伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用的制作方法

文档序号:472198阅读:452来源:国知局
伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用。本发明提供了一株缺失gI和gE基因的伪狂犬病病毒株,其微生物保藏编号是CGMCC.No.8786。本发明进一步提供了构建所述双基因缺失毒株的方法,包括:(1)构建含有EGFP和Neo基因完整表达盒的伪狂犬病病毒TJ株转移载体;(2)将转移载体转染于接种伪狂犬病病毒TJ株后的细胞,获得过渡病毒;(3)过渡病毒基因组酶切处理后与转移载体共转染细胞,经蚀斑筛选即得。本发明缺失毒株被完全致弱,免疫猪只后未出现任何临床反应,能够迅速诱导伪狂犬病病毒特异性抗体的产生,中和抗体滴度高,对当前流行的伪狂犬病病毒变异株的攻击能提供完全的免疫保护。
【专利说明】伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及伪狂犬病病毒变异株,尤其涉及一株伪狂犬病病毒变异株双基因缺失 毒株及其构建方法,本发明还涉及伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株在制备防治由伪狂 犬病病毒变异株引起的动物传染病药物中的应用,属于伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒 株的构建及应用领域。

【背景技术】
[0002] 伪狂犬病(pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引 起的猪、羊、牛等多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎、呼吸和神 经系统障碍为主要特征的急性传染病。PRV是疱疫病毒科α疱疫病毒亚科水痘病毒属的 成员,基因组为线性双链DNA,长约145kb,G+C含量高达73%。整个基因组由独特长区UL、 独特短区US及位于US两侧的末端重复序列TRS和内部重复序列IRS构成,共编码约70? 100种病毒蛋白,其中有近一半基因被认为是病毒复制非必需的(Pomeranz LE, Reynolds AE, Hengartner CJ. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 2005, 69(3):462-500·)。PRV 含有 11种糖蛋白,即:gB、gC、gD、gE、gG、gH、gl、gK、gL、gM和gN,其中gE糖蛋白是PRV的主 要毒力因子,属于典型的I型跨膜蛋白,在介导细胞的感染融合、病毒在细胞间的扩散、 病毒粒子的释放及病毒的嗜神经性等方面发挥着重要作用(Mengeling WL, Brockmeier SL, Lager KM, Vorwald AC. The role of biotechnologically engineered vaccines and diagnostics in pseudorabies(Aujeszky's disease)eradication strategies.Vet Microbiol. 1997,55 (1-4):49-60 ;Nauwynck HJ, Labarque GG, Pensaert MB. Efficacy of an intranasal immunization with gEgC and gEgl double-deletion mutants of Aujeszky' s disease virus in maternally immune pigs and the effects of a successive intramuscular booster with commercial vaccines. Zentralbl Veterinarmed B. 1999, 46(10) :713-22.)。
[0003] 伪狂犬病目前尚无特效治疗药物,主要以预防为主,其中,疫苗免疫接种是防 治伪狂犬病的重要措施。然而,自2011年以来,中国大部分免疫过伪狂犬病弱毒疫 苗Bartha-K61的猪场出现了典型的伪狂犬病症状(Wu R,Bai C,Sun J,Chang S,Zhang X.Emergence of virulent pseudorabies virus infection in northern China. J Vet Sci. 2013, 14(3) :363-365.),感染猪表现为高热(40?42°C ),精神沉郁、食欲下降、咳嗽、 气喘及神经症状,且新生猪死亡率高达50 %以上(彭金美,安同庆,赵鸿远,赵鸿远,刘益 民,陈家锃,冷超粮,孙艳,常丹,田志军,童光志.猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及 抗原差异性分析.中国预防兽医学报,2013, 35 (1) : 1-4.),感染猪出现了以往PR病例未见 的瘙痒症状。初步研究结果表明,与以前的毒株相比,新的流行毒株的抗原性已发生变异, PRV变异株致病性明显增强,传统疫苗Bartha-K61株对目前流行的PRV变异株不能提供完 全的免疫保护。因此,研制针对PRV变异株的疫苗,对于伪狂犬病的有效预防具有重要的意 义。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的之一是提供一株伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株;
[0005] 本发明的目的之二是提供一种构建伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株的方 法;
[0006] 本发明的目的之三是提供构建的伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株在制备防 治由伪狂犬病病毒(尤其是PRV变异株)引起的动物传染病药物中的应用。
[0007] 为了实现上述目的,本发明首先提供了一株伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒 株。
[0008] 本发明以PRV变异毒株PRVTJ株为亲本毒,利用改进的方法构建了 gl/gE双基因 缺失并且不含任何外源基因的伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株rPRVTJ-delgE。
[0009] 本发明所用的亲本毒PRV TJ株是2012年从中国天津某猪场的病猪脑组织中分离 到的。该毒株与目前流行的PRV变异株具有极高的同源性,而与以往的PRV毒株具有明显 差异,尤其是该毒株与PRV经典强毒株有明显差异,其主要毒力蛋白gE基因蛋白中有18处 氨基酸发生了突变,并且在第48位和第494位氨基酸处插入了天冬氨酸。动物实验表明, PRV TJ株对绵羊和仔猪表现为高度致死性,接种后4?5d大部分死亡;仔猪感染PRV TJ株 后,出现明显的瘙痒症状,这在以往的PRV感染病例中是罕见的。
[0010] 本发明构建的缺失病毒rPRVTJ-delgE缺失了 PRV TJ株的gE基因和gl基因(缺 失位点为PRV TJ株基因组的第122804-125101位序列,共缺失2298bp)。gE是一个重要的 毒力基因,gl也与毒力有关。gE蛋白和gl蛋白以非共价键形式结合成复合体gE/gl,它们 与PRV在神经系统中的侵袭和扩散作用密切相关。gE和gl基因的共同缺失,将使病毒致弱 更加充分,作为疫苗株更加安全可靠。有研究指出,gl/gE复合物具有结合IgG的能力,从而 阻止补体途径,导致机体免疫抑制。单独缺失gl或gE基因所获得的缺失病毒,无论是灭活 还是直接接种动物,所诱导的抗体滴度均不高,不能够对PRV强毒的攻击提供完全保护(吕 素芳,郭广君,管宇,魏风,张松林,沈志强.伪狂犬病毒SA株gI-/gE-/YFP+基因缺失载体 构建及突变株筛选.中国动物检疫.2009, 26(8) :38-40.董炳梅,郭广君,吕素芳,唐娜,魏 凤,管宇,张松林,沈志强.猪伪狂犬病病毒双基因缺失gI-/gE-/PRV SA738灭活疫苗的安 全性与免疫效力.中国兽医学报.2011,31 (7) :950-954.)。另外,本发明所构建的缺失病毒 rPRVTJ-delgE不含有任何外源基因,接种动物后不会诱导针对其它外源蛋白的抗体产生, 有效提高了缺失病毒的生物安全性和稳定性。
[0011] PCR检测及间接免疫荧光试验表明,本发明所构建的缺失病毒株rPRVTJ-delgE已 正确缺失gl和gE基因。一步生长曲线结果显示,缺失病毒株rPRVTJ-delgE具有与亲本毒 PRV TJ株相类似的生长动力学,只是在感染细胞10h后增殖速度较亲本毒PRV TJ株缓慢, 毒价上略低于亲本毒。在缺失病毒株rPRVTJ-delgE与亲本毒PRV TJ株接种细胞后所产生 的蚀斑形态和大小上未见有明显差异。
[0012] 本发明用不同滴度的缺失病毒株rPRVTJ-delgE免疫猪只后,免疫猪没有出现任 何临床反应和排毒现象,说明缺失病毒株被完全致弱。该缺失病毒株免疫猪只后1周就能 够产生较高的gB特异性抗体,至攻毒后3天,rPRVTJ-delgE株不同剂量免疫组均产生了中 和抗体,平均抗体滴度分别为105TCID5Q免疫组1:7. 75、104TCID5Q免疫组1:6. 25、103TCID5Q 免疫组1:5. 25,均高于Bartha-K61疫苗免疫组5. 00,表明本发明所构建的缺失病毒株保持 良好免疫原性;攻毒后,rPRVTJ-delgE免疫猪得到完全保护。
[0013] 本发明将构建的伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株rPRVTJ-delgE提交专利认 可的机构进行保藏,其微生物保藏编号为:CGMCC No. 8786 ;分类命名为:伪狂犬病病毒变异 株双基因缺失毒株。保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏时 间是2014年2月17日:保藏地址:中国北京朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生 物研究所。
[0014] 本发明还提供了一种构建伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株的方法,包括以下 步骤:
[0015] (1)构建转移载体;所述的转移载体含有PRV TJ株病毒DNA的左右同源重组臂L 和R,还含有EGFP、Neo基因的完整表达盒; _6] (2)构建具有指示标记的过渡病毒;将构建的转移载体转染于接种PRV TJ株后的 Vero细胞,经蚀斑筛选与纯化获得过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo ;
[0017] (3)将具有指示标记的过渡病毒基因组酶切处理后与转移载体pOK-LR共转染 Vero细胞,经蚀斑筛选获得了缺失gl和gE基因的重组病毒rPRVTJ-delgE。
[0018] 本发明根据PRV Kaplan株(GenBank登录号JQ809328. 1)US区基因序列,参照PRV Bartha-K61株的缺失部位设计两对引物,其中引物对1的核苷酸序列为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示,引物对2的核苷酸序列为SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示;本发明以PRV TJ 株病毒DNA为模板,以引物对1和2为扩增引物,分别扩增左右同源重组臂L和R,将扩增得 到的左右同源重组臂L和R克隆于p0K12载体上,获得转移载体pOK-LR ;再以pEGFP-Nl质 粒为模板,用引物扩增含有EGFP、Neo基因的完整表达盒;将含有EGFP、Neo基因的完整表 达盒克隆于pOK-LR的L和R片段之间获得转移载体pOKLR-EGFP-Neo。
[0019] 将转移载体pOKLR-EGFP-Neo质粒转染于接种PRV TJ株后的Vero细胞,经蚀斑 筛选与纯化获得过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo。本发明所构建的过渡病毒中引入了 Pmel和PacI两个独特的单一酶切位点,用这两个酶处理过渡病毒基因组后,再与转移载 体共转染细胞,获得缺失病毒。本发明构建的过渡病毒中含有EGFP基因作为指示标记基 因,在过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo中还引入了新霉素抗性基因 Neo,结合EGFP可视 化筛选与新霉素抗性筛选,大大提高了过渡病毒的纯化效率。在缺失病毒的构建过程中, 在过渡病毒rPRVTJ-de 1 gE-EGFP-Neo中引入两个独特的单一酶切位点Pme I和Pac I。将 rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因组用Pmel和PacI双酶切后再与转移载体pOK-LR共转染细 胞,转染后有病变但没有荧光的细胞所占的比例约为80% (目的病毒引起的病变细胞),故 从其中筛选不表达绿色荧光的重组缺失病毒蚀斑较为容易,显著提高了缺失病毒的筛选 与纯化效率。而未经Pmel和PacI双酶切处理的rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因组DNA与转 移载体pOK-LR共转染细胞后,视野中绝大部分细胞均发绿色荧光,比例约为90 %以上,目 的病毒引起病变的细胞不到10%,使得从其中筛选重组病毒蚀斑的难度很大。提取过渡病 毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因组DNA并用Pmel和PacI限制性内切酶进行酶切,将转移 载体pOK-LR质粒与酶切处理后的rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因组DNA共转染细胞,经蚀斑 筛选与纯化获得缺失了 gl和gE基因的缺失病毒株rPRVTJ-delgE。
[0020] 本发明还进一步提供了构建的伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株在制备防治 由PRV变异株引起的动物传染病药物中的应用。
[0021] 本发明构建的PRV变异株双基因缺失毒株对猪只安全,免疫后能够迅速产生PRV 特异性抗体,能够对当前流行的PRV变异株的攻击提供完全的免疫保护。该缺失病毒可以 用于制备防治由PRV变异株引起的动物传染性疾病药物,尤其用于制备防治由伪狂犬病病 毒变异株引起的伪狂犬病疫苗,有效预防伪狂犬病。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 图1为缺失病毒株构建策略图。
[0023] 图2为过渡病毒、缺失病毒株和亲本病毒株接种PK-15细胞后荧光及病变观察; A1 :rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo 接种细胞后荧光观察;A2 :rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo 接种细胞 后病变观察;B1 :rPRVTJ-delgE接种细胞后荧光观察;B2 :rPRVTJ-delgE接种细胞后病变 观察;Cl :PRV TJ接种细胞后荧光观察;C2 :PRV TJ株接种细胞后病变观察。
[0024] 图3为过渡病毒、缺失病毒株和亲本病毒株中gE和gB基因的PCR扩增;A :gE基 因的PCR扩增;B :gB基因的PCR扩增。
[0025] 图4为过渡病毒、缺失病毒株和亲本病毒株接种细胞后gB和gE蛋白表达的检测。
[0026] 图5为过渡病毒、缺失病毒株和未本病毒株的一步生长曲线。
[0027] 图6为本发明构建的双基因缺失毒株免疫猪gB特异性抗体的检测结果。
[0028] 图7为本发明构建的双基因缺失毒株免疫猪gE特异性抗体的检测结果。

【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0030] 1、实验材料
[0031] PRV变异株T J株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离、鉴定、保存;PRV Bartha-K61株购自哈尔滨维科生物技术有限公司(生产批号2013001)。Vero细胞和PK-15 细胞由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存。P0K12载体(N 〇vagene,USA) 和pEGFP-Nl载体(Clontech,USA)用于转移载体的构建。
[0032] 实施例1缺失病毒的构建
[0033] 1、实验方法
[0034] 1. 1转移载体的构建
[0035]根据 PRV Kaplan 株(GenBank 登录号 JQ809328. 1)US 区基因序列、参照 PRV Bartha-K61株的缺失部位设计两对引物P1S/P1R和P2S/P2R (表1)。然后以PRV变异株TJ 株病毒 DNA 为模板,应用引物 P1S/P1R(SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2)和 P2S/P2R(SEQ ID No. 3 和SEQ ID No. 4)分别扩增左右同源重组臂(L和R),然后将L、R通过EcoRI和Xbal酶切位 点克隆于P〇K12载体上,获得转移载体pOK-LR。再以pEGFP-Nl质粒为模板,应用引物P3S/ P3R(SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6)(表1)扩增含有EGFP、Neo基因的完整表达盒。然后将此 片段通过Mlul酶切位点克隆于pOK-LR的L和R片段之间获得转移载体pOKLR-EGFP-Neo, 具体构建策略见图1。
[0036] 表1引物序列及扩增片段
[0037]

【权利要求】
1. 一株伪狂犬病病毒(pseudorabies virus) TJ株双基因缺失毒株,其特征在于:缺失 了伪狂犬病病毒TJ株的gl和gE基因,所缺失的序列位于伪狂犬病病毒TJ株基因组的第 122804-125101位核苷酸,片段大小为2298bp。
2. 按照权利要求1所述的伪狂犬病病毒TJ株双基因缺失毒株,其特征在于:其微生物 保藏编号为CGMCC. No. 8786 ;
3. -种构建权利要求1或2所述伪狂犬病病毒TJ株双基因缺失毒株的方法,其特征在 于,包括以下步骤: (1) 构建含有伪狂犬病病毒TJ株病毒DNA的左右同源重组臂L和R、EGFP以及Neo基 因完整表达盒的转移载体; (2) 将构建的转移载体转染于接种伪狂犬病病毒TJ株后的Vero细胞,经蚀斑筛选与纯 化获得过渡病毒; (3) 将过渡病毒基因组酶切处理后与只含有左右同源重组臂L和R的转移载体共转染 细胞,经蚀斑纯化,即得。
4. 按照权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的转移载体的构建方法包括:以伪狂 犬病病毒TJ株病毒DNA为模板,以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物对1和SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物2为扩增引物,分别扩增左右同源重组臂L和R,将扩增得到 的左右同源重组臂L和R克隆于pOK12载体上,获得转移载体pOK-LR ;扩增含有EGFP、Neo 基因的完整表达盒;将含有EGFP、Neo基因的完整表达盒克隆于pOK-LR的L和R片段之间 获得转移载体P〇KLR-EGFP-Neo。
5. 按照权利要求3所述的方法,其特征在于:步骤(3)中所述的细胞是Vero细胞。
6. 按照权利要求3所述的方法,其特征在于:将过渡病毒基因组用Pmel和PacI进行 酶切处理后与转移载体pOK-LR共转染细胞。
7. 权利要求1或2所述的伪狂犬病病毒TJ株双基因缺失毒株在制备防治由伪狂犬病 病毒所引起的动物传染病药物中的应用。
8. 按照权利要求7所述的应用,其特征在于,所述的伪狂犬病病毒是伪狂犬病病毒变 异株或伪狂犬病病毒经典强毒株。
9. 按照权利要求7所述的应用,其特征在于:所述的动物传染病是动物伪狂犬病。
10. -种预防或治疗动物伪狂犬病的疫苗组合物,其特征在于:包括预防或治疗上有 效量的权利要求1或2所述的伪狂犬病病毒TJ株双基因缺失毒株以及药学上可接受的载 体或辅料。
【文档编号】C12N7/04GK104059889SQ201410105058
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】仇华吉, 孙元, 罗玉子, 李素, 李永锋 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
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