一种肉桂地链霉菌发酵生产莫能菌素的新型培养基和培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种肉桂地链霉菌发酵生产莫能菌素的新型培养基和培养方法，利用本发明中提供的培养基配方和发酵控制工艺，能够提高莫能菌素发酵单位，缩短发酵周期，降低发酵成本，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现莫能菌素稳定、高效的生产。
【专利说明】一种肉桂地链霉菌发酵生产莫能菌素的新型培养基和培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于发酵【技术领域】，特别是涉及一种肉桂地链霉菌发酵生产莫能菌素的新型培养基和培养方法。
【背景技术】
[0002]莫能菌素又名莫能霉素、莫能菌酸、瘤胃素，由美国Eli Iilly公司于1967年从一株肉桂地链霉菌中分离到的一种脂溶性抗生素。它是一种广谱抗球虫药，对金黄色葡萄球菌，链球菌，枯草杆菌等革兰氏阳性菌和猪血痢密螺旋体等都具有较高的抗菌活性。主要用于防治鸡 ，兔，犊牛，羔羊的球虫病和猪痢疾，并能促进其生长发育和提高饲料利用率。
[0003]目前，国内莫能菌素的发酵生产采用三级发酵模式，该方式存在的主要问题有以下几点:
I莫能菌素发酵水平较低，一般控制在35000u/ml左右。
[0004]2国内发酵生产莫能菌素的培养基中加入葡萄糖，经高温灭菌，易导致部分葡萄糖碳化，降低总糖含量，影响发酵液质量。
[0005]3莫能菌素发酵生产所需的原材料采购成本较高。莫能菌素培养基中常用的有机氮源主要是花生饼粉(或黄豆饼粉)、蛋白胨、酵母粉，其市场价格较高。
[0006]4国内莫能菌素的发酵培养周期较长，一般在300h以上，导致能耗较高。
【发明内容】
[0007]本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种发酵工艺简单，有效提高发酵单位，同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现莫能菌素稳定、高效生产的新型培养基。
[0008]本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产莫能菌素的培养方法。
[0009]为实现上述目的所采取的技术方案为:
一种肉桂地链霉菌发酵生产莫能菌素的新型培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述一级种子培养基的组成为:麸皮I~5g/L、麦芽糖5~9g/L、鱼粉3~7g/L、玉米衆5~9ml/L、玉米蛋白粉I~5g/L、啤酒酵母浸膏4~8g/L,硫酸铵I~5g/L、轻质碳酸钙I~5g/L、橄榄油或菜籽油5~9ml/L ；
所述二级种子培养基组成为:麸皮3~7g/L、麦芽糖6~10g/L、鱼粉6~9g/L、玉米衆8~12ml/L、玉米蛋白粉3~7g/L、啤酒酵母浸膏5~9g/L,硫酸铵3~7g/L、轻质碳酸钙I~5g/L、磷酸二氢钾0.5~0.9g/L,橄榄油或菜籽油15~25ml/L ；
所述发酵培养基组成为:麸皮8~12g/L、麦芽糖10~14g/L、鱼粉7~llg/L、玉米浆15~19ml/L、玉米蛋白粉5~9g/L、啤酒酵母浸膏15~19g/L,硫酸铵4~8g/L、轻质碳酸钙3~7g/L、磷酸二氢钾0.5~0.9g/L，橄榄油或菜籽油25~40ml/L。氯化钠0.3~0.7g/L、硫酸镁0.2~0.6g/L、硫酸亚铁0.1~0.5g/L、聚氧丙烯甘油0.3~0.4g/L。[0010]一种利用上述培养基生产莫能菌素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为:
O 一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至25~30°C，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的肉桂地链霉菌母瓶发酵液按照0.3~0.5L/m3的接种量接入该一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度20~25%、pH值6.5~8.5、培养时间25~35h时移种；
2)二级种子培养:先将二级种子培养基灭菌，冷却至25~30°C，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在9~11%，至菌体浓度30~35%、pH值6.5~8.5、培养时间30~35h时移种；
3)发酵培养:先将发酵培养基灭菌，冷却至20~27°C，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在9~11%，至菌体浓度35~40%、还原糖< 1.5g/L、脂肪:< 2g/L、氨基氮:10 ~30mg/100ml、化学效价> 43000u/mL、pH:6.0~7.0、培养时间260~280h时终止发酵。
[0011]灭菌后的一级种子培养基的质量要求:氨基氮:50~60mg/100ml、溶磷:100~150ug/ml、脂肪:10 ~25g/L、pH:6.5 ~7.5 ;
灭菌后的二级种子培养基 的质量要求:氨基氮:60~70mg/100ml、溶磷:100~150ug/ml、脂肪:15 ~30g/L、pH:6.5 ~7.5 ;
灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮:70~80mg/100ml、溶磷:150~200ug/ml、脂肪:25 ~40g/L、pH:6 ~7。
[0012]所述培养好的母瓶发酵液质量要求为:pH6~8 ;菌体浓度10~30% ;镜检无杂菌；发酵单位15000~25000u/ml。
[0013]所述一级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C;空气流量:0~5h,采用空气搅拌代替机械搅拌；6h~移种:50~60m3/h ;搅拌转速60~80r/min。
[0014]所述二级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C;空气流量:0~12h, 20 ~30m3/h ； 13h ~移种:50 ~60m3/h ;揽祥转速 80 ~100r/min。
[0015]所述发酵培养条件为:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6~7 ;
b温度:采用变温控制方法，O~20h:培养温度29~31°C;20h~发酵结束:培养温度32 ~33。。；
c搅拌转速:采用变频搅拌控制方法，O~IOOh:转速控制在100r/min ;101~200h:转速控制在130r/min ；201h~发酵结束:转速控制在90r/min ；d压力控制:罐压0.05~0.06MPa ；e pH控制:发酵过程中pH控制在6.0~7.0 ;
f 空气流量:0 ~IOOh:150 ~200mVh ;101 ~200h:250 ~300m3/h ;201h ~发酵结束:100 ~150m3A ；h溶氧控制:
发酵前5h内，不控制溶氧；
6~100h，溶氧控制在60%以上；
101~200h，溶氧控制在20%以上；
201~发酵结束:溶氧控制在30%以上。[0016]在发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补油、补水、补糖和pH控制，其中 a补油工艺控制:
发酵前30h不用进行补油，
发酵时间在31~120h，当脂肪含量低于15%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为15~20%，每隔6~8h检测发酵液脂肪含量，
发酵时间在121~200h，当脂肪含量低于10%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为10~15%，每隔6~8h检测发酵液脂肪含量，
发酵时间在201h~240h，当脂肪含量低于5%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为5~8%，每隔6~8h检测发酵液脂肪含量，
发酵时间在241h~发酵结束，当脂肪含量低于1.5%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为1.5~2.5%，每隔6~8h检测发酵液脂肪含量；b补水工艺控制:
发酵前30h不用进行补水， 发酵时间在31~100h，当菌体浓度高于50%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40~45%，每隔6~8h检 测发酵液菌体浓度，
发酵时间在101~200h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40~45%，每隔6~8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在201h~发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35~40%，每隔6~8h检测发酵液菌体浓度；c发酵过程pH控制工艺:
发酵前40h，pH不进行控制，
发酵时间在41~120h，若pH < 6.0，加入10~20%的氢氧化钠，调节pH至6.0~6.5 ;若pH > 6.5，加入30%的硫酸铵溶液，调节pH至6.0~6.5，
发酵时间在121~发酵结束，若pH < 6.5，加入10~20%的氢氧化钠，调节pH控至
6.5~7.0 ;若pH > 7.0，加入30%的硫酸铵溶液，调节pH至6.5~7.0 ; d补入麦芽糖:
发酵前60h，还原糖含量不进行控制，
发酵61h至200h:还原糖含量< 3%时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在3~4%，
发酵201h至发酵结束:还原糖含量< 0.5%时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在0.5~1%，
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其浓度控制在0.001~0.003%。
[0017]本发明的技术优势体现在:
I本发明确认了种子培养基、发酵培养碳源、氮源和最佳配伍比例。
[0018]2本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了莫能菌素最佳的发酵工艺和控制参数。达到的技术效果为发酵单位在43000u/ml以上，生产周期不超过280h，同国内技术相比，发酵单位提高了 22.8%，生产周期减少了 20h以上。
[0019]3本发明适用于规模化发酵生产莫能菌素，能够满足年产40000吨莫能菌素预混剂的生产需求。[0020]4培养基中使用麦芽糖，避免出现葡萄糖碳化现象，不会影响菌种培养效果。
[0021]具体实施方法
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
[0022]下述实施例的菌种选用肉桂地链霉菌:生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量:pH6~8 ;菌体浓度10~30% ;镜检无杂菌；发酵单位15000~25000u/ml。
[0023]实施例1
一级种子培养基制备:种子罐体积1.5m3，有效体积为lm3。
[0024]麸皮1kg、麦芽糖5kg、鱼粉3kg、玉米衆5L、玉米蛋白粉1kg、啤酒酵母浸膏4kg,硫酸铵1kg、轻质碳酸钙1kg、橄榄油5L。
[0025]将一级种子培养基灭菌并冷却至25°C，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的肉桂地链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在0.3L。灭菌后一级种子培养基的氨基氮:51mg/100ml、溶磷:104ug/ml、脂肪:12g/L、pH:7.3。
[0026]一级种子培养:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C;空气流量:0~5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h~移种:50m3/h ;搅拌转速60r/min。
[0027]一级种子培养 结束，菌体浓度21% ；pH值8.3 ;无其它杂菌污染；培养时间25h。
[0028]二级种子培养基制备:种子罐体积15m3，有效体积为10m3。
[0029]麸皮30kg、麦芽糖60kg、鱼粉60kg、玉米衆80kg、玉米蛋白粉30kg、啤酒酵母浸膏50kg,硫酸铵30kg、轻质碳酸韩10kg、磷酸二氢钾5kg,橄榄油150L。
[0030]先将二级种子培养基灭菌，冷却至25°C，并用无菌空气保压。灭菌后的二级种子培养基氨基氮61mg/100ml、溶磷105ug/ml、脂肪16g/L、pH7.4。然后将一级种子液全部移入
二级种子罐进行培养。
[0031]二级种子培养条件:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C ;空气流量:0~12h，20m3/h ； 13h ~移种:50m3/h ;揽祥转速 80r/min。
[0032]二级种子培养结束，其菌体浓度31% ；pH值8.2 ;无其它杂菌污染；培养时间30h。
[0033]发酵培养基制备过程:发酵罐体积130m3，有效体积为100m3。
[0034]麸皮800kg、麦芽糖1000kg、鱼粉700kg、玉米浆1500kg、玉米蛋白粉500kg、啤酒酵母浸膏1500kg，硫酸铵400kg、轻质碳酸钙300kg、磷酸二氢钾50kg，橄榄油2500L、氯化钠30kg、硫酸镁20kg、硫酸亚铁10kg、聚氧丙烯甘油30kg
先将发酵培养基灭菌，冷却至20°C，并用无菌空气保压。灭菌后的发酵培养基氨基氮72mg/100ml、溶磷154ug/ml、脂肪27g/L、pH6.9。然后将二级种子液移入发酵罐进行发酵培养。
[0035]发酵培养控制方法:
1)温度:采用变温控制方法，O~20h:培养温度29~31°C;20h~发酵结束:培养温度32 ~33。。；
2)搅拌转速:采用变频搅拌控制方法，O~IOOh:转速控制在100r/min ；101~200h:转速控制在130r/min ；201h~发酵结束:转速控制在90r/min
3)压力控制:罐压0.05~0.06MPa ；
4)pH控制:发酵过程中pH控制在6.0~7.0 ;5)无菌检查:发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；
6)空气流量:0~IOOh:150m3A ；101 ~200h:250m3/h ；201h ~发酵结束:IOOm3A ；
7)溶氧控制:发酵前5h内，不控制溶氧；6~100h，溶氧控制在60%以上；101~200h，溶氧控制在20%以上；201~发酵结束:溶氧控制在30%以上。
[0036]发酵培养结束，氨基氮13mg/100ml、pH6.8、还原糖0.73g/L ;脂肪1.12g/L、菌体浓度35%、化学效价43521u/ml、发酵周期261h。 [0037]实施例2
一级种子培养基制备:种子罐体积1.5m3，有效体积为lm3。
[0038]麸皮2kg、麦芽糖6kg、鱼粉4kg、玉米衆6L、玉米蛋白粉2kg、啤酒酵母浸膏5kg,硫酸铵2kg、轻质碳酸|丐2kg、菜籽油6L。
[0039]将一级种子培养基灭菌并冷却至26°C，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的肉桂地链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在0.3L。灭菌后一级种子培养基的氨基氮:53mg/100ml、溶磷:112ug/ml、脂肪:14g/L、pH:7.2。
[0040]一级种子培养:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C;空气流量:0~5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h~移种:52m3/h ;搅拌转速65r/min。
[0041]一级种子培养结束，菌体浓度22% ；pH值8.0 ;无其它杂菌污染；培养时间27h。
[0042]二级种子培养基制备:种子罐体积15m3，有效体积为10m3。
[0043]麸皮40kg、麦芽糖70kg、鱼粉70kg、玉米浆90kg、玉米蛋白粉40kg、啤酒酵母浸膏60kg,硫酸铵40kg、轻质碳酸韩20kg、磷酸二氢钾6kg,菜籽油170L。
[0044]先将二级种子培养基灭菌，冷却至26°C，并用无菌空气保压。灭菌后的二级种子培养基氨基氮63mg/100ml、溶磷115ug/ml、脂肪19g/L、pH7.2。然后将一级种子液全部移入
二级种子罐进行培养。
[0045]二级种子培养条件:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C ;空气流量:0~12h，22m3/h ； 13h ~移种:52m3/h ;揽祥转速 85r/min。
[0046]二级种子培养结束，其菌体浓度32% ；pH值7.9 ;无其它杂菌污染；培养时间32h。
[0047]发酵培养基制备过程:发酵罐体积130m3，有效体积为100m3。
[0048]麸皮900kg、麦芽糖1100kg、鱼粉800kg、玉米浆1600kg、玉米蛋白粉600kg、啤酒酵母浸膏1600kg,硫酸铵500kg、轻质碳酸|丐400kg、磷酸二氢钾60kg,菜籽油3000L、氯化钠40kg、硫酸镁30kg、硫酸亚铁20kg、聚氧丙烯甘油33kg
先将发酵培养基灭菌，冷却至22°C，并用无菌空气保压。灭菌后的发酵培养基氨基氮73mg/100ml、溶磷162ug/ml、脂肪30g/L、pH6.7。然后将二级种子液移入发酵罐进行发酵培养。
[0049]发酵培养控制方法:
1)温度:采用变温控制方法，O~20h:培养温度29~31°C;20h~发酵结束:培养温度32 ~33。。；
2)搅拌转速:采用变频搅拌控制方法，O~IOOh:转速控制在100r/min ；101~200h:转速控制在130r/min ；201h~发酵结束:转速控制在90r/min
3)压力控制:罐压0.05~0.06MPa ；
4)pH控制:发酵过程中pH控制在6.0~7.0 ;5)无菌检查:发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；
6)空气流量:0~IOOh:160m3A ；101 ~200h:260m3/h ；201h ~发酵结束:120m3/h ；
7)溶氧控制:发酵前5h内，不控制溶氧；6~100h，溶氧控制在60%以上；101~200h，溶氧控制在20%以上；201~发酵结束:溶氧控制在30%以上。
[0050]发酵培养结束,氨基氮17mg/100ml、pH6.7、还原糖0.89g/L ;脂肪1.51g/L、菌体浓度36%、化学效价43975u/ml、发酵周期265h。
[0051]实施例3
一级种子培养基制备:种子罐体积1.5m3，有效体积为lm3。
[0052]麸皮3kg、麦芽糖7kg、鱼粉5kg、玉米衆7L、玉米蛋白粉3kg、啤酒酵母浸膏6kg,硫酸铵3kg、轻质碳酸|丐3kg、菜籽油7L。
[0053]将一级种子培养基灭菌并冷却至27°C，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的肉 桂地链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在0.3L。灭菌后一级种子培养基的氨基氮:55mg/100ml、溶磷:124ug/ml、脂肪:18g/L、pH:7.0。
[0054]一级种子培养:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C;空气流量:0~5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h~移种:55m3/h ;搅拌转速70r/min。
[0055]一级种子培养结束，菌体浓度23% ；pH值7.5 ;无其它杂菌污染；培养时间30h。
[0056]二级种子培养基制备:种子罐体积15m3,有效体积为10m3。
[0057]麸皮50kg、麦芽糖80kg、鱼粉80kg、玉米浆100kg、玉米蛋白粉50kg、啤酒酵母浸膏70kg,硫酸铵50kg、轻质碳酸韩30kg、磷酸二氢钾7kg,菜籽油200L。
[0058]先将二级种子培养基灭菌，冷却至27°C，并用无菌空气保压。灭菌后的二级种子培养基氨基氮65mg/100ml、溶磷125ug/ml、脂肪21g/L、pH7.0。然后将一级种子液全部移入
二级种子罐进行培养。
[0059]二级种子培养条件:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C ;空气流量:0~12h，25m3/h ； 13h ~移种:55m3/h ;揽祥转速 90r/min。
[0060]二级种子培养结束，其菌体浓度33% ；pH值7.5 ;无其它杂菌污染；培养时间33h。
[0061]发酵培养基制备过程:发酵罐体积130m3，有效体积为100m3。
[0062]麸皮1000kg、麦芽糖1200kg、鱼粉900kg、玉米浆1700kg、玉米蛋白粉700kg、啤酒酵母浸膏1700kg，硫酸铵600kg、轻质碳酸钙500kg、磷酸二氢钾70kg，菜籽油3300L、氯化钠50kg、硫酸镁40kg、硫酸亚铁30kg、聚氧丙烯甘油35kg
先将发酵培养基灭菌，冷却至24°C，并用无菌空气保压。灭菌后的发酵培养基氨基氮75mg/100ml、溶磷174ug/ml、脂肪33g/L、pH6.5。然后将二级种子液移入发酵罐进行发酵培养。
[0063]发酵培养控制方法:
1)温度:采用变温控制方法，O~20h:培养温度29~31°C;20h~发酵结束:培养温度32 ~33。。；
2)搅拌转速:采用变频搅拌控制方法，O~IOOh:转速控制在100r/min ；101~200h:转速控制在130r/min ；201h~发酵结束:转速控制在90r/min
3)压力控制:罐压0.05~0.06MPa ；
4)pH控制:发酵过程中pH控制在6.0~7.0 ;5)无菌检查:发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；
6)空气流量:0~IOOh:170m3A ；101 ~200h:270m3/h ；201h ~发酵结束:130m3/h ；
7)溶氧控制:发酵前5h内，不控制溶氧；6~100h，溶氧控制在60%以上；101~200h，溶氧控制在20%以上；201~发酵结束:溶氧控制在30%以上。
[0064]发酵培养结束,氨基氮21mg/100ml、pH6.5、还原糖1.0g/L ;脂肪1.62g/L、菌体浓度37%、化学效价44613u/ml、发酵周期270h。
[0065]实施例4 一级种子培养基制备:种子罐体积1.5m3，有效体积为lm3。
[0066]麸皮4kg、麦芽糖8kg、鱼粉6kg、玉米衆8L、玉米蛋白粉4kg、啤酒酵母浸膏7kg,硫酸铵4kg、轻质碳酸|丐4kg、橄榄油8L。
[0067]将一级种子培养基灭菌并冷却至28°C，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的肉桂地链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在0.3L。灭菌后一级种子培养基的氨基氮:57mg/100ml、溶磷:138ug/ml、脂肪:22g/L、pH:6.8。
[0068]一级种子培养:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C;空气流量:0~5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h~移种:57m3/h ;搅拌转速75r/min。
[0069]一级种子培养结束，菌体浓度24% ；pH值7.1 ;无其它杂菌污染；培养时间32h。
[0070]二级种子培养基制备:种子罐体积15m3，有效体积为10m3。
[0071 ] 麸皮60kg、麦芽糖90kg、鱼粉90kg、玉米衆110kg、玉米蛋白粉60kg、啤酒酵母浸膏80kg,硫酸铵60kg、轻质碳酸韩40kg、磷酸二氢钾8kg,橄榄油230L。
[0072]先将二级种子培养基灭菌，冷却至28°C，并用无菌空气保压。灭菌后的二级种子培养基氨基氮68mg/100ml、溶磷141ug/ml、脂肪26g/L、pH6.7。然后将一级种子液全部移入
二级种子罐进行培养。
[0073]二级种子培养条件:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C ;空气流量:0~12h，28m3/h ； 13h ~移种:57m3/h ;揽祥转速 95r/min。
[0074]二级种子培养结束，其菌体浓度34% ；pH值7.0 ;无其它杂菌污染；培养时间34h。
[0075]发酵培养基制备过程:发酵罐体积130m3，有效体积为100m3。
[0076]麸皮1100kg、麦芽糖1300kg、鱼粉1000kg、玉米浆1800kg、玉米蛋白粉800kg、啤酒酵母浸膏1800kg，硫酸铵700kg、轻质碳酸钙600kg、磷酸二氢钾80kg，橄榄油3700L、氯化钠60kg、硫酸镁50kg、硫酸亚铁40kg、聚氧丙烯甘油38kg。
[0077]先将发酵培养基灭菌，冷却至26°C，并用无菌空气保压。灭菌后的发酵培养基氨基氮77mg/100ml、溶磷186ug/ml、脂肪34g/L、pH6.3。然后将二级种子液移入发酵罐进行发
酵培养。
[0078]发酵培养控制方法:
1)温度:采用变温控制方法，O~20h:培养温度29~31°C;20h~发酵结束:培养温度32 ~33。。；
2)搅拌转速:采用变频搅拌控制方法，O~IOOh:转速控制在100r/min ；101~200h:转速控制在130r/min ；201h~发酵结束:转速控制在90r/min
3)压力控制:罐压0.05~0.06MPa ；
4)pH控制:发酵过程中pH控制在6.0~7.0 ;5)无菌检查:发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；
6)空气流量:0~IOOh:180m3A ；101 ~200h:280m3/h ；201h ~发酵结束:140m3/h ；
7)溶氧控制:发酵前5h内，不控制溶氧；6~100h，溶氧控制在60%以上；101~200h，溶氧控制在20%以上；201~发酵结束:溶氧控制在30%以上。
[0079]发酵培养结束,氨基氮24mg/100ml、pH6.3、还原糖1.2g/L ;脂肪1.76g/L、菌体浓度38%、化学效价44216u/ml、发酵周期275h。
[0080]实施例5
一级种子培养基制备:种子罐体积1.5m3，有效体积为lm3。
[0081]麸皮5kg、麦芽糖89kg、鱼粉7kg、玉米衆9L、玉米蛋白粉5kg、啤酒酵母浸膏8kg,硫酸铵45kg、轻质碳酸|丐5kg、菜籽油9L。
[0082]将一级种子培养基灭菌并冷却至30°C，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的肉桂地链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在0.3L。灭菌后一级种子培养基的氨基氮 :60mg/100ml、溶磷:149ug/ml、脂肪:25g/L、pH:6.5。
[0083]一级种子培养:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C;空气流量:0~5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h~移种:60m3/h ;搅拌转速80r/min。
[0084]一级种子培养结束，菌体浓度25% ；pH值6.6 ;无其它杂菌污染；培养时间35h。
[0085]二级种子培养基制备:种子罐体积15m3,有效体积为10m3。
[0086]麸皮70kg、麦芽糖100kg、鱼粉100kg、玉米浆120kg、玉米蛋白粉70kg、啤酒酵母浸膏90kg,硫酸铵70kg、轻质碳酸|丐50kg、磷酸二氢钾9kg,菜籽油250L。
[0087]先将二级种子培养基灭菌，冷却至30°C，并用无菌空气保压。灭菌后的二级种子培养基氨基氮70mg/100ml、148ug/ml、脂肪30g/L、pH6.5。然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。
[0088]二级种子培养条件:罐压0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C ;空气流量:0~12h，30m3/h ； 13h ~移种:60m3/h ;揽祥转速 100r/min。
[0089]二级种子培养结束，其菌体浓度35% ；pH值6.6 ;无其它杂菌污染；培养时间35h。
[0090]发酵培养基制备过程:发酵罐体积130m3，有效体积为100m3。
[0091 ] 麸皮1200kg、麦芽糖1400kg、鱼粉1100kg、玉米浆1900kg、玉米蛋白粉900kg、啤酒酵母浸膏1900kg,硫酸铵800kg、轻质碳酸|丐700kg、磷酸二氢钾90kg,菜籽油4000L、氯化钠70kg、硫酸镁60kg、硫酸亚铁50kg、聚氧丙烯甘油40kg
先将发酵培养基灭菌，冷却至27°C，并用无菌空气保压。灭菌后的发酵培养基氨基氮80mg/100ml、溶磷199ug/ml、脂肪39g/L、pH6。然后将二级种子液移入发酵罐进行发酵培养。[0092] 发酵培养控制方法:
1)温度:采用变温控制方法，O~20h:培养温度29~31°C;20h~发酵结束:培养温度32 ~33。。；
2)搅拌转速:采用变频搅拌控制方法，O~IOOh:转速控制在100r/min ；101~200h:转速控制在130r/min ；201h~发酵结束:转速控制在90r/min
3)压力控制:罐压0.05~0.06MPa ；
4)pH控制:发酵过程中pH控制在6.0~7.0 ;
5)无菌检查:发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；6)空气流量:0~IOOh:200m3A ；101 ~200h:300m3/h ；201h ~发酵结束:150m3/h ；
7)溶氧控制:发酵前5h内，不控制溶氧；6~100h，溶氧控制在60%以上；101~200h，溶氧控制在20%以上；201~发酵结束:溶氧控制在30%以上。
[0093]发酵培养结束,氨基氮29mg/100ml、pH6.1、还原糖1.4g/L ;脂肪1.95g/L、菌体浓度3840%、化学效价43395u/ml、发酵周期280h。
[0094]在上述实施例1-5中，在发酵过程中需要进行补料。补料采用流加法，补料包括补油、补水、补糖和pH控制,其中
a补油工艺控制:
发酵前30h不用进行补油，
发酵时间在31~120h，当脂肪含量低于15%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为15~20%，每隔6~8h检测发酵液脂肪含量，
发酵时间在121~200h，当脂肪含量低于10%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为10~15%，每隔6~8h检测发酵液脂肪含量，
发酵时间在201h~240h，当脂肪含量低于5%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为5~8%，每隔6~8h检测发酵液 脂肪含量，
发酵时间在241h~发酵结束，当脂肪含量低于1.5%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为1.5~2.5%，每隔6~8h检测发酵液脂肪含量。
[0095]b补水工艺控制:发酵过程中，按照工艺要求必须定时补入一定量的水，其目的是控制发酵液的粘度和菌体浓度，有利于代谢产物的生成。
[0096]发酵前30h不用进行补水，
发酵时间在31~100h，当菌体浓度高于50%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40~45%，每隔6~8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在101~200h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40~45%，每隔6~8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在201h~发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35~40%，每隔6~8h检测发酵液菌体浓度。
[0097]c发酵过程pH控制工艺:
发酵前40h，pH不进行控制，
发酵时间在41~120h，若pH < 6.0，加入10~20%的氢氧化钠，调节pH至6.0~6.5 ;若pH > 6.5，加入30%的硫酸铵溶液，调节pH至6.0~6.5，
发酵时间在121~发酵结束，若pH < 6.5，加入10~20%的氢氧化钠，调节pH控至
6.5~7.0 ;若pH > 7.0，加入30%的硫酸铵溶液，调节pH至6.5~7.0。
[0098]d补入麦牙糖:
发酵前60h，还原糖含量不进行控制，
发酵61h至200h:还原糖含量< 3%时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在3~4%，
发酵201h至发酵结束:还原糖含量< 0.5%时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在0.5~1%，
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其浓度控制在0.001~0.003%。
【权利要求】
1.一种肉桂地链霉菌发酵生产莫能菌素的新型培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述一级种子培养基的组成为:麸皮1~5g/L、麦芽糖.5~9g/L、鱼粉3~7g/L、玉米衆5~9ml/L、玉米蛋白粉1~5g/L、啤酒酵母浸膏4~8g/L,硫酸铵1~5g/L、轻质碳酸钙1~5g/L、橄榄油或菜籽油5~9ml/L ； 所述二级种子培养基组成为:麸皮3~7g/L、麦芽糖6~10g/L、鱼粉6~9g/L、玉米衆8~12ml/L、玉米蛋白粉3~7g/L、啤酒酵母浸膏5~9g/L,硫酸铵3~7g/L、轻质碳酸钙1~5g/L、磷酸二氢钾0.5~0.9g/L,橄榄油或菜籽油15~25ml/L ； 所述发酵培养基组成为:麸皮8~12g/L、麦芽糖10~14g/L、鱼粉7~llg/L、玉米浆.15~19ml/L、玉米蛋白粉5~9g/L、啤酒酵母浸膏15~19g/L,硫酸铵4~8g/L、轻质碳酸钙3~7g/L、磷酸二氢钾0.5~0.9g/L，橄榄油或菜籽油25~40ml/L，氯化钠0.3~0.7g/L、硫酸镁0.2~0.6g/L、硫酸亚铁0.1~0.5g/L、聚氧丙烯甘油0.3~0.4g/L。
2.一种利用权利要求1所述培养基生产莫能菌素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为: . 1)一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至25~30°C，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的肉桂地链霉菌母瓶发酵液按照0.3~0.5L/m3的接种量接入该一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度20~25%、pH值6.5~8.5、培养时间25~35h时移种； . 2)二级种子培养:先将二级种子培养基灭菌，冷却至25~30°C，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在9~11%，至菌体浓度30~35%、pH值6.5~8.5、培养时间30~35h时移种； . 3)发酵培养:先将发酵培养基灭菌，冷却至20~27°C，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在9~11%，至菌体浓度35~40%、还原糖< 1.5g/L、脂肪:< 2g/L、氨基氮:10 ~30mg/100ml、化学效价> 43000u/mL、pH:6.0~7.0、培养时间260~280h时终止发酵。
3.按照权利要求2所述的培养方法，其特征是: 灭菌后的一级种子培养基的质量要求:氨基氮:50~60mg/100ml、溶磷:100~150ug/ml、脂肪:10 ~25g/L、pH:6.5 ~7.5 ; 灭菌后的二级种子培养基的质量要求:氨基氮:60~70mg/100ml、溶磷:100~150ug/ml、脂肪:15 ~30g/L、pH:6.5 ~7.5 ; 灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮:70~80mg/100ml、溶磷:150~200ug/ml、脂肪:25 ~40g/L、pH:6 ~7。
4.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述培养好的母瓶发酵液质量要求为:pH6~8 ;菌体浓度10~30% ;镜检无杂菌；发酵单位15000~25000u/ml。
5.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养条件为:罐压.0.03~0.05MPa ;罐温31~33°C;空气流量:0~5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h~移种:50~60m3/h ;揽祥转速60~80r/m1n。
6.按照权利要求2所述的培养方法，其特征是在于所述二级种子培养条件为:罐压.0.03 ~0.05MPa ;罐温 31 ~33°C;空气流量:0 ~12h，20 ~30m3/h ;13h ~移种:50 ~60m3/h ;揽拌转速80~100r/m1n。
7.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述发酵培养条件为: a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6~7 ; b温度:采用变温控制方法，O~20h:培养温度29~31°C;20h~发酵结束:培养温度32 ~33。。； c搅拌转速:采用变频搅拌控制方法，O~IOOh:转速控制在100r/min ;101~200h:转速控制在130r/min ；201h~发酵结束:转速控制在90r/min ；d压力控制:罐压0.05~0.06MPa ；e pH控制:发酵过程中pH控制在6.0~7.0 ; f 空气流量:0 ~IOOh:150 ~200mVh ;101 ~200h:250 ~300m3/h ;201h ~发酵结束:100 ~150m3A ；h溶氧控制: 发酵前5h内，不控制溶氧； .6~100h，溶氧控制在60%以上； .101~200h，溶氧控制在20%以上； .201~发酵结束:溶氧控制在30%以上。
8.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于在发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补油、补水、补糖和pH控制，其中 a补油工艺控制: 发酵前30h不用进行补油， 发酵时间在31~120h，当脂肪含量低于15%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为15~20%，每隔6~8h检测发酵液脂肪含量， 发酵时间在121~200h，当脂肪含量低于10%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为10~15%，每隔6~8h检测发酵液脂肪含量， 发酵时间在201h~240h，当脂肪含量低于5%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为5~8%，每隔6~8h检测发酵液脂肪含量， 发酵时间在241h~发酵结束，当脂肪含量低于1.5%，补入橄榄油或菜籽油，控制脂肪含量为1.5~2.5%，每隔6~8h检测发酵液脂肪含量；b补水工艺控制: 发酵前30h不用进行补水， 发酵时间在31~100h，当菌体浓度高于50%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40~45%，每隔6~8h检测发酵液菌体浓度， 发酵时间在101~200h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40~45%，每隔6~8h检测发酵液菌体浓度， 发酵时间在201h~发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35~40%，每隔6~8h检测发酵液菌体浓度；c发酵过程pH控制工艺: 发酵前40h，pH不进行控制， 发酵时间在41~120h，若pH < 6.0，加入10~20%的氢氧化钠，调节pH至6.0~6.5 ;若pH > 6.5，加入30%的硫酸铵溶液，调节pH至6.0~6.5，发酵时间在121~发酵结束，若pH < 6.5，加入10~20%的氢氧化钠，调节pH控至.6.5~7.0 ;若pH > 7.0，加入30%的硫酸铵溶液，调节pH至6.5~7.0 ; d补入麦芽糖: 发酵前60h，还原糖含量不进行控制， 发酵61h至200h:还原糖含量< 3%时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在3~4%， 发酵201h至 发酵结束:还原糖含量< 0.5%时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在0.5~1%， 上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其浓度控制在0.001~0.003%。
【文档编号】C12P17/16GK103937848SQ201410147478
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】任勇, 王 义 申请人:宁夏泰瑞制药股份有限公司