铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型：以斑马鱼受精卵为模型，用不同浓度的枸橼酸铁铵FAC干预，第4天进行茜素红染色并统计骨矿化面积，选择FAC最适干预浓度；显微镜下挑选发育至1-2细胞期的斑马鱼受精卵，注射不同浓度的带Flag标签的铁调素mRNA，注射卵置于含100μg/mL?FAC的培养液中，干预至第4天进行茜素红染色，得到铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型。近年来许多研究表明铁代谢与骨代谢之间存在相关性，而斑马鱼作为模型，优势在于其在受精后20天才有破骨细胞出现，故本模型能有效研究铁代谢对骨形成的影响。同时，目前市售铁调素价格较高、生产厂家较少且生物活性不确定，而本模型的铁调素来源于斑马鱼序列，生物活性较肯定。
【专利说明】铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学【技术领域】，具体涉及动物实验模型的构建方法，尤其涉及铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型构建方法。
【背景技术】
[0002]铁离子是人体必须的微量元素，具有重要的生物学功能。当血液中的铁离子超出转铁蛋白结合能力形成未被转铁蛋白结合的游离铁时，就会产生“铁过载”。临床上，为了便于研究铁过载与疾病的相关性，将血清铁蛋白大于1000 μ g/L定义为“铁过载”。铁过载常见于血色病、地中海贫血以及镰刀形细胞贫血等疾病。近些年有研究发现，一部分绝经后女性体内存在铁蓄积，即血清铁蛋白水平大于正常高值300 μ g/L，但小于1000 μ g/L。同时有学者认为绝经后女性体内的铁蓄积与绝经后骨质疏松的发病相关。近年来越来越多的研究显示铁代谢与骨代谢之间有着密切的关系，2012年美国Huang在Endocrinology和Gene上报道铁在离体环境中对骨代谢的影响；同时临床研究也显示铁代谢与骨代谢的关联，2012年，韩国一项回顾性队列研究中，针对健康体检的940名绝经女性进行了为期三年的随访，发现在正常人群当血清铁蛋白水平升高时，骨量呈剂量一致性的丢失加速。目前已有采用枸橼酸铁铵FAC干预实验动物，形成相关的铁过载模型。斑马鱼作为模型，优势在于其骨结构、骨细胞、基质蛋白及分子信号通路与人类具有高度相似的相似性，同时其在受精后20天破骨细胞才出现，故斑马鱼早期是研究骨形成的良好模型。
[0003]美国专利(申请)US N0.:US2010/0204122A1 “铁调素治疗围绝经期和绝经后骨质疏松症” 2012年8月12日，该专利首次将铁调素与骨质疏松症联系起来，明确提出铁调素可以有效降低体内铁水 平，从而改善围绝经期和绝经后女性铁蓄积引起的骨质疏松。但目前市售铁调素仅一家日本生物公司有生产，价格昂贵、生物活性存在争议，且不宜保存，一旦开封后十分容易变质，故该市售铁调素不能广泛应用于基础及临床研究。
[0004]现尚未有较为理想的铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题于克服上述现有技术的缺点，提供一种成本低，模型性能稳定，适用性广的铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型的构建方法。
[0006]为了达到上述目的，本发明的技术方案是:铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型的构建方法，包括以下步骤:
[0007](I)将受精小于2小时的斑马鱼胚胎，置于枸橼酸铁铵FAC溶液中，采用静水式换水补药法培养至第4天，茜素红染色统计骨形成面积，以此确定枸橼酸铁铵FAC的干预浓度；
[0008](2)提取斑马鱼RNA反转录成cDNA,根据斑马鱼铁调素hepcidin基因全长,设计扩增全编码区引物，将此扩增的hepcidin全长序列与pcDNA3.1 (+)Flag载体进行连接,构建成 pcDNA3.1 (+)Flag-hepcidin 表达质粒；[0009](3)取构建好的表达质粒pcDNA3.1 (+)Flag_hepcidin,在体外转录成带帽的h印cidin-Flag mRNA,显微镜下对受精卵进行mRNA注射；
[0010](4)将步骤(3)的注射卵置于枸橼酸铁铵FAC溶液中，采用静水式换水补药法培养至第4天，茜素红染色统计骨形成面积，得到铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型。
[0011]本发明的一优选技术方案，所述步骤(1)中，FAC干预浓度为50-100 μ g/mL。
[0012]本发明的一优选技术方案，所述步骤⑴和步骤⑷中，FAC最适干预浓度为100 μ g/mL。
[0013]本发明的一优选技术方案，所述步骤(2)中，扩增h印cidin基因全长的上游引物为:GGTACCCATCATCATCATCCTCC，下游引物为:CTCGAGGAATTTGCAGCAGTATCCGC。
[0014]本发明的一优选技术方案，所述步骤(3)中，显微镜下挑选发育至1-2细胞期的受精卵，对其进行hepcidin-Flag mRNA注射。
[0015]本发明中相关术语的说明及解释 [0016]根据本发明，术语“骨质疏松”是指是骨代谢过程中骨吸收和骨形成的偶联出现缺陷，体内的钙磷代谢不平衡，使骨密度逐渐减少而引起的症状。
[0017]根据本发明，术语“骨形成”是成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。术语“铁调素”是一种肝细胞产生的小分子多肽，在维持机体铁稳态中发挥关键性作用。术语“枸橼酸铁铵”又名柠檬酸铁铵，是铁、氨和柠檬酸的复合盐，一般用作补血剂，可配制补血液剂或糖浆，亦可用于上腹部MR快速成像及在磁共振胆胰管成像。
[0018]根据本发明，术语“骨钙素”又称骨Y-羧谷氨酸包含蛋白(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins),是成骨细胞合成并分泌的，比较稳定，不受骨吸收因素的影响。该蛋白在骨矿化峰期之后才出现积聚。通过血清骨钙素可以了解成骨细胞，特别是新形成的成骨细胞的活动状态，也是常用的检测骨形成的生化指标。术语Runx2是转录因子Runxx相关基因(runt-related gene, Runxx)家族成员之一,是骨细胞的特异转录因子，对骨组织的形成和重建起着重要作用。
[0019]本发明的有益效果是:该发明以斑马鱼为模型，由于其骨结构、骨细胞、基质蛋白及分子信号通路与人类具有高度的相似性，且受精后20天才有破骨细胞出现，故本模型能有效研究铁代谢对骨形成的影响。同时，市售铁调素价格较高、生产厂家少且生物活性不确定，故该市售铁调素不能广泛应用于基础研究。本模型中的铁调素来源于斑马鱼序列，生物活性确定，制备简单易行，为铁调素治疗高铁抑制骨形成提供了良好的研究模型。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
[0021]图la，Ib为不同浓度FAC对斑马鱼骨矿化的影响，与对照组相比，#P〈0.05，与FAC组相比，*P〈0.05。
[0022]图2为外源铁调素蛋白表达情况。
[0023]图3B，3C, 3D为不同浓度铁调素对铁抑制骨形成的缓解作用斑马鱼骨矿化组织解剖图。与对照组相比，#P<0.05，与FAC组相比，*Ρ〈0.05。
[0024]图4为不同浓度铁调素对铁抑制骨形成的缓解作用示意图。与对照组相比，#Ρ<0.05，与 FAC 组相比，*Ρ〈0.05。[0025]图5a为不同浓度铁调素对铁抑制成骨基因骨钙素(bglap)a表达的缓解作用，图5b为不同浓度铁调素对runx2a表达的作用。
【具体实施方式】
[0026]为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
[0027]一.仪器、材料
[0028]本发明的野生型斑马鱼取自苏州大学生物钟研究中心。按照Zebrafish Book的描述进行饲养和产卵。枸橼酸铁铵(购自Sigma公司)，茜素红染料(购自Sigma公司)，引物由苏州金唯智公司合成，pcDNA3.1 (+)Flag载体-由苏州大学生物钟研究中心提供。限制性内切酶Kpn I和Xho I购自NEB公司。rTaq DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自大连宝生物工程(Takara)公司。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自TIANGEN公司。体外转录试剂盒(T7mMESSAGE mMACHINE kit)购自Amb1n公司。鼠抗Flag单克隆抗体购自earthOX公司，抗鼠IgG-HRP抗体购自Abgent公司。
[0029]PCR扩增仪(ABI公司，System9700)，高速冷冻离心机(贝克曼库尔德公司，Beckman Avanti J-30I)，电泳仪(B1-Rad 生物公司，PowerPPAC200)，细胞培养箱(HealForce, HF100)，倒置相差显微镜(Olympus公司，CKX31)，超净工作台(苏净集团安泰公司，Sff-CJ-1F) 96 孔板(Corning 生物公司)， [0030]二.模型建立方法
[0031]将受精小于2小时的斑马鱼胚胎，置于含不同浓度枸橼酸铁铵FAC(10、25、50、100 μ g/mL)的培养皿中，每个浓度组设3个重复，每盘随机放胚胎30个。采用静水式换水补药法，每隔12h全部换试液，使FAC保持初始浓度，并于第四天茜素红染色统计骨形成面积，选择FAC的最适干预浓度。
[0032]提取斑马鱼RNA，反转录成cDNA，根据Ensembl数据库提供的斑马鱼hepcidin基因全长(ENSDART00000075235)，设计扩增全编码区引物，上游引物为:GGTACCCATCATCATCATCCTCC (Seq N0.1)，下游引物为:CTCGAGGAATTTGCAGCAGTATCCGC (SeqN0.2)，将PCR扩增的hepcidin全长序列及pcDNA3.1 (+) Flag载体同时用限制性内切酶Kpn I和Xho I进行酶切，电泳切胶回收后，用T4连接酶进行连接，构建成pcDNA3.1 (+)Flag-hepcidin 表达质粒。
[0033]取构建好的表达质粒pcDNA3.1 (+) Flag-hepcidin,用限制性内切酶Apa I进行单酶切，对单酶切产物电泳切胶回收纯化。参照Amb1n公司体外转录试剂盒说明，用T7启动子体外转录生成hepcidin mRNA,纯化回收,溶于15 μ L DEPC水中，测定浓度。
[0034]收集自然交配的胚胎，选取发育至1-2细胞期的受精卵，显微注射入所构建的hepcidin-flag mRNA,浓度为0、50、250、500ng/ μ L(以酚红作为指示剂)。同时以仅注射等浓度酚红组作为对照。挑选注射不同浓度hepcidin mRNA的斑马鱼受精卵，置于含100 μ g/mL枸橼酸铁铵的培养皿中，每个浓度组设3个重复，每盘随机放胚胎30个。采用静水式换水补药法，每隔12h全部换试液，使FAC保持100 μ g/mL，第4天用茜素红染色统计骨形成面积，得到铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型。[0035]三.模型建立的评价方法与结果
[0036](一 )评价指标
[0037]1.骨骼染色
[0038]用2%的甲醛溶液固定斑马鱼Ih后，用100mMol/L Tris及1mMoVLMgCl2混合液冲洗，随后用3% H2O2A).5% KOH进行漂白，接着置于0.01%茜素红染液中进行骨染色，12h后取出放入甘油中脱色，最后将染色后的斑马鱼置于显微镜下观察照相。
[0039]2.Real-time PCR
[0040]采用Primer3软件设计用于Real-time PCR实验的引物，骨钙素上游序列为5’ -TGACTCCTCAGATACTAAAC-3’ (Seq N0.3)，下游序列为 5’ -AGCCCTCTTCTGTCTCAT-3 ’ (SeqN0.4)。Runx2a 上游序列为 5’ -GACTCCGACCTCACGACAA-3’ (Seq N0.5)，下游序列为5 ’ -CGTCCCGTCAGGAACATC-3 ’ (Seq N0.6)。提取斑马鱼第四天的 mRNA，逆转录为 cDNA，以此cDNA为模板进行Real-time PCR实验，β -actin做为内参对照上游序列为:ACGAACGACCAACCTAAACTCT (Seq N0.7)，下游序列为:TTAGACAACTACCTCCCTTTGC(Seq N0.8).每个样品重复3次。
[0041]3.统计学方法
[0042]使用Λ AcT法分析，基因的相对表达量=2-Λ AcT。AAcT= AcT(实验组)-AcT(对照组)，Λ cT = cT (目的基因)-cT (内参基因)。每个样本设3组生物学重复,每组生物学重复设3个技术重复。用Microsoft Excel分析工具t_test分析基因表达差异的显著性，P < 0.0 5表示差异有统计学意义。
[0043]( 二 )结果
[0044]1.1铁抑制斑马鱼骨骼矿化
[0045]将刚受精的斑马鱼胚胎立即放入含有不同浓度FAC培养液(10、25、50、100μ g/mL)中。结果发现，斑马鱼头部骨形成面积随FAC浓度的增加而降低(图la)。与对照组相t匕，当FAC浓度为50 μ g/mL及100 μ g/mL时，差异具有统计学意义(P〈0.05)(图1b)。由图1可见，与空白对照组相比，100 μ g/mL浓度FAC干预组的斑马鱼头部矿化骨骼少且着色较浅，提示FAC可抑制斑马鱼头部骨骼的钙盐沉积。考虑到100 μ g/mL浓度组对骨形成抑制作用最显著，后续实验中FAC干预浓度均选择100 μ g/mL。
[0046]1.2铁调素-Flag蛋白表达水平的检测
[0047]为证明显微注射入斑马鱼受精卵的铁调素mRNA能顺利转录成铁调素蛋白，本研究收集受精注射后第1、2、3天的注射胚胎,用BCA法统一蛋白浓度,采用western blot检测外源铁调素的表达情况。结果显示，注射第一天时，外源铁调素在斑马鱼体内高表达，随后表达量随时间逐渐减少，第三天则无法检测到外源铁调素的表达(图2)。第一行条带显示说明显微注射的带Flag标签铁调素mRNA在斑马鱼受精卵内被有效翻译成铁调素蛋白，且随时间逐步降解至完全。图2中的1、2、3标号是指受精注射后第1、2、3天。空心三角表示非特异性条带。tubulin是指微管蛋白，是一种组成型蛋白，常用作内参。
[0048]1.3铁调素缓解铁对骨形成的抑制作用
[0049]将注射了不同浓度的带？1&8标签铁调素1111?應(0、50、250、500叩/^1^)斑马鱼胚胎放入含有100 μ g/mL FAC培养液中干预至第4天。结果发现，随着铁调素注射浓度的增加，可逐步缓解高铁干预后对斑马鱼骨形成的抑制作用。与FAC干预组相比，当铁调素注射浓度为250ng/ μ L及500ng/ μ L时，差异具有统计学意义(Ρ〈0.05)(图3Β)。故选择250ng/μ L及500ng/y L浓度组用于后续定量实验。
[0050]1.4检测成骨细胞相关基因的表达
[0051]为进一步探究FAC及铁调素处理后对斑马鱼成骨细胞功能的影响，实验中检测成骨细胞骨钙素基因(bglap)和runx2a基因的表达情况。实时定量PCR结果提示，与空白对照组相比，FAC干预的斑马鱼成骨细胞bglap及runx2a的表达量均显著降低,注射250ng/μ L及500ng/ μ L铁调素后，bglap及runx2a的表达量较FAC干预组均有所上调，差异均有统计学意义(P〈0.05)。当铁调素浓度为SOOng/yL时，bglap及runx2a的表达量与空白对照组相比无明显差异(p>0.05)(图5a、5b)。
[0052]上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修 饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型的构建方法，包括以下步骤: (1)将受精小于2小时的斑马鱼胚胎,置于枸橼酸铁铵FAC溶液中,采用静水式换水补药法培养至第4天，茜素红染色统计骨形成面积，以此确定枸橼酸铁铵FAC的干预浓度； (2)提取斑马鱼RNA反转录成cDNA，根据斑马鱼铁调素h印cidin基因全长，设计扩增全编码区引物，将此扩增的hepcidin全长序列与pcDNA3.1 (+)Flag载体进行连接,构建成pcDNA3.1 (+) Flag-hepcidin 表达质粒； (3)取构建好的表达质粒pcDNA3.1 (+)Flag-hepcidin,在体外转录成带帽的h印cidin-Flag mRNA,显微镜下对受精卵进行mRNA注射； (4)将步骤(3)注射卵置于枸橼酸铁铵FAC溶液中，采用静水式换水补药法培养至第4天，茜素红染色统计骨形成面积，得到铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，FAC干预浓度为50-100 μ g/mL。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(4)中，FAC最适干预浓度为100 μ g/mL。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，扩增h印cidin基因全长的上游引物为:GGTACCCATCATCATCATCCTCC，下游引物为:CTCGAGGAATTTGCAGCAGTATCCGC。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，显微镜下挑选发育至1-2细胞期的受精卵，对其进行hepcidin-Flag mRNA注射。
【文档编号】C12N5/10GK104031885SQ201410114206
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】陈斌, 徐又佳 申请人:徐又佳