一种亚硝化细菌的培养液及制备和培养方法

文档序号:473870阅读:468来源:国知局
一种亚硝化细菌的培养液及制备和培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种典型氨氧化菌(Nitrosomonaseuropaea)的培养液和培养方法,包括培养液配方、细菌活化和培养。本发明是为了解决目前该细菌培养难度大、要求高、培养过程中细菌易污染、增长缓慢等突出问题。本发明中培养液包含细菌增长所需的营养物质、生物缓冲剂和pH指示剂,能够促进细菌的生长,提高增殖能力和生存能力,并且能够通过指示剂的颜色变化判断与调整细菌的生长状态和活性;在培养过程中,细菌经过活化,进一步提高了细菌的活性和生长速率,极大的缩短了培养周期,并且实现了pH的实时监测和调节,再次提高了细菌的生存能力,提高了培养效率。
【专利说明】一种亚硝化细菌的培养液及制备和培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境工程微生物领域,特别涉及一种典型氨氧化细菌(N.europaea)的培养液及培养方法。
【背景技术】
[0002]目前生活污水的脱氮除磷过程主要通过微生物的吸收转化得以去除,污水中的氨氮先在氨氧化细菌和亚硝化细菌的作用下被顺序氧化成no2_和no3_,然后no3_在反硝化细菌的作用下转化成N2得以去除。
[0003]N.europaea是污水生物脱氮处理系统中典型而又广泛存在的化能自养型氨氧化细菌,并且对环境变化和污染物的毒性胁迫非常敏感。其氮循环的氧化代谢一般途径主要包括好氧状态下氨盐被顺序氧化成羟胺和亚硝酸盐,同时在缺氧状态下亚硝酸盐被还原成NO和N20。因此N.europae是目前用于污水生物脱氮工艺处理性能与温室气体排放控制研究的重要模式对象;也是生物脱氮工艺硝化抑制监测生物传感器研制的重点关注对象。
[0004]目前,由于该菌种对环境变化的高敏感性,纯菌种的培养难度大,要求高,往往在培养过程中出现细菌增长缓慢、密度低、活性低、菌种易受杂菌污染等问题,甚至出现长期培养不出的情况。同时,传统的培养液配方中缺少细菌生长所需的微量矿物元素,或者所含的营养元素浓度比例偏颇,并且其缓冲能力较弱,使得细菌的适应能力、生存能力和繁殖能力受到一定限制。
[0005]因此,随着该菌种在生物脱氮过程控制与研究中的重要性日益突出,针对目前该菌种培养过程和培养液配方存在的问题,找到一种能使该菌种高效持续增长并提高菌种适应能力的培养方法和培养液配方,对研究该菌种的生理生化特性和生物脱氮过程具有重要意义。

【发明内容】

[0006]技术问题:本发明的目的是克服现有该菌种培养方法的不足,包括该菌种敏感性极高,易受杂菌污染,生长速度缓慢甚至无法富集;本发明公开了一种典型氨氧化菌N.europaea的培养方法和培养液配方,以实现细菌的快速生长,降低该菌种受杂菌污染的几率,并通过PH的实时监测和调控,依靠pH指示剂颜色变化观察判断细菌的活性,同时生物缓冲剂的存在提高了细菌的生存能力。
[0007]技术方案:为达到上述目的,本发明采用的技术方案为:细菌培养过程包括培养液制备、细菌活化和培养,培养液包含细菌生长所需的营养物质、生物缓冲剂和PH指示剂。
[0008]上述培养液的营养物质包括常量元素和微量矿物元素,含有常量元素的物质为:(NH4) 2S04、CaCl2.2H20、K2HPO4,含有微量元素的物质为=MgSO4.7H20、CltlH12FeN2NaO8.3H20、Na2MoO4.2H20、MnSO4.H2O, CoC12.6H20、ZnSO4.7H20。
[0009]上述培养液的生物缓冲剂为C9H2tlN2O4S, pH指示剂为酚红;本发明的氨氧化细菌的培养液具体配比为:[0010]在1000mL超纯水中加入以下材料:
[0011]硫酸铵1.00 ~1.32g,
[0012]七水合硫酸镁0.15~0.20g,
[0013]二水合氯化钙0.01~0.02g,
[0014]磷酸氢二钾0.07 ~0.09g,
[0015]N-2-轻乙基喊嚷_Ni3_丙横酸2.00~2.50g,
[0016]SolutionA800 ~1000 μ L,
[0017]SolutionB800 ~1000 μ L,
[0018]SolutionC400 ~500 μ L,
[0019]SolutionD400 ~500 μ L。
[0020]所述的SolutionA 的配方为:称取 IOOmg 螯合铁 CltlH12FeN2NaO8.3H20 溶于 IOOmL蒸馏水;
[0021]所述的SolutionB的配方为:先分别称取IOOmgNa2MoO4.2Η20溶于IOOmL蒸懼水,IOOmgMnSO4.Η20 溶于 IOOmL 蒸馏水,100mgCoCl2.6Η20 溶于 IOOmL 蒸馏水,IOOmgZnSO4.7Η20溶于IOOmL蒸馏水,然后再分别取Na2MoO4.2Η20溶液IOmL, MnSO4.H2O溶液17.2mL,CoCl2.6H20溶液0.4mL, ZnSO4.7H20溶液10mL,用去离子水定容至IOOmL,并存储于4°C冰箱;
[0022]所述的SolutionC的配方为:称取500mg酚红溶于IOOmL去离子水,存储于常温、黑暗环境下;
[0023]所述的SolutionD的配方为:称取0.01997gCuS04.5Η20溶于40ml蒸馏水,存储于
4°C冰箱。
[0024]本发明的亚硝化细菌的培养液的制备方法为:
[0025]1)按照培养基配方在反应容器中溶解各试剂,在连续搅拌的情况下按顺序逐一溶解各成分;
[0026]2 )用 40%KHC03 调节 pH 到 6.9 ± 0.50 ;
[0027]3)将培养液分装在容器中,进行高压灭菌,时间30~35min,温度120~125°C ;
[0028]4)冷却后室温密封保存。
[0029]采用本发明亚硝化细菌的培养液进行细菌培养方法,其具体步骤如下:
[0030]1)在无菌操作台中,将菌种与已灭菌的培养液按1: 15~20的体积比接种到已灭菌的培养瓶中,并保证混合液总体积不超过培养瓶体积的1/3 ;
[0031]2)加入磁力搅拌子,密封后包上锡箔纸,放在磁力搅拌器上避光活化3~5天,通过观察指示剂颜色的变化判断菌种的活性,当混合液颜色由红色变为淡红到橙黄色时,加入少量已灭菌的饱和NaHCO3使混合液呈红色,当混合液再次变为黄色时,活化完成,取样镜检;
[0032]3)将活化菌种与培养液按1:20~30的体积比接种到反应器内培养,曝气使溶解氧控制在1.5~3.0mg/L,监测并控制pH值在7.40~7.50。
[0033]有益效果:本发明公开了一种亚硝化细菌的培养液和培养方法,包括培养液配方、菌种活化和培养。该培养液包含细菌生长的营养元素、生物缓冲剂和指示剂,各成分作用如下:(NH4) 2S04、CaCl2.2H20、K2HPO4和MgSO4.7H20,提供细菌生长所必需的常量元素,其中(NH4) 2S04,是细菌生长的主要氮源和能量来源物质,其作为电子供体,通过氧化反应产生电子,并在好氧呼吸链中的传递转移保证了 ATP的产生,为菌种的细胞生长与代谢提供能量;EPPS为生物缓冲剂,用于稳定环境中pH的变化,使细菌在最适pH范围内快速生长,从而提高细菌的繁殖和生存能力;SolutionA,提供细菌生长所必需的微量金属元素铁,并且铁元素以络合物的形态存在于水中,减少了与其它物质反应从而沉淀失效的机率,并提高了细菌对铁元素的吸收利用率和细菌生长能力;SolutionB和SolutionD,提供细菌生长所必需的微量金属元素,包括钴、钥、锰、锌、铜,能促进部分酶的合成,提高细菌的新陈代谢能力;SolutionC为pH指示剂,通过指示剂颜色的变化指示细菌的生长状态和活性;培养液中的各营养元素比例合适,共同促进该细菌的快速生长,提高了细菌的繁殖能力和生存能力。细菌通过培养液补充营养物质和能量来源,并通过活化,极大的促进了该菌的生长繁殖能力和细菌活性,缩短了细菌的培养时间,并且该培养方法尽可能的保证了培养过程中的无菌条件,并且在培养时,实现了 PH的实时监测和调节,进一步提高了细菌的生存能力和繁殖能力。【具体实施方式】
[0034]本发明公开了一种亚硝化细菌的培养液和培养方法,具体实施包括培养液配制、细菌活化和培养。
[0035]上述培养液各物质的具体配比为:硫酸铵1.00~1.32g,七水合硫酸镁0.15~0.20g,二水合氯化钙0.01~0.02g,磷酸氢二钾0.07~0.09g,N_2_羟乙基哌嗪_Ni3_丙磺酸(EPPS) 2.00 ~2.50g,SolutionA800 ~1000 μ L,SolutionB800 ~1000 μ L,SolutionC400 ~500 μ L, SolutionD400 ~500 μ L,超纯水 1000mL。
[0036]其中:SolutionA:100mg/100mL螯合铁溶液,储于4°C冰箱。
[0037]SolutionB:混合溶液,储于4°C冰箱,含:
[0038]10.0mg/1OOmLNa2MoOi.2H20,
[0039]17.2mg/1OOmLMnSO4.H2O,
[0040]0.4mg/mLCoCl2.6H2O,
[0041]10.0mg/mLZnS04.7H20。
[0042]SolutionC:500mg/100mL酹红溶液,储于常温,黑暗环境下。
[0043]SolutionD:0.01997g/40mLCuS04.5H20 溶液,储于 4°C冰箱。
[0044]上述培养液制备过程:将各物质按顺序依次溶解于水中,此过程中溶液保持在不断搅拌状态。
[0045]上述细菌活化和培养过程:
[0046](一 )在无菌操作台中,将菌种与灭过菌的培养液按1:15~20的体积比接种到灭过菌的培养瓶中,并保证混合液总体积不超过培养瓶体积的1/3。
[0047]( 二)加入磁力搅拌子,密封后包上锡箔纸,放在磁力搅拌器上避光活化3~5天,通过观察指示剂颜色的变化判断菌种的活性,当混合液颜色由红色变为淡红到橙黄色时,加入少量已灭菌的饱和NaHCO3使混合液呈红色,当混合液再次变为黄色时,活化完成,取样镜检。
[0048](三)将活化菌种与培养液按1:20~30的体积比接种到反应器内培养,并根据需要控制溶解氧浓度在1.0~3.0mg/L范围内,实时监测pH并控制pH为7.0~7.5。
[0049]上述细菌为欧洲亚硝化单胞细菌(N.europaea)ο
[0050]实例一:
[0051]培养液配制:准备好体积适当的玻璃容器两个,250mL培养瓶(耐高温高压,已灭菌)两个,100~1000 μ L移液枪(含灭过菌的枪头)和1000~5000 μ L移液枪各一个,1000mL的量筒等;用量筒量取1000mL超纯水,在上述玻璃容器中,依次称取以下药品溶解(待上一药品完全溶解后再逐次溶解下一个药品):1.0Og (NH4) 2S04、0.15gMgS04.7H20、0.01gCaCl2.2Η20、0.07gK2HP04、2.0OgC9H20N2O4S (EPPS),并同时通过磁力搅拌器搅拌,然后分别加 A 800 μ LSolutionA、800 μ LSolutionB、400 μ LSolutionC 和 400 μ LSolutionD,所有药品完全溶解后,用40%KHC03调节pH后为6.90,用锡箔纸包好瓶口后,120°C高温高压下灭菌30min,并冷却至室温待用。
[0052]细菌活化和培养:在经紫外灭菌30min的无菌操作台内操作后,在操作台内,分别取ImL菌液(_80°C冰箱保存)和20mL已灭菌的培养液,接种到已灭菌的培养瓶中,30°C下避光振荡活化大约4.0d后培养瓶中混合液由红色变至黄色,加入适量饱和NaHCO3使溶液呈红色,当菌液二次变黄时,细菌活化完成。在无菌操作台内,将活化完成的菌液转至定特制的反应器中,持续进培养液恒流培养,反应器中水力停留时间为2~3d,进出水流量保持恒定,恒定值范围为900~1000 μ L/min,并不断曝气保证溶解氧在1.0~3.0mg/L范围内;加入搅拌子以保证混合充分,并通过PH自动控制器控制反应瓶内pH为7.40~7.50,进反应器缓冲液为饱和NaH CO3溶液(已灭菌);2d内细菌快速增长,稳定后采样镜检细菌浓度约为1.69 X IO8~2.47 X IO8个/mL (细菌计数板计数)。
[0053]上述实施步骤中应注意:药品无污染,药匙保持清洁,药品依次完全溶解;无菌操作尽量避免与菌液或培养液的直接接触,各瓶口需用锡箔纸包实。
[0054]实例二:
[0055]培养液配制:准备好体积适当的玻璃容器两个,250mL培养瓶(耐高温高压,已灭菌)两个,100~1000 μ L移液枪(含灭过菌的枪头)和1000~5000 μ L移液枪各一个,1000mL的量筒等;用量筒量取1000mL超纯水,在上述玻璃容器中,依次称取以下药品溶解(待上一药品完全溶解后再逐次溶解下一个药品):1.20g (NH4) 2S04、0.17gMgS04.7H20、0.015gCaCl2.2Η20、0.08gK2HP04、2.25gC9H20N204S (EPPS),并同时加入磁力搅拌子搅拌,然后分别加 A 900 μ LSolutionA、900 μ LSolutionB、450 μ LSolutionC 和 450 μ LSolutionD,所有药品完全溶解后,用40%KHC03调节pH后为6.95,用锡箔纸包好瓶口后,120°C高温下灭菌30min,灭完后冷却至室温。
[0056]细菌活化和培养:与实例一中细菌活化和培养步骤一样,活化完成约3.5d,2d内细菌快速增长,稳定后采样镜检细菌浓度约为1.71 X IO8~2.34X IO8个/mL (细菌计数板计数)。
[0057]上述实施步骤中应注意:药品无污染,药匙保持清洁,药品依次完全溶解;无菌操作尽量避免与菌液或培养液的直接接触,各瓶口需用锡箔纸包实。
[0058]实例三:
[0059]培养液配制:准备好体积适当的玻璃容器两个,250mL培养瓶(耐高温高压,已灭菌)两个,100~1000 μ L移液枪(含灭过菌的枪头)和1000~5000 μ L移液枪各一个,1000mL的量筒等;用量筒量取1000mL超纯水,在上述玻璃容器中,依次称取以下药品溶解(待上一药品完全溶解后再逐次溶解下一个药品):1.32g (NH4) 2S04、0.2gMgS04.7H20、0.02gCaCl2.2Η20、0.09gK2HP04、2.5gC9H20N204S (EPPS),并同时加入磁力搅拌子搅拌,然后分别加 A 1000 μ LSolutionA、1000 μ LSolutionB、500μ LSolutionC 和 500 μ LSolutionD,所有药品完全溶解后,用40%KHC03调节pH后为6.93,用锡箔纸包好瓶口后,120°C高温下灭菌30min,灭完后冷却至室温。
[0060]细菌活化和 培养:与实例一中细菌活化步骤一样,活化完成约3.5d ;活化完成后,将活化菌液转移至已灭菌的培养瓶(500mL)中,并加入200mL培养液,置于30°C恒温振荡器中避光培养,2d内细菌快速增长,稳定后采样镜检细菌浓度约为1.77 X IO8~2.22 X IO8个/mL (细菌计数板计数)。
[0061]上述实施步骤中应注意:药品无污染,药匙保持清洁,药品依次完全溶解;无菌操作尽量避免与菌液或培养液的直接接触,各瓶口需用锡箔纸包实。
【权利要求】
1.一种亚硝化细菌的培养液,其特征在于该培养液具体配比为: 在1000mL超纯水中加入以下材料: 硫酸铵1.00~1.32g, 七水合硫酸镁0.15~0.20g, 二水合氯化钙0.01~0.02g, 磷酸氢二钾0.07~0.09g, N-2-羟乙基哌嗪-N13-丙磺酸(EPPS) 2.00~2.52g,
Solut1onA800 ~1000 μ L:
Solut1onB800 ~1000 μ L,
Solut1onC400 ~500 μ L,
Solut1onD400 ~500 μ L, 所述的Solut1onA的配方为:称取1OOmg螯合铁CltlH12FeN2NaO8.3H20溶于1OOmL蒸馏水; 所述的Solut1onB的配方为:先分别称取1OOmgNa2MoO4.2H20溶于1OOmL蒸懼水,1OOmgMnSO4.Η20 溶于 1OOmL 蒸馏水,100mgCoCl2.6Η20 溶于 1OOmL 蒸馏水,1OOmgZnSO4.7Η20溶于1OOmL蒸馏水,然后再分别取Na2MoO4.2Η20溶液1OmL, MnSO4.H2O溶液17.2mL,CoCl2.6H20溶液0.4mL, ZnSO4.7H20溶液10mL,用去离子水定容至1OOmL,并存储于4°C冰箱; 所述的Solut1onC的配方为:称取500mg酚红溶于1OOmL去离子水,存储于常温、黑暗环境下; 所述的Solut1onD的配方为:称取0.01997gCuS04.5Η20溶于40ml蒸馏水,存储于4°C冰箱。
2.一种如权利要求1所述的亚硝化细菌的培养液的制备方法,其特征在于: 1)按照培养基配方在反应容器中溶解各试剂,在连续搅拌的情况下按顺序逐一溶解各成分;
2)用40%KHC03 调节 pH 到 6.90±0.50 ; 3)将培养液分装在容器中,进行高压灭菌,时间30~35m1n,温度120~125°C; 4)冷却后室温密封保存。
3.一种采用权利要求1所述的亚硝化细菌的培养液进行细菌培养方法,其特征在于其具体步骤如下; 1)在无菌操作台中,将菌种与灭过菌的培养液按1: 15~20的体积比接种到灭过菌的培养瓶中,并保证混合液总体积不超过培养瓶体积的1/3 ; 2)加入磁力搅拌子,密封后包上锡箔纸,放在磁力搅拌器上避光活化3~5天,通过观察指示剂颜色的变化判断菌种的活性,当混合液颜色由红色变为淡红到橙黄色时,加入少量已灭菌的饱和NaHCO3使混合液呈红色,当混合液再次变为黄色时,活化完成,取样镜检; 3)将活化菌种与培养液按1:20~30的体积比接种到反应器内培养,曝气使溶解氧控制在1.5~3.0mg/L,监测并控制pH值在7.40~7.50。
【文档编号】C12R1/01GK103898026SQ201410141638
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】余冉, 吴俊康, 陈良辉, 刘美婷 申请人:东南大学
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