一种基于ssr标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法
【专利摘要】本发明提出的是一种水稻指纹图谱的构建方法。具体的方法包括提取水稻基因组DNA，筛选多态性好的SSR荧光引物，对水稻品种的DNA进行PCR扩增，利用毛细管凝胶电泳检测PCR产物，通过数据分析获得0-1矩阵图，并将0-1矩阵图转化为指纹模式图谱。本发明应用SSR的多态性与毛细管凝胶电泳技术高分辨率的特性，不仅可以分辨出条带大小相差1bp的多态性条带，且易于自动化，操作简单，结果稳定可靠，易于大规模、多批次的数据整合与分析，适用于大量水稻品种指纹图谱的构建。
【专利说明】—种基于SSR标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物信息【技术领域】，具体涉及的是一种基于SSR荧光标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法。
【背景技术】
[0002]水稻是我国主要粮食作物之一，也是我国植物新品种保护条例涵盖的第一批保护作物之一。水稻种苗的真实性是衡量种苗质量的重要指标，直接影响水稻的产量、品质和经济效益。当前我国水稻种子和种苗存在纯度低、品质混杂、以次充好的现象，各级农作物品种审定机构和种子种苗生产部门对水稻品种伪劣鉴定日益重视，但是，水稻种子资源形态特征较为相似，特别是杂交种子表面上很难区分。传统的形态鉴定法依赖于表型差异，而形态性状受到气候、环境、营养状态和生物期等多种因素的影响，使得形态鉴定法的工作量加大，鉴定周期长。构建水稻指纹图谱，是现阶段控制水稻内在质量的有效手段。
[0003]DNA分子标记能反映生物个体或种群基因组中某种差异特征的DNA片段，可以从根本上揭示植物内在的基因差异，近年来已经广泛应用到作物品种鉴定和种质资源分类等研究领域。其中SSR (Simple sequence repeat)标记由于具有多态性高、数量丰富、遗传上呈共显性、结果稳定可靠、实验操作简单、引物序列易交流等优点，在水稻指纹图谱构建中表现出更为突出的应用价值。
[0004]传统的SSR-PCR扩增产物主要通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯凝胶电泳等生物技术来进行多态性分析的，这些方法虽然比较成熟但却非自动化，耗时、耗力，且不能准确读出扩增片段大小，难以统一处理不同批次的反应数据，在大规模、多批收集和分析数据时，仍具有相当大的难度。毛细管电泳(Capillay Electrophoresis, CE)是20世纪80年代后期在全球范围内迅速崛起的一种分离分析技术，该技术利用与遗传系统相匹配的电脑软件完成对数据的统一处理，操作简便，实现了分子标记研究与高效、自动化技术的结合，并且能准确读出扩增等位基因片段的大小，减少了人为误差，使得鉴定结果更为精确，更适用于水稻指纹图谱的建立。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种高通量、容易实现自动化、结果准确可靠的水稻品种的鉴定方法，解决水稻纯度和真伪的鉴定难题，也可以对商品大米进行品种鉴定，保护品种所有人的合法知识产权。
[0006]本发明所提供的水稻品种的鉴定方法，包括以下步骤:
(I)提取高质量水稻基因组DNA ; (2)用筛选的SSR荧光引物进行PCR扩增；(3)将所得扩增产物进行毛细管凝胶电泳检测；(4)得出所扩得条带大小；(5)通过数据统计分析获得0-1矩阵图；(6)根据0-1矩阵图绘制指纹模式图谱的胶板图。
[0007] 作为本发明的进一步限定，所述水稻基因组DNA的提取方法为:(1)剪取0.02~0.04 cm2的水稻新鲜嫩叶装入96孔PCR板的孔中，加入100 μ I DNA提取缓冲液，加入0.2 μ I的100mg/ml蛋白酶K和1μ I的10 mg/ml核糖核酸酶,用PCR板硅胶盖封盖好后于漩涡振荡仪上混匀；(2)在PCR扩增仪中设置以下反应程序并保存:首先设置温度为37°C，时间为30 min ;接着设置温度为68°C，时间为20 min ;然后设置温度为37°C，时间为30 min ;最后设置温度为4°C，时间为; (3)将步骤(1)得到的PCR板放入设置好的PCR仪中进行反应；(4)反应结束后立刻将PCR板转置于冰面上进行冰浴10 min ; (5)将PCR板放入冷冻离心机中，在4°C下3000 rpm离心10 min，取上清液即得DNA溶液，置于_20°C保存备用。
[0008]作为本发明的进一步限定，所述SSR荧光引物为适用于水稻指纹图谱构建的5对核心引物，其中正向引物5’端以“CY5 ”磷荧光染料标记，合成荧光引物，并避光保存，所述的5对核心引物信息如下:
引物名称:RM206，引物序列:正向:5’ -CCCATGCGTTTAACTATTCT-3’，反向:5’ -CGTTCCATCGATCCGTATGG-3’，碱基重复:CT ；
引物名称:RM71，引物序列:正向:5’ -CTAGAGGCGAAAACGAGATG-3’，反向:5’ -GGGTGGGCGAGGTAATAATG-3’，碱基重复:(ATT) IOT (ATT) 4 ；
引物名称:觀85，引物序列:正向:5’ -CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3’，反向:5’ -GCACAAGGTGAGCAGTCC-3’，碱基重复:(TGG) 5 (TCT) 12，；
引物名称:RM311，引物序列:正向:5’ -TGGTAGTATAGGTACTAAACAT-3’，反向:5’ -TCCTATACACATACAAACATAC-3’，碱基重复= (GT)3(GTAT)8(GT)5 ；
引物名称:RM297，引物序列:正向:5’-TCTTTGGAGGCGAGCTGAG-3’，反向:5’ -CGAAGGGTACATCTGCTTAG-3’，碱基重复:(GA)13。
[0009]作为本发明的进一步限定，所述PCR扩增的扩增程序为:首先94°C预变性5 min ；随后的30个循环为:94°C变性30 sec，55°C退火30 sec，72°C延伸30 sec ;最后72°C下延伸 10 min。
[0010]作为本发明的进一步限定，所述毛细管电泳检测方法为:首先打开BECKMANCOULTER CEQ 8000遗传分析系统仪毛细管通道盖，卸下毛细管阵列，清洗毛细管检测窗口，安装毛细管和凝胶，将毛细管温度调整至50°C，按照0.4 ml凝胶，重复3次模式进行初级管路冲洗，执行毛细管充胶，重复3次，执行光路聚集，监控仪器基线，使系统背景值低于6000RFU ;然后输入样品名，选择电泳分离方法和数据分析方法，保存样本信息；最后使用去离子水冲洗水 槽三次，加入去离子水至标线,擦干水槽外表面,装入水槽,放入样本板和缓冲液板，开始运行样本，PCR产物与Genescan-400分子量标准品的荧光信号均由基因分析仪自动保存。
[0011]作为本发明的进一步限定，所述系统背景值应低于6000RFU，清洗检测窗口后，执行光学校正和监控基线，如果背景值仍在6000RFU之上，需重复清洗程序，直至背景值低于6000RFU ；
作为本发明的进一步限定，所述程序中使用的水必须是灭菌去离子水；所用的去离子水电导率一般为18.2MQ/CM ；
作为本发明的进一步限定，所述样板中为Gemescan-400 (分子量内标_400)，上样缓冲液甲酰胺(SLS)和稀释后的PCR扩增产物的混合液，将上样板在涡旋震荡器上震荡30s或者用枪头混匀10次，且不能出现气泡，加入一滴石蜡油覆盖样品；在缓冲液板与上样板对应的孔内加入3/4体积的分离缓冲液。
[0012]作为本发明的进一步限定，所述数据分析方法为:用GeneMapper-V3.0软件对BECKMAN COULTER CEQ 8000遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出不同参试材料的SSR标记的扩增片段，利用软件将SSR标记片段与Genescan-400分子量标准品比较，得到SSR标记片段长度大小。在所有SSR标记片段上，参试材料中若扩增出记为“1”，无扩增出记为“0”，并对数据进行二维数据统计分析。
[0013]本发明筛选出了 5对多态性丰富、带型清晰、稳定性好、重复性高的SSR核心引物。
[0014]本发明应用毛细管凝胶电泳技术对SSR-PCR扩增产物进行检测，该技术利用与遗传分析系统相匹配的电脑软件完成对数据的统一处理，操作简便，实现了分子标记研究与高效、自动化技术的结合，将PCR产物和标准分子量样品(内标)在同一泳道中进行电泳，精确分析扩增产物的片段长度，避免了人为误差，使实验结果更加准确。
[0015]除此之外，按照本发明所述方法还可以将本发明所选水稻品种之外的其他水稻品种或者将现有所知的所有水稻品种构建标准水稻品种的SSR指纹图谱，如此便可鉴定更多的待测水稻品种。
[0016]由以上技术方案可知，本发明应用SSR分子标记技术从遗传本质上对水稻品种进行准确鉴定，解决了长期以来水稻品种鉴定困难的问题，且具有高通量，简单、易操作，结果准确可靠，为我国水稻品种的准确鉴定、育种利用和新品种权保护提供了重要依据，为我国水稻品种标准指纹库的构建奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1、图2、图3分别为引物RM297、RM206、RM311对22个水稻品种的扩增指纹模式图谱，图谱中黑色区域代表每个样品的指纹，由图可以看出筛选出的SSR引物能够将22个水稻品质特异的区分开。
【具体实施方式】
[0018]实施例:水稻品种SSR指纹图谱的构建 实验材料为选取的22种常用水稻品种。
[0019]1、基因组DNA的提取
(1)用75%的酒精擦洗过的剪刀剪取0.02、.04 cm2的叶片装入96孔PCR板的孔中，加入100 μ I DNA提取缓冲液，加入0.2 μ I的100 mg/ml蛋白酶K和I μ I的10 mg/ml核糖核酸酶，用PCR板硅胶盖封盖好后于漩涡振荡仪上混匀10 sec ；
(2)在PCR扩增仪中设置以下反应程序并保存:首先设置温度为37°C，时间为30min ；接着设置温度为68°C，时间为20 min ;然后设置温度为37°C，时间为30 min ;最后设置温度为4°C，时间为无穷； (3)将步骤(1)得到的PCR板放入设置好的PCR仪中进行反应；
(4)反应结束后立刻将PCR板转置于冰面上进行冰浴10min ；
(5)将PCR板放入冷冻离心机中，在4°C下3000rpm离心10 min，取上清液即得DNA溶液，置于_20°C保存备用；2.PCR扩增
PCR 反应体系(10 μ I):1 μ I 25 ng/μ I DNA 模板、I μ I IOXBuffer (含 20 mMMg2+)>0.2 μ I 10 mM dNTP、0.4 μ I 10 mol/L SSR 引物、0.I μ I DNA pfu 酶(5 U/μ I),加ddH20至20 μ I (试剂购自生工生物工程股份有限公司)。
[0020]PCR扩增程序:首先94°C预变性5 min ;随后的30个循环为:94°C变性30 sec,55°C退火 30 sec，72°C延伸 30 sec ;最后 72°C下延伸 10 min。
[0021] 3.毛细管凝胶电泳检测
(1)打开BECKMANCOULTER CEQ 8000 (美国，BECKMAN公司生产)遗传分析系统仪毛细管通道盖，卸下毛细管阵列，清洗毛细管检测窗口 ；
(2)安装毛细管和凝胶，将毛细管温度调整至50°C，按照0.4 ml凝胶，重复3次模式进行初级管路冲洗，执行毛细管充胶，重复3次，执行光路聚集，监控仪器基线，使系统背景值低于6000RFU，如果背景值仍在6000RFU之上，需重复清洗程序；
(3)将所得到的PCR产物稀释100倍，在96孔上样板的各孔中分别加入20μL SLS(上样缓冲液，甲酰胺)、0.2 μL Genescan-400分子量标准品和I μL稀释后的PCR产物，在涡旋震荡器上震荡30 sec混匀，且不能出现气泡，加入一滴石蜡油覆盖样品，即得上样板。
[0022](4)在缓冲液板与上样板对应的孔内加入3/4体积的分离缓冲液；
(5)在基因分析仪Setup程序中输入样品名，设定电泳分离程序为90°C变性2 min；进样电压2 kV，时间30 sec ;分离电压7.5 kV，时间40 min，保存样本信息；
(6)使用去离子水冲洗水槽三次，加入去离子水至标线，擦干水槽外表面，装入水槽，放入配制好的样本板和缓冲液板,开始运行样本，PCR产物与Genescan-400分子量标准品的荧光信号均由基因分析仪自动保存；
4.数据分析
用GeneMapper-V3.0软件对BECKMAN COULTER CEQ 8000遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出各供试材料的SSR标记的扩增片段，软件系统将根据扩增片段目标峰的位置与同一泳道中的Genescan-400分子量标准品进行比较，得到SSR标记片段长度大小。在所有SSR标记片段上，参试材料中若扩增出记为“1”，无扩增出记为“0”，建立各个SSR引物在22份水稻材料中扩增片段的0-1矩阵图，根据0-1矩阵图绘制指纹模式图谱的胶板图。图1、图2、图3分别为引物RM297、RM206、RM311对22份水稻材料的扩增指纹模式图，黑色区域代表每个样品的指纹。由图中可以看出，每个样品的指纹都是唯一的，说明所选引物都能很好的区分每个供试品种，可用于水稻指纹图谱的构建。
[0023]按照本实施例方法构建指纹图谱，共重复3次，每次结果均一致。说明SSR荧光标记和毛细管电泳技术相结合，检测结果稳定可靠，适用于水稻指纹图谱的构建。
【权利要求】
1.一种基于SSR标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤:(I)提取水稻基因组DNA ; (2)用筛选的SSR荧光引物进行PCR扩增；(3)将所得扩增产物进行毛细管凝胶电泳检测；(4)得出所扩得条带大小；(5)通过数据统计分析获得0-1矩阵图；(6)根据0-1矩阵图绘制指纹模式图谱的胶板图。
2.根据权利要求1所述的基于SSR标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法，其特征在于，所述提取水稻基因组DNA的方法为:(I)剪取0.02、.04 cm2的水稻新鲜嫩叶装入96孔PCR板的孔中，加入100 μ I DNA提取缓冲液，加入0.2 μ I的100 mg/ml蛋白酶K和I μ I的10 mg/ml核糖核酸酶，用PCR板硅胶盖封盖好后于漩涡振荡仪上混匀；(2)在PCR扩增仪中设置以下反应程序并保存:首先设置温度为37 °C，时间为30 min;接着设置温度为68 °C,时间为20 min ;然后设置温度为37 °C,时间为30 min ;最后设置温度为4°C，时间为无穷；(3)将步骤(1)得到的PCR板放入设置好的PCR仪中进行反应；(4)反应结束后立刻将PCR板转置于冰面上进行冰浴10 min ; (5)将PCR板放入冷冻离心机中，在4℃下3000 rpm离心10 min，取上清液即得DNA溶液，置于-20 °C保存备用。
3.根据权利要求1所述的基于SSR标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法，其特征在于，所述SSR荧光引物为适用于水稻指纹图谱构建的5对核心引物，其中正向引物5’端以“CY5”磷荧光染料标记，合成荧光引物，并避光保存，所述的5对核心引物信息如下: 引物名称:RM206，引物序列:正向:5’ -CCCATGCGTTTAACTATTCT-3’，反向:5’ -CGTTCCATCGATCCGTATGG-3’，碱基重复:CT ； 引物名称:RM71，引物序列:正向:5’ -CTAGAGGCGAAAACGAGATG-3’，反向:5’ -GGGTGGGCGAGGTAATAATG-3’，碱基重复:(ATT) IOT (ATT) 4 ； 引物名称:觀85，引物序列:正向:5’ -CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3’，反向:5’ -GCACAAGGTGAGCAGTCC-3’，碱基重复:(TGG) 5 (TCT) 12，； 引物名称:RM311，引物序列:正向:5’ -TGGTAGTATAGGTACTAAACAT-3’，反向:5’ -TCCTATACACATACAAACATAC-3’，碱基重复= (GT)3(GTAT)8(GT)5 ； 引物名称:RM297，引物序列:正向:5’-TCTTTGGAGGCGAGCTGAG-3’，反向:5’ -CGAAGGGTACATCTGCTTAG-3’，碱基重复:(GA)13。
4.根据权利要求1所述的基于SSR标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增程序为:首先94 °C预变性5 min;随后的30个循环为:94 °C变性 30 sec, 55 °C退火 30 sec, 72 °C延伸 30 sec ;最后 72 °C下延伸 10 min。
5.根据权利要求1所述的基于SSR标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法，其特征在于，所述毛细管凝胶电泳检测方法为:首先打开遗传分析系统仪毛细管通道盖，卸下毛细管阵列，清洗毛细管检测窗口，安装毛细管和凝胶，将毛细管温度调整至50°C，按照0.4 ml凝胶，重复3次模式进行初级管路冲洗，执行毛细管充胶，重复3次，执行光路聚集，监控仪器基线，使系统背景值低于6000RFU ;然后输入样品名，选择电泳分离方法和数据分析方法,保存样本信息；最后使用去离子水冲洗水槽三次,加入去离子水至标线,擦干水槽外表面，装入水槽，放入样本板和缓冲液板，开始运行样本，PCR产物与Genescan-400分子量标准品的荧光信号均由基因分析仪自动保存。
6.根据权利要求5所述的基于SSR标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法，其特征在于，所述毛细管电泳检测方法的系统背景值应低于6000RFU，清洗检测窗口后，执行光学校正和监控基线，如果背景值仍在6000RFU之上，需重复清洗程序，直至背景值低于6000RFU。
7.根据权利要求5所述的基于SSR标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法，其特征在于，程序中使用的水必须是灭菌去离子水。
8.根据权利要求5所述的基于SSR标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法，其特征在于，样品板中为Gemescan-400，上样缓冲液甲酰胺和稀释后的PCR扩增产物的混合液，将上样板在涡旋震荡器上震荡30 sec或者用枪头混匀10次，且不能出现气泡，加入一滴石蜡油覆盖样品；在缓冲液板与上样板对应的孔内加入3/4体积的分离缓冲液。
9.根据权利要求1所述的基于SSR标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法，其特征在于，所述的数据分析方法为:用GeneMapper-V3.0软件对BECKMAN COULTER CEQ8000遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出不同参试材料的SSR标记的扩增片段，利用软件将SSR标记片段与Genescan-400分子量标准品比较，得到 SSR标记片段长度大小，在所 有SSR标记片段上，参试材料中若扩增出记为“ 1”，无扩增出记为“0”，并对数据进行二维数据统计分析。
【文档编号】C12Q1/68GK103911442SQ201410094041
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】梁俊, 陈远孟, 刘守廷, 覃红萍, 甘国勇, 莫璋红, 宋雪萍, 蒋天成, 赵晶, 苏小玲, 刘广林, 陈传华, 唐梅, 张宗琼, 罗群昌, 梁益珍, 李碧红 申请人:南宁益谱检测技术有限公司, 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所, 广西壮族自治区分析测试研究中心, 南宁泰格瑞农业科技有限公司