一种促进兰花生长和防病的方法
【专利摘要】本发明为一种促进兰花生长和防病的方法，涉及一种在防治病害的同时，还能促进兰花发枝、延长花期的方法。本发明在兰花分株移植时，按哈茨木霉T216制备的孢子浓度为1×107-1×108个孢子/g的固态培养物与培养基质1:50的质量比，将二者混匀装盆，再栽入兰花植株，在兰花生长期间，该固态培养物可诱导兰花植株对白绢病、立枯病、炭疽病等真菌性病害及欧氏杆菌引起的细菌性软腐病的抗性，减少植株发病率，降低病情指数；并促进兰花提早发枝，增加兰花的叶片数。此外，本发明研究发现在兰花初现花苞时，将哈茨木霉T216的液态培养物调节成1×105-1×107个孢子/mL的浓度，对兰花植株进行喷雾处理，可增加兰花的花枝数及延长兰花的花期。
【专利说明】一种促进兰花生长和防病的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于促进兰花生长和防病的栽培【技术领域】，涉及一种哈茨木霉T216在防治兰花病害的同时，还能促进兰花发枝、延长花期的方法。
【背景技术】
[0002]兰花紫茎绿叶，四季常青，叶姿清雅潇洒，开花清香幽远，更因高洁、典雅的气质名列百花之冠，为世人广为栽培。在人工条件下栽培，选择合适的栽培基质非常重要。国内外用于兰花栽培植料一般由天然矿物、田园土壤、工农业有机无机废弃物的单质或混合(复合体)，它基本具备了水、肥、汽、热等类似于自然土壤可供植物生长的肥力特性。目前，人工配制的栽培基质也越来越多地应用到兰花栽植中，其中常用的基质材料主要有以下几种:兰石，浮石，蛭石，蛇木，陶粒，炉渣，木炭，水苔，树皮，珍珠岩，木屑，花泥，松针，腐叶，稻壳，椰糠，泡沫塑料或泥炭，这些培养基质能提供兰花生长养分供应需要。但兰花在生长过程中常会受到病原真菌、细菌及病毒等微生物的为害，从而引起兰花产生腐烂、发锈、猝倒、枯萎、溃疡、炭疽、痂斑、斑点等症状，严重影响兰花的生长和品质。据统计，仅为害兰花的病原真菌就约有30余属100多种。常见的为:引起炭疽病的刺孢盘属(Collectotrichum),引起白絹病的小核菌属(Sclerotium),引起花果枯萎病的葡萄孢属(Botrytis),引起黑腐病或心腐病的疫霉属(Phytophthora),引起叶斑病或枯萎病的镰刀菌属(Fusarium),以及引起锈病的夏孢锈菌属(Uerdo)、鞘锈菌属(Coleosporium)等。而现有的普通培养基质自身还不具有防病杀菌的功效。
[0003]目前兰花病害多采用化学药剂防治，常引发①农药使用过量，引起兰花药害；②对侵染病原菌判断不准确，不能对症下药错过防治适期，防治效果低；④长期单一使用杀菌剂，使病原菌产生抗药性；⑤污染环境等问题。目前也有一些采用物理、生物等方法防治兰花的研究报道，如用一定浓度的食醋防治兰花的黑斑病和白粉病等，这也存在防治适期不易掌握及防治效果偏低的缺点。此外，兰花多采用鳞茎分株的方法进行扩繁种植，若未做好栽植基质和种茎消毒，病害也会很快传播蔓延。因此，探索出一种适合于兰花病害防治，而且同时又能促进兰花生长的方法是目前兰花栽培【技术领域】急需解决的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对兰花人工栽培中，常受真菌性及细菌性病原菌侵染为害，但现有防治方法存在诸多缺陷的情况，提供一种在防治病害的同时，还能促进兰花发枝、延长花期的方法。
[0005]本发明的目的是通过以下方式实现的:
[0006]一种促进兰花生长和防病 的方法，应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾，促进兰花的发枝，延长花期，减少病害的发生。
[0007]上述方法中优选在兰花以球茎分株移栽时，应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀作为移栽栽培基质；在兰花现苞时，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾。
[0008]上述方法中所述的木霉菌是保藏编号为CCTCC NO:M207141的哈茨木霉(Trichoderma harzianum) T216。
[0009]上述方法中所述的木霉菌的固态培养物的培养过程为:
[0010]配制稻麸粉固体培养基，用水拌湿，分装，灭菌冷却；在无菌条件下，接入木霉菌的种子菌，24-26°C培养，经常摇动瓶体，待木霉菌丝长满培养基并产生大量绿色分生孢子后，倒出，摊开粉碎阴干，过40目筛，此时孢子浓度为I X IO8-1 X IO9个孢子/g，加珍珠岩将孢子浓度调节为I X IO7-1 X IO8个孢子/g，得到固态培养物。
[0011]上述方法中兰花移植时，按固态培养物与栽培基质1:50的质量比，将二者混匀装盆，再栽入兰花植株即可。
[0012]上述方法中所述的稻麸粉固体培养基是每1000g培养基中含麦麸500g，米糠450g,玉米粉 30g, (NH4)2SO4IOg,葡萄糖 IOg0
[0013]上述方法中木霉菌液态发酵培养物按如下方法获得:发酵罐发酵:按体积比10%的接种量将种子菌接入发酵罐培养基中，进行发酵，发酵控制参数为:温度控制，分为两个阶段，发酵第一阶段(菌体培养阶段):0-72小时，26-28°C，发酵第二阶段(代谢产物产生阶段):72-200 小时，23-25°C;通气量(V/V):0-20 小时:1:0.6 ;20_40 小时:1:0.8 ;40_80 小时:1:1.2 ；80小时以后:1:0.6 ;搅拌速度:250-300rpm ;整个发酵过程pH值控制为6.5-6.8 ；发酵完成后将发酵醪用氢氧化钠溶液调至PH为7.5，闷罐过夜，过滤，即可。
[0014]上述方法中发酵罐培养基:1.5-2.0%麦麸汁液，0.5-1.0%葡萄糖，2.0-3.0%玉米粉，1.0-2.0% 酵母膏，0.1-0.5%CaC03, 0.01-0.03%MgS04.7H20,0.5-0.8%KH2P04 和 K2HPO4, pH值为6.5-6.8，余量为水，所述 百分比均为重量百分比；通入蒸汽达121°C灭菌30分钟；其中麦麸汁液为每200g麦麸加水1000mL的浸溃液。
[0015]上述方法中种子菌的培养:培养基配方:可溶性淀粉30g,葡萄糖20g,蛋白胨5g,KH2PO4Ig, MgSO4.7Η200.5g, CaCO30.25g, (NH4) 2S042g, 7jC 1000mL, pH6.9，分装于 500mL 三角瓶中，装液量为200mL，经115°C灭菌20分钟；在无菌条件下，将培养于PDA试管斜面培养基上的哈茨木霉T216菌株接入三角瓶中，于27± I°C的培养温度，150转/分的转速条件下，培养60小时，获到制备的种子菌。
[0016]上述方法中在兰花初现花苞时，将液态发酵培养物用水调节成I X IO5-1 X IO7个孢子/mL的浓度，对兰花植株进行喷雾处理，优选I X IO6个孢子/mL。
[0017]本发明的有益效果:
[0018]1、本发明首次提出了一种促进兰花生长和防病的方法，现有技术中多采用化学杀菌剂对兰花进行防病，往往造成环境污染、引起兰花药害、使病原菌产生抗药性等一系列问题；即便偶尔应用物理、生物等防治方法，也会出现防治适期不易掌握及防治效果偏低的缺点，更没有在防病的同时还能促进兰花生长的制剂或者方法出现；可以说目前几乎没有关于达到兰花病害生物防治以及促进兰花生长，延长花期共同效果的研究报道。
[0019]2、本发明应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾，能有效减少病害的发生，促进兰花的发枝，延长花期。
[0020]3、本发明优选在兰花移栽时，应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀，优选在兰花现苞时，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾，通过大量的研究表明，选择在合适的时间，以及合适的处理方式能够进一步体现本发明的效果和优势。
[0021]4、本发明优选木霉菌是保藏编号为CCTCC NO:M207141的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)T216。该木霉菌有抗化学杀菌剂的优势，在兰花栽培过程中如果使用了其他的化学杀菌剂，则能有效防止其对该木霉的杀灭作用，保证木霉菌的存活和防病、促进生长功倉泛。
[0022]5、本发明研究发现在兰花分株移植时，在常用的栽培基质中按孢子浓度为
IX IO7-1 X IO8个孢子/g的固态制剂与培养基质1:50的质量比，将二者混匀装盆，再栽入兰花植株，在兰花生长期间，该固态培养物可诱导兰花植株对白絹病、立枯病、炭疽病等真菌性病害及欧氏杆菌(Erwinia)引起的细菌性软腐病的抗性，减少发病率，降低病情指数；并促进兰花的新叶提早发枝，增加兰花的叶片数。
[0023]6、本发明研究发现在兰花初现花苞时，将液态培养物调节成I X IO5-1 X IO7个孢子/mL的浓度，优选I X IO6个孢子/mL的浓度，对兰花植株进行喷雾处理，可增加兰花的花枝数及延长的花期。
[0024]本发明涉及的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)T216
[0025]保藏日期:2007年9月7日
[0026]保藏单位名称:中国典型培养物保藏中心
[0027]保藏单位简称:CCTCC
[0028]保藏号为:CCTCCN0.M207141
[0029]保藏地址:中国.武汉.武汉大学。
【具体实施方式】
[0030]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0031]实施例1制备实施例
[0032](I)母种的保存:哈茨木霉(Trichoderma harzianum)突变型菌株T216采用试管PDA斜面培养基培养；
[0033](2)种子菌的培养:培养基配方:可溶性淀粉30g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2P04lg，MgSO4.7Η200.5g, CaCO30.25g, (NH4) 2S042g，水 1000mL, ρΗ6.9，分装于 500mL 三角瓶中，装液量为200mL，经115°C灭菌20分钟。在无菌条件下，将培养于PDA试管斜面培养基上的哈茨木霉T216菌株接入三角瓶中，于27± 1°C的培养温度，150转/分的转速条件下，培养60小时，获到制备的种子菌。
[0034](3)T216菌株固态培养物的制备:配制稻麸粉固体培养基:每1000g培养基中含麦麸500g，米糠450g，玉米粉30g，(NH4) 2S0410g,葡萄糖10g，加水至培养基含水量为70_80%，分装于罐头瓶中，灭菌冷却；在无菌条件下，接入种子菌，24-26°C培养，经常摇动瓶体，待木霉菌丝长满培养基并产生大量绿色分生孢子后，倒出，摊开粉碎阴干，过40目筛，孢子浓度一般为I X IO8-1 X IO9个孢子/g，再加入珍珠岩将孢子浓度调节为I X IO7-1 X IO8个孢子/g，即为T216菌株固态培养物。
[0035](4)T216菌株液态培养物的制备:配制发酵罐培养基:1.5_2.0%麦麸汁液，
0.5-1.0% 葡萄糖，2.0-3.0% 玉米粉，1.0-2.0% 酵母膏。0.1-0.5%CaC03, 0.01-0.03%MgS04.7H2O, 0.5-0.8%KH2P04和K2HPO4, pH值为6.5-6.8，余量为水(所述百分比均为重量百分比);通入蒸汽达121°C在位灭菌30分钟。按10% (V/V)的接种量将三角瓶中培养的种子菌接入发酵罐，进行控制发酵，发酵控制参数为:温度控制，分为两个阶段，发酵第一阶段菌体培养阶段0-72小时，26-28°C，发酵第二阶段代谢产物产生阶段72-200小时，23_25°C ;通气量(V/V):0-20 小时:1:0.6 ；20-40 小时:1:0.8 ;40_80 小时:1:1.2 ；80 小时以后:1:0.6 ;搅拌速度:250-300rpm ;发酵全过程pH值控制在6.5-6.8 ;发酵醪用氢氧化钠溶液调pH为7.5，闷罐过夜，灭菌纱布真空过滤，密封包装，即成T216菌株液态培养物。
[0036]实施例2应用实施例①
[0037]应用按照实施例1方法制备的T216固态培养物(以下称T216固态菌剂，孢子浓度为I X IO7个孢子/g)进行兰花栽培试验，该实验是在长沙市马坡岭湖南省园艺研究所兰花栽培园进行。在兰花(建兰)分株移植时，在常用的栽培基质中按T216固态菌剂与培养基质1:50的质量比，将二者混匀装盆，再移入兰花植株，按常规方法管理，30d、120d后调查每盆兰花所生新苗。120d后调查植株发病情况，每株如有一片及一片以上叶片有明显病害症状，就算为发病株。试验结果如表1所示。
[0038]表1木霉T216固态制剂对兰花防病促生长的效果
【权利要求】
1.一种促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾，促进兰花的发枝，延长花期，减少病害的发生。
2.根据权利要求1所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，在兰花以球茎分株移栽时，应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀，在兰花现苞时，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾。
3.根据权利要求2所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，所述的木霉菌是保藏编号为 CCTCC NO:M207141 的哈茨木霉(Trichoderma harzianum) T216。
4.根据权利要求1或2或3所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，所述的木霉菌的固态培养物的培养过程为: 配制稻麸粉固体培养基，用水拌湿，分装，灭菌冷却；在无菌条件下，接入木霉菌的种子菌，24-26°C培养，经常摇动瓶体，待木霉菌丝长满培养基并产生大量绿色分生孢子后，倒出，摊开粉碎阴干，过40目筛，此时孢子浓度为1 X 108-1 X 109个孢子/g，加珍珠岩将孢子浓度调节为1 X10-1 X 108个孢子/g，得到固态培养物。
5.根据权利要求4所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，兰花移植时，按固态培养物与栽培基质1:50的质量比，将二者混匀，再栽入兰花植株即可。
6.根据权利要求4所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，所述的稻麸粉固体培养基是每1000g培养基中含麦麸500g，米糠450g，玉米粉30g，(NH4)2S0410g，葡萄糖10g。
7.根据权利要求1或2或3所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，木霉菌液态发酵培养物按如下方法获得:发酵罐发酵:按体积比10%的接种量将种子菌接入发酵罐培养基中，进行发酵，发酵控制参数为:温度控制，分为两个阶段，发酵第一阶段:0-72小时，26-28°C，发酵第二阶段=72-200 小时，23_25°C ;通气量(V/V):0-20 小时:1:0.6 ；20-40小时:1:0.8 ；40-80小时:1:1.2 ；80小时以后:1:0.6 ;搅拌速度:250-300rpm ;整个发酵过程PH值控制为6.5-6.8 ;发酵完成后将发酵醪用氢氧化钠溶液调至pH为7.5，闷罐过夜，过滤，即可。
8.根据权利要求7所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，发酵罐培养基:1.5-2.0% 麦麸汁液，0.5-1.0% 葡萄糖，2.0-3.0% 玉米粉，1.0-2.0% 酵母膏，0.1-0.5%CaC03,0.01-0.03%MgS04.7H20,0.5-0.8%KH2P04 和 K2HPO4, pH 值为 6.5-6.8，余量为水，所述百分比均为重量百分比；通入蒸汽达121°C灭菌30分钟；其中麦麸汁液为每200g麦麸加水1000mL的浸溃液。
9.根据权利要求4或7所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，种子菌的培养:培养基配方:可溶性淀粉30g,葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO4Ig, MgSO4.7Η200.5g，CaCO30.25g，(NH4)2S042g,水 1000mL, pΗ6.9，分装于 500mL 三角瓶中，装液量为 200mL,经115°C灭菌20分钟；在无菌条件下，将培养于PDA试管斜面培养基上的哈茨木霉T216菌株接入三角瓶中，于27± 1°C的培养温度，150转/分的转速条件下，培养60小时，获到制备的种子菌。
10.根据权利要求7所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，在兰花初现花苞时，将液态发酵培养物用水调节成1X 105-1X 107个孢子/mL的浓度，对兰花植株进行喷雾处理。
【文档编号】C12N1/14GK103875717SQ201410130978
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】魏林, 梁志怀, 张屹, 李丽辉, 李萌, 陈玉荣, 李卫东 申请人:湖南省植物保护研究所