鉴别检测狗源性成分的pcr检测引物试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及动物生物【技术领域】，具体涉及到狗源性PCR检测试剂盒及其检测方法。一种鉴别检测狗源性成分的PCR检测试剂盒，其主要特点在于包括双蒸水，Mix；上游引物GF：5’-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’；下游引物GR：5’-TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’，Taq酶。本发明的优点是准确、快速、可靠的鉴别狗的源性成分，对有效抵御狗源疾病疫病的传播和蔓延以及各行业狗源产品真假鉴别具有重要的意义。
【专利说明】鉴别检测狗源性成分的PCR检测引物试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物生物【技术领域】，具体涉及到狗源性PCR检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]畜禽肉食品的动物源性成分的鉴别检测已涉及到肉食品的工业、进出口贸易、市场及餐饮业等领域。目前国内外利用分子标记技术对畜禽源性成分鉴别方法做出了一定的研究工作。美国、意大利对牛源性成分的检测进行了研究，日本对牛、绵羊、猪、鸡的动物源性成分进行了研究。国内对畜禽源性成分鉴别检测中的研究报道大多是对牛、羊、猪、鸡、马、驴、鹿等源性成分的检测研究，但对狗源性成分鉴别检测的研究报道几乎没有。随着我国畜牧业的发展以及人们生活水平的提高，肉狗养殖和整体开发作为一个全新产业应运而生，掀起了肉狗养殖热，取得了可观的经济效益。然而，由于多年来对肉狗饲养的研究工作滞后，未能形成肉狗的规模化饲养，一些不法商贩为获取暴利，一些行为严重地损害了消费者利益。另外，由于狗的屠宰比较分散，狗肉来源不明，动物检疫员上市场补检，无法实施宰前、宰后检疫程序，检疫质量得不到根本保证，从而存在极大的食品安全隐患。因此，研究出一种准确、快速、可靠的鉴别检测食品、非食用性动物产品、饲料及饲料添加剂中狗源性成分的PCR引物就具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种鉴别检测狗源性成分的PCR检测引物及其试剂盒。以通过PCR扩增准确、快速、可靠的鉴别检测食品、非食用性动物产品、饲料及饲料添加剂等产品中的狗源性成分。
[0004]本发明的又一目的在于一种鉴别检测狗源性成分的PCR检测方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种鉴别检测狗源性成分的PCR检测引物，其主要特点在于:
[0006]上游引物GF: 5，-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3 ’ ；
[0007]下游引物GR: 5 ’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3 ’。
[0008]一种鉴别检测狗源性成分的PCR检测试剂盒，其主要特点在于包括双蒸水，Mix;上游引物 GF:5’-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’ ；下游引物 GR:5，-TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3，，Taq 酶。
[0009]一种鉴别检测狗源性成分的PCR检测方法，其主要特点在于，检测步骤如下:
[0010](I)样品采集:
[0011](2)基因组DNA的提取；
[0012](3) PCR反应体系:双蒸水3.4 μ L、Mix5 μ L、模版0.4 μ L、上游引物GF:5’ -GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’ 0.4 μ L、下游引物 GR:5’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’ 0.4 μ1^;丁&9酶0.4“1^，1(^1^体系；[0013]PCR 反应条件:98°C预变性 Imin ;98°C变性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 lmin，31个循环；72°C延伸IOmin ；
[0014](4)扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0015]本发明的有益效果是:源性成分的检测研究最初从饲料食品行业的畜产品开始，逐渐涉及到各个领域，技术不断提高，范围不断扩大。随着我国畜牧业的发展以及人们生活水平的提高，狗养殖产业应运而生，取得了可观的经济效益，但狗的养殖未能形成规模化饲养，一些不法商贩为获取暴利使用低价动物肉源及副产品以次充好，损害了消费者利益。另外，狗肉检疫程序及质量体系还不完善，存在极大的食品安全隐患。因此，研究出准确、快速、可靠的鉴别狗源性成分的方法和技术，对有效抵御狗源疾病疫病的传播和蔓延以及各行业狗源产品真假鉴别对具有重要的意义。
[0016]本发明利用灭菌超纯水对狗DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到IlOng/ μ L、Ilng/ μ L、l.lng/ μ L> IlOpg/ μ L、llpg/ μ L、l.lpg/ μ L> IlOfg/ μ L> llfg/ μ L,然后进行PCR扩增。由PCR产物电泳结果可知，能检测到的最低浓度为:llng/ul，即该引物的灵敏度是 llng/ul。
[0017]本发明具有准确、快速、灵敏度高、成本低等特点。
【专利附图】
【附图说明】:
[0018]图1是鸡、鸭、鹅、鹤鹁、鴻子、鹤聘、马、牛、羊、猪、5户、兔子、鱼、狗等动物的基因组DNA的电泳检测结果图；
[0019]图2狗PCR扩增产物电泳图；
[0020]图3狗特异性基因片段的PCR检测电泳图；
[0021]图4特异性PCR灵敏度验证图。
【具体实施方式】
[0022]以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0023]实施例1:一种鉴别检测狗源性成分的PCR检测引物，其主要特点在于:
[0024]上游引物GF: 5 ’ -GTTATTTGACTGCGTTAGG-3 ’ ；
[0025]下游引物GR: 5 ’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3 ’。
[0026]实施例2:—种鉴别检测狗源性成分的PCR检测试剂盒，其主要特点在于包括双蒸7jC (3.4-340 μ L),Mix (5-50 μ L);上游引物 GF:5’-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’ (0.4-40 μ L)；下游引物 GR:5’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’ (0.4-40 μ L)，Taq 酶(0.4-40) μ L。(数量按1-100次计算)
[0027]实施例3:—种鉴别检测狗源性成分的PCR检测方法，其特征在于，检测步骤如下:
[0028](1)样品米集:常规米集试验动物样品。
[0029](2)基因组DNA的提取；采用氯仿抽提法或生物公司提供试剂盒。
[0030](3) PCR反应体系:双蒸水3.4 μ L、Mix5 μ L、模版0.4 μ L、上游引物GF:5，-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3，0.4 μ L、下游引物 GR:5，-TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3，0.4 μ1^;丁&9酶0.4“1^，1(^1^体系；
[0031] PCR 反应条件:98°C预变性 Imin ;98°C变性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 lmin，31个循环；72°C延伸IOmin。
[0032]( 4 )扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0033]实施例4:一种鉴别检测狗源性成分的PCR检测方法，其检测步骤如下:
[0034]1.总DNA的提取
[0035]采用氯仿抽提法或生物公司提供的试剂盒，发明人使用天根生化科技(北京)有限公司提供的试剂盒，提取鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、鹧鸪、马、牛、羊、猪、驴、兔子、鱼、狗等动物的基因组DNA，结果见图1。
[0036]2.特异性引物设计
[0037]用于检测狗源性成分的PCR特异性引物(只能扩增出狗DNA限制性片段，而扩增不出其它动物DNA限制性片段)是根据狗的mtDNA序列进行设计。
[0038]引物信息如下:
[0039]上游引物GF: 5，-GTTATTTGACTGCGTTAGG-3 ’
[0040]下游引物GR: 5，-TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3，
[0041]扩增序列长度为549bp。
[0042]3.狗 PCR 扩增
[0043]利用设计的特异性引物GF和GR，以狗DNA为模板进行PCR扩增。
[0044]PCR反应体系
[0045]体系为:双蒸水3.4μ L、Mix5 μ L、模版 0.4 μ L、引物(各)0.4μ L、Taq 酶 0.4μ L,10 μ L体系。
[0046]PCR反应条件:
[0047]98°C预变性 Imin ;98°C变性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 lmin，31 个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2，可以看出，扩增出约549bp的DNA片段，与预期扩增的片段长度相符。
[0048]4.引物的特异性验证:
[0049]利用所设计的特异性引物GF和FR，分别以狗、鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、鹧鸪、马、牛、羊、猪、驴、兔子、鱼等动物的总DNA为模板，进行PCR扩增，验证引物的特异性。PCR产物电泳结果见图3，该引物能够从狗的DNA中扩增出特异性的目的条带，扩增产物大小为549bp，而从其它动物组织的DNA中均没有能够扩增出目的条带。5.扩增狗DNA产物测序序列:
[0050]将狗PCR扩增产物进行纯化后送测序公司测序。测序结果与GenBank中狗mt_DNA序列比对分析，结果表明:PCR特异性扩增产物的测序如下，与狗mt-DNA段同源性达到96%。[0051 ] ttgtcagtaattgtcagtatctccaggtaaacccttcttccctcccctatgtacgtcgtg 60
[0052]cattaatggtttgccccatgcatataagcatgtacataatattatattcttacataggac 120
[0053]atatcaactcaatctcataattcattgatctgtcagcagtaatcaaatgcatatcactta 180
[0054]gtccaataagggcttaatcaccatgcctcgagaaaccatcaacccttgctcgtaatgtcc 240
[0055]ctcttctcgctccgggcccatactaacgtgggggttactatcatgaaactatacctggca 300
[0056]tctggttcttacctcagggccataactctatttactccaatcctactaattctcgcaaat 360
[0057]gggacatctcgatggactaatgactaatcagcccatgatcacacataactgtggtgtcat 420[0058]gcatttggtatcttttaatttttagggggggaatctgctatcactcatctacgaccgcaa 480
[0059]cggcactaactctaacttatcttctgctctcaggggatatgcccgtcgcggccctaacga 540
[0060]agtcaaata549
[0061]7.PCR的灵敏度验证
[0062]以灭菌超纯水对狗DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到IlOng / μ LUlng /μ L>1.1ng / μ L>IlOpg / μ L>Ilpg / μ L>1.1pg / μ L>IlOfg / μ L>Ilfg / μ L,然后进行PCR扩增。由PCR产物电泳结果见图4，可知，能检测到的最低浓度为:1.lng / ul，即该引物的灵敏度是1.1ng / ul。
[0063]实验例:
[0064]1.引物设计
[0065]根据GenBank中公布的狗mtDNA(AY729880)非保守区序列设计。引物设计软件为vector NT10
[0066]2.检测样品基因组DNA提取
[0067]采用氯仿抽提法或商业提供的试剂盒，提取鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、鹧鸪、马、牛、羊、猪、驴、兔子、鱼、狗等动物的基因组DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果。提取的基因组DNA均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度，测定0D260 / 0D280值均为1.76左右，说明DNA纯度较高符合PCR扩增要求。
[0068]3.狗源性成分PCR扩增。
[0069]用步骤I设计的引物，以狗DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为:双蒸水3.4μ L、Μ?χ5μ L、模版0.4μ L、引物(各)0.4 μ L、Taq酶0.4 μ L，10 μ L体系。反应条件为:98°C预变性 Imin ;98°C变性 30s，57°C退火 30s，72。。延伸 Imin, 31 个循环；72°C延伸 IOmin0
[0070]4.电泳检测
[0071]PCR扩增产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0072]5.引物的特异性验证
[0073]用步骤I设计的引物，分别以狗、鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、鹧鸪、马、牛、羊、猪、驴、兔子、鱼等动物的总DNA为模板，按照步骤3反应条件进行PCR扩增，验证引物的特异性。电泳检测结果显示，该引物能够从狗的DNA中扩增出特异性的目的条带，扩增产物大小为549bp，而从其它动物种的DNA中均没有能够扩增出目的条带。
[0074]6.PCR灵敏度验证
[0075]用灭菌超纯水对狗DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到IIOng/μ L、llng/μ LU.lng/μ LUlOpg/μ LUlpg/μ LU.lpg/μ L、IlOfg/μ L、llfg/μ L，然后按步骤 3 反应条件进行PCR扩增。电泳结果显示，能检测到的最低浓度为:1.lng/ul。
[0076] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0077]<110>毕节学院
<120>鉴别检测狗源性成分的PCR检测引物试剂盒及其检测方法<130>
<160>I
< 170>PatentIn version 3.3
<210>I
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<212>DNA
<213>狗源性基 因序列
<400> I
Ugicagtaa Ugicaglat clccagglaa acccUcttc cctcccctal gtacgicglg60
cattaaiggi Ugccccalg catataagca tgtacataat attatattct tacataggac120
alatcaactc aaictcataa Ucaltgaic Igtcagcagl aatcaaalgc alatcactla180
gtccaataag ggcttaatca ccatgcctcg agaaaccatc aacccttgcl cglaalgl.cc240
clcttctcgc tccgggccca Iactaacglg ggggtlacta tcatgaaact atacctggca300
tciggilclt acclcagggc calaaclcla tllaclccaa icclactaat Iclcgcaaat360
gggacatclc gatggacIaa tgactaatca gcccalgatc acacaiaact glgglgtcat420
gcalllggla IclULaali Ulagggggg gaalclgcta tcaclcalct acgaccgcaa480
[0078]
【权利要求】
1.一种鉴别检测狗源性成分的PCR检测引物，其特征在于: 上游引物 GF:5’ -GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’: 下游引物 GR:5’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’。
2.一种鉴别检测狗源性成分的PCR检测试剂盒，其特征在于包括双蒸水；Mix ;上游引物 GF:5’ -GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’ ；下游引物61?:5’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’ ；Taq酶；
3.一种鉴别检测狗源性成分的PCR检测方法，其特征在于，检测步骤如下: (1)样品采集: (2)基因组DNA的提取； (3)PCR反应体系:双蒸水3.4 μ L、Mix5 μ L、模版0.4 μ L、上游引物GF:5’ -GTTATTTGACTGCGTTAGG-3’ 0.4 μ L、下游引物 GR:5’ -TGTCAGTATTGTCAGTATCTCC-3’ 0.4 μ1^;丁&9酶0.4“1^，1(^1^体系； PCR反应条件:98°C预变性Imin ;98°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸lmin，31个循环；72°C 延伸 IOmin ； (4)扩增产物经1%琼脂 糖凝胶电泳检测。
【文档编号】C12N15/11GK103923979SQ201410101176
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】李丽娟, 王忻, 周建华, 袁晓龙 申请人:毕节学院