一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，以及包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌。本发明还公开了无乳链球菌口服疫苗。本发明乳链球菌口服疫苗，以口服方式接种免疫，对罗非鱼的保护率高，给药方便，操作简单，免疫应激反应小，安全，应用前景优良。
【专利说明】一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种无乳链球菌的口服疫苗。
【背景技术】
[0002]无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)也称 B 组链球菌(group Bstreptococci, GBS),属于链球菌科(Streptococcaceae),链球菌属(Streptococcus),是一种兼性的革兰氏阳性球菌，按其荚膜多糖抗原性的不同，可分为10种血清型(la、lb、
II~VIII型)，其是引起罗非鱼链球病菌的主要致病菌。
[0003]近年来在广东、海南、福建等罗非鱼主产区大规模的爆发罗非鱼链球菌病，波及范围广，病害控制难，给养殖户带来了巨大的经济损失。发病鱼表现为精神、食欲很差，体色发黑，离群打转游动，部分病鱼出现晶状体混浊，眼球突出甚至脱落的现象；疾病的发病率接近40%，死亡量与气温呈现明显的正相关性，气温在35°C以上时发病鱼的死亡率可高达100%，养殖户的损失惨重，据不完全统计，2009年该病对华南地区罗非鱼养殖造成的经济损失高达7亿人民币。据调查，罗非鱼病害往年已有发生，然而往年都能以氟苯尼考等药物很快控制，但近年来的病害来势凶猛，因耐药性等原因，药物控制效果差，养殖户损失惨重。“罗非鱼”作为海南人工养殖首要鱼种，若不能有效地预防和控制疾病的发生及蔓延，海南将面临“无鱼可养”的局面。因此，安全有效的治疗方式对于拯救海南罗非鱼养殖业显得迫在眉睫，疫苗免疫不会产生耐药性，是一种安全、有效、环保的方法。
[0004]目前，常见的无乳链球菌疫苗有灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等，其中，全菌疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗多用腹腔注射，DNA疫苗以肌肉注射方式接种为主。一般来说，腹腔或肌肉注射易于控制剂量，免疫应答效果较好，但是鱼体的应激反应大，伤口易发生二次感染。口服免疫的操作简单，鱼体的应激反应小，但是，将现有的无乳链球菌疫苗以口服方式免疫，免疫效果非常弱，难以起到保护作用。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种无乳链球菌口服疫苗，其由包含SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列的减毒沙门氏菌制备而成。
[0006]本发明首先提供了 SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0007]本发明还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0008]优选地,所述重组载体为重组pVAXl载体。
[0009]本发明还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。
[0010]优选 地，所述重组菌为重组减毒沙门氏菌。进一步优选地，所述重组减毒沙门氏菌为重组减毒沙门氏菌SL7207。
[0011]本发明还提供了前述序列、重组载体或重组菌在制备无乳链球菌口服疫苗中的用途。
[0012]本发明无乳链球菌口服疫苗，它是由前述序列、重组载体或重组菌和药学上可接受的辅料或者载体制备而成。
[0013]本发明还提供了前述口服疫苗在制备预防无乳链球菌病的药物中的用途。优选地，所述的无乳链球菌病为罗非鱼无乳链球菌病。
[0014]本发明制备得到了一种可以口服接种的无乳链球菌疫苗，将其用拌料的方式免疫接种罗非鱼，获得的最高抗体效价为1:16，最高相对保护率可达63%，可以有效保护罗非鱼免受无乳链球菌感染，给药方便，操作简单，免疫应激反应小，安全，应用前景优良。
[0015]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0016]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0017]说明书附图
[0018]图1无乳链球菌的sip基因的PCR扩增结果。M:DNA Maker (2000)，1:sip基因扩增产物。
[0019]图 2pVAXl-sip 酶切和 PCR 鉴定。M:DNA Maker (10000) , I:DH5 a (pVAXl-sip)菌落 PCR 鉴定,2:pVAXl_sip/BamH I +Hind III，3pVAXl_sip/BamH I。
[0020]图 3 重组菌 16S rDNA 鉴定。M:DNA Maker (2000) , I:SL7207 (pVAXl),2:SL7207(pVAXl-sip)。
[0021]图 4SL7207 (pVAXl)酶切鉴定。M1:DNA Maker (2000) , M2:DNA Maker (10000)，I:SL7207(pVAXl)/BamH I , 2: SL7207 (pVAXl)/BamH I +Hind III。
[0022]图 5SL7207 (pVAXl-sip)酶切和 PCR 鉴定。Ml:DNA Maker (2000), M2:DNA Maker(10000)，1:SL7207 (pVAXl-sip)/BamH I，2: SL7207 (pVAXl-sip)/BamH I +Hind III，3:SL7207(pVAXl-sip)菌落 PCR 鉴定。
[0023]图6重组菌生长曲线。
[0024]图7重组菌SL7027 (pVAXl-sip) 口服免疫罗非鱼后组织细菌计数。
[0025]图8免疫后第7天，罗非鱼肝脏、脾脏、肠道分离菌株的特异性PCR鉴定。M1 =DNAMaker (2000)，1:肝样，2:脾样，3:肠道样，4:sip阳性对照。
[0026]图9免疫后7天罗非鱼肝脏、脾脏、肠道分离菌抽提质粒pVAXl-sip的酶切鉴定。M1:DNA Maker (2000), M2:DNA Maker (10000)，1、2:肝样;3、4:脾样;5、6:肠样；7:sip 阳性对照。
[0027]图10检测流程图
[0028]图11ELISA检测经三次灌胃免疫接种的罗非鱼血清特异性抗体每个柱形代表在血清稀释度为1:16时，0D450下的吸光度。各试验组的抗体应答水平与PBS组对比，并进行了统计学分析，SE (N=3)，#P〈0.01。
[0029]图12ELISA检测经三个免疫疗程拌料免疫接种的罗非鱼血清特异性抗体每个柱形代表在血清稀释度为1:16时，0D450下的吸光度。各试验组的抗体应答水平与PBS组对比，并进行了统计学分析，SE (N=3)，**P〈0.01，*Ρ〈0.05。
[0030]图13灌胃接`种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼只进行了一次免疫。
[0031]图14灌胃接种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼进行了两次免疫。[0032]图15灌胃接种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼进行了三次免疫。
[0033]图16拌料接种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼只进行了一个流程免疫。
[0034]图17拌料接种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼进行了两个流程免疫。
[0035]图18拌料接种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼进行了三个流程免疫。
【具体实施方式】:
[0036]实施例1本发明口服疫苗的构建
[0037]—、目标基因片段的克隆
[0038]1.1 方法
[0039]将无乳链球菌用BHI肉汤培养至指数期，离心收集菌体用细菌DNA提取试剂盒收集提取无乳链球菌细菌DNA，PCR扩增分别获得大量sip基因。
[0040]Sip基因上下游引物为
[0041]sip 上游引物:5’ - GGATCC ACCATGG CTGCCACTTCAATGAAA-3’(下划线为添加的BamH I酶切位点，粗体为Kozak序列)
[0042]sip 下游引物:5’ -AAGCTTTTATTTGTTAAATGATACGTG-3，(下划线为添加的 Hind III酶切位点)
[0043]PCR 反应体系:上下游引物各 1μ I ；Mixl2.5μ I ;DNA 模板 I μ I ；ddH209.5 μ L.反应条件:95°C预变性5min，94°C 50s, 55 °C 30s, 72 °C lmin，共30个循环，最后72°C延伸IOmin0取5μ I反应产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统检测扩增结果。收集PCR扩增产物，胶回收，获得纯化基因片段。
[0044]将纯化的目的基因与PMD19-T载体连接，转入DH5 α。通过Amp平板筛选，PCR和单双酶切鉴定后，筛选获得pMD19-T-Sip重组转化细菌。
[0045]1.2 结果
[0046]提取的无乳链球菌GBS基因组，根据所设计的PCR引物，经高保真DNA聚合酶扩增，得一条大小约为1000bp的目的片段，与预期结果一致(图1)，经过测序，得其核苷酸序列如下:
【权利要求】
1.SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.一种重组载体，其特征在于:它包含SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为重组pVAXl载体。
4.一种重组菌，其特征在于:它包含权利要求2或3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于:所述重组菌为重组减毒沙门氏菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于:所述重组减毒沙门氏菌为重组减毒沙门氏菌SL7207。
7.权利要求4~6所述重组菌在制备无乳链球菌口服疫苗中的用途。
8.一种无乳链球菌口服疫苗，其特征在于:它是由权利要求4~6任意一项所述重组菌和药学上可接受的辅料或者载体制备而成。
9.权利要求8所述的口服疫苗在制备预防无乳链球菌病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于:所述的无乳链球菌病为罗非鱼无乳链球菌病。
【文档编号】C12N15/31GK103834669SQ201410121138
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】刘天强, 肖丹, 汪开毓, 黄凌远, 黄冠军, 阳涛 申请人:通威股份有限公司