一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法，杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌NBIN-863Bacillus?thuringiensis?NBIN-863，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日2013年11月29日、存活日期2013年11月29日，保藏中心编号CCTCC?NO：M2013612。培养方法，取安徽省九华山附近，东经117度29分,北纬30度39分的土壤，用无菌水悬浮，按梯浓度稀释涂平板，用LB固体培养基培养，稀释划线于LB平板上培养；单菌落接种到摇瓶中培养，与甘油混合，放冰箱保藏，单菌落转接到液体培养基中培养，涂片、结晶紫染色光学显微镜观察确定。
【专利说明】一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法。
【背景技术】
[0002]据FAO保守估计，全世界每年因线虫危害对粮食和纤维作物造成的损失大约为12%，对蔬菜、花生、烟草和某些果树造成的损失要超过20%，甚至达到50%。据权威专家报道，植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约1500亿美元。我国每年因线虫造成的损失大约35亿美元。
[0003]目前对植物有害的线虫约有3000多种，而在我国发现的有40多种，其中对作物危害最严重的线虫之一是根结线虫。根结线虫虫体微小，生活在植物体内或土壤中，会随着雨水、劳事操作及病株的转移而转移，防治极为困难。
[0004]防治植物寄生线虫病害的主要方法有化学防治和生物防治。化学药剂大部分为剧毒药物，严重污染环境。生物防治是利用线虫的天敌来控制虫口数量和限制线虫引起的损失，且对人、动物和环境均相对安全，应用前景广阔。生物防治中目前应用最广泛的是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),此外还有穿刺巴氏杆菌(Psteuriapenetrans)、假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)以及近年发现的坚强芽胞杆菌(Bacillus firmus)等。
[0005]早在1972年，Prasad等首先发现Bt β -外毒素对根结线虫(Root_knotnematode, RKN)的卵和幼虫有很高的活性。之后发现Bt β —外毒素对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、大豆胞囊线虫和酸酱线虫(Panagrellus redivivus)等线虫具有很高的杀虫活性(Ignoff et al., 1977;Devidas et al.，1988)。20 世纪 80 年代中期Bone等发现Bt库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)和以色列亚种(subsp.1sraelensis)对动物寄生线虫蛇形毛圆线虫(Trichostronglus colubriformis)的卵和幼虫有很高的杀虫活性，1988年美国Mycogen公司发现Bt晶体蛋白对根结线虫属(Meloidogynespp.)、矮化线虫属(Tylenchs spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)和滑刃线虫属(Aphlenchoides spp.)等植物。美国Mycogen公司筛选到很多对植物寄生线虫有杀虫活性的Bt菌株，同时也申请了专利。1993年我们初步筛选到9株对植物寄生线虫有杀虫活性的Bt菌株，这些Bt菌株对甘薯莖线虫(Ditylenchus destructor)、北方根结线虫(M.hapla)、和芒麻短体线虫(P.scribneri)有很高杀虫活性,其中已申请国家专利的菌株是 YBT-1532 (ZL00-1-16062.1)(余子全等，2007b)。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法。
[0007]本发明目的的实现方式为，一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌，苏云金芽胞杆菌NBIN_863Bacillu s thuringiensis NBIN-863,保藏单位:中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，保藏中心编号CCTCC NO:M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。
[0008]—种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的培养方法，具体步骤如下:
[0009]I)取安徽省九华山附近，东经117度29分，北纬30度39分位置的土壤样品lg，在实验室用Iml无菌水悬浮，按照10_3、10_4、10_5、10_6浓度进行稀释涂平板，用LB固体培养液28°C恒温培养箱中倒置培养24h，从平板上挑取单菌落再次稀释划线于LB平板上，28°C条件下培养24h ；
[0010]LB固体培养液配方:蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，琼脂粉20g，溶于IL蒸馏水中，121°C,30min,湿热灭菌；
[0011 ] 2 )将重复分离纯化到的单菌落接种到5ml LB液体培养基摇瓶中，28 °C，200rpm,培养 36h,
[0012]所述LB液体培养基配方:蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，溶于IL蒸馏水中，121°C,30min,湿热灭菌；
[0013]3)先用去离子水配置甘油，121°C湿热灭菌30min，水:甘油体积比=1:1 ；
[0014]4)将步骤2)培养了 36h后的500 μ I菌液与灭菌的500 μ 150%的甘油等体积混合，混匀后放于_80°C冰箱中保藏；
[0015]5)将从LB平板上分离纯化到的单菌落转接到LB液体培养液中，28°C，200rpm，培养48h后，进行涂片、固定、结晶紫染色后，在光学显微镜油镜镜头下进行形态观察为苏云金芽胞杆菌菌株。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863在液体LB培养基里生长48h后的显微镜检测图片；
[0017]图2是杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863的进化树分析图；
[0018]图3是杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863的沉淀SDS-PAGE凝胶电泳图；
【具体实施方式】
[0019]杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863,保减单位:中国典型培养物保减中心，地址:中国，武汉，武汉大学，保减中心编号CCTCC NO:M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。
[0020]杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株形态:平板上生长的单菌落为乳白色雪花状，表面粗糙，生长24h电镜下观察为杆状，生长36h后为染不上色的芽胞和染上色的菱形晶体；生长48h后上清液广生6种蛋白，其中3种为杀虫晶体蛋白，分别是Cry9Aa蛋白(130kDa)、Cry2Aa蛋白(69kDa)及CrylAc蛋白(130kDa)(图3)。苏云金芽胞杆菌具有杀南方根结线虫活性。 [0021]本 申请人:2012年5月10日从安徽省九华山附近，东经117度29分，北纬30度39分的位置采取土壤样品lg，在实验室用Iml无菌水悬浮，按照ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6浓度进行稀释涂平板，用LB固体培养液(蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，琼脂粉20g，溶于IL蒸馏水中，121°C，30min，湿热灭菌)，28°C恒温培养箱中倒置培养24h，从平板上挑取单菌落再次稀释划线于LB平板上，28°C条件下培养24h。将重复分离纯化到的单菌落接种到5mlLB液体培养基摇瓶中，28°C，200rpm，培养36h。先用去离子水配置50%的甘油(水:甘油体积比=1:1，121 °C湿热灭菌30min)，将培养了 36h后的500 μ I菌液与灭菌的500 μ 150%的甘油等体积混合，混匀后放于_80°C冰箱中保藏。将从LB平板上分离纯化到的单菌落转接到LB液体培养液中，28°C，200rpm,培养48h后，进行涂片、固定、结晶紫染色后，在光学显微镜油镜镜头下进行形态观察，显微镜检测图片如图1所示，证实为苏云金芽胞杆菌菌株。
[0022]利用分离杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株获取16S rRNA基因，构建系统发育树，具体实施过程:Bacillus thuringiensis NBIN-863菌株过夜活化培养，1% (V/V)接种量接种至新鲜LB培养基(Sambrook et al.，1989)，培养至OD600=0.6，离心收集细胞，按照赛百盛树脂型?基因组DNA提纯试剂盒操作方法提取基因组DNA。以该基因组DNA 为模板，采用细菌 16S rRNA 通用引物(16S_27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ;16S_1429R:GGTTACCTTGTTACGACTT )进行PCR扩增。PCR反应体系为(25 μ I): 10 X扩增缓冲液(含Mg2+L 5mM) 2.5 μ 1，dNTPl μ 1，引物各 I μ 1，模板 DNAl μ 1，Taq DNA 聚合酶 0.2 μ 1，加去离子水补足至25 μ I ;PCR扩增条件:94°C预变性2min，94°C变性30s，55°C退火lmin，72°C延伸1.5min，25个循环，72°C延伸5min。PCR扩增的16S rDNA经琼脂糖凝胶电泳检测，采用DNA纯化试剂盒按照操作说明进行纯化，并克隆到PMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，选取阳性克隆，在上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
[0023]将测序获得的16S rDNA序列在GenBank中进行BLAST比对分析，选取同源性相近的芽胞杆菌16S rDNA序列，利用Clustal X v2.0和MEGA5.1软件进行比对分析并构建图2所示的系统进化树。
[0024]序列表中是分离杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株16S rDNA序列，系统进化树显示NBIN-863与Bacillus thuringiensis L15亲缘关系较近，序列同源性为100%，形成一个簇群，表明从安徽省九华山附近土壤中分离到的菌株属于种Bacillusthuringiensis,进一步命名为Bacillus thuringiensis NBIN-863,提交到GenBank数据库中获得的登录号为KF935650。
[0025]对南方根结线虫二龄幼虫进行生物测定，结果显示Bacillus thuringiensisNBIN-863菌株对南方根结线虫二龄幼虫有很高的毒力，处理24h后，南方根结线虫死亡率达到了 80%以上。发酵液对根结线虫的LC50值为0.1 μ g/ml，上清液LC50值为0.6 μ g/ml，沉淀LC50值为1.17 μ g/ml，如表格I所示。
[0026]表格I菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863对南方根结线虫二龄幼虫的LC50
值
[0027]
【权利要求】
1.一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌，其特征在于杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌NBIN_863Bacillus thuringiensis NBIN-863,保藏单位:中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，保藏中心编号CCTCC NO:M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。
2.根据权利要求1所述的一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌，其特征在于杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株形态:平板上生长的单菌落为乳白色雪花状，表面粗糙，生长24h电镜下观察为杆状,生长36h后为染不上色的芽胞和染上色的菱形晶体；生长48h后上清液产生6种蛋白，其中3种为杀虫晶体蛋白，分别是Cry9Aa-like蛋白(98kDa)、Cry2Aa蛋白(69kDa)及 CrylAc 蛋白(130kDa)。
3.根据权利要求1所述的一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌，其特征在于具有杀南方根结线虫活性。
4.培养权利要求1所述的一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的方法，其特征在于具体步骤如下: 1)取安徽省九华山附近，东经117度29分，北纬30度39分位置的土壤样品lg，在实验室用Iml无菌水悬浮，按照10_3、10_4、10_5、10_6浓度进行稀释涂平板，用LB固体培养液28°C恒温培养箱中倒置培养24h，从平板上挑取单菌落再次稀释划线于LB平板上，28°C条件下培养24h ； LB固体培养液配方:蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠IOg,琼脂粉20g,溶于IL蒸懼水中，121°C,30min,湿热灭菌； 2)将重复分离纯化到 的单菌落接种到5mlLB液体培养基摇瓶中，28°C，200rpm，培养36h, 所述LB液体培养基配方:蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，溶于IL蒸馏水中，121°C，30min,湿热灭菌； 3)先用去离子水配置甘油，121°C湿热灭菌30min，水:甘油体积比=1:1； 4)将步骤2)培养了36h后的500 μ I菌液与灭菌的500 μ 150%的甘油等体积混合，混匀后放于_80°C冰箱中保藏； 5)将从LB平板上分离纯化到的单菌落转接到LB液体培养液中，28°C，200rpm，培养48h后，进行涂片、固定、结晶紫染色后，在光学显微镜油镜镜头下进行形态观察为苏云金芽胞杆菌菌株。
【文档编号】C12R1/07GK103898025SQ201410137036
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】刘晓艳, 黄大野, 杨自文, 闵勇, 王开梅, 万中义, 曹春霞, 周荣华, 江爱兵 申请人:湖北省生物农药工程研究中心