据权利要求5所述的一种检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒，其特征在于，所述痰液样本液化剂为浓度为4%的NaOH溶液。
7.根据权利要求5所述的一种检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液包括以下浓度的组分:
【文档编号】C12Q1/68GK103911365SQ201410093113
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】李沛祥 申请人:南京爱必梦生物材料有限公司