CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA。本发明提供了CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA以及涉及到中间载体和应用。利用本发明制备的特异性靶向人CCR5基因的sgRNA能够精确靶向人CCR5基因并且实现基因敲除。该制备方法步骤简单、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系统的敲除效率高。
【专利说明】CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR_Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA。
【背景技术】
[0002]人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，属反转录病毒的一种。普遍认为，人类免疫缺陷病毒的感染导致艾滋病，艾滋病是后天性细胞免疫功能出现缺陷而导致严重随机感染及继发肿瘤并致命的一种疾病。艾滋病自1981年在美国被识别并发展为全球大流行至2003年底，已累计导致两千余万人死亡。人类免疫缺陷病毒通常也俗称为“艾滋病病毒”。自1981年发现第一例由HIV引起的艾滋病的25年以来，尽管对艾滋病的临床治疗已有了很大进展，但是仍无有效治愈手段可以攻破此科学难题。研究表明，HIV可分为HIV-1和HIV-2两种亚型，HIV-1致病力强，是引起艾滋病的主要病原体。 [0003]病毒特异的⑶4+T细胞是针对HIV免疫应答的重要组成部分，也是HIV-1感染过程的首要靶点。自1984年发现HIV-1通过与CD4结合感染宿主细胞，随后研究又发现仅有CD4分子并不能介导HIV-1的侵入，同时还需要一种或几种辅助受体。1996年证实，趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV-1感染的辅助受体(coreceptor)。其中，趋化因子CCR5，作为G蛋白偶联因子超家族(GPCR)成员的细胞膜蛋白，是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一。一个接触HIV但未检测到HIV感染的个人，带有CCR5编码基因32个核苷酸缺失，表明了 CCR5影响HIV病毒入侵细胞。因而以CCR5为靶点的HIV-1受体拮抗剂越来越受关注，主要有趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物等。这些抗病毒活性强、亲和力高的CCR5拮抗剂，已有一部分进入了临床试验阶段。
[0004]尽管辅助受体拮抗剂可有效预防HIV-1感染，遏制艾滋病的流行，但是该类抑制剂的发展也面临着挑战。长期使用一种抑制剂，最终会使HIV-1产生耐药性，不幸的是，几乎所有的小分子拮抗剂都会产生耐药性，随着耐药性的不断出现，使得现有的抗HIV-1药物难以达到理想的治疗效果。因此，从基因组层面失活CCR5具有重要的治疗价值，这样，特异性靶向CCR5引起了人们的广泛关注。
[0005]2008 年，Sangamo 成功的利用 Engineered zinc finger nucleases (ZFNs)在⑶4+T细胞上实现CCR5的敲除，如今这项名为SB-728-T的项目已被尝试应用于HIV感染人群的基因治疗，并已进入临床二期阶段。这一基因编辑产品通过敲除分离到的病人的CD4+T细胞的CCR5，然后自体回输到病人，可以用于HIV感染的治疗。越来越多的实验结果表明CCR5基因是一个可靠、高效和安全的治疗HIV的靶点，能够实现CCR5在基因组层面上的敲除也是可靠、高效和安全的治疗方法。
[0006]然而，即使在经过真核抗性筛选之后，ZFN靶向敲除CCR5的效率也只有大约为30%。很明显，这个效率还是差强人意，现有的技术还很难满足需要，人们期待找到更高效的CCR5的敲除策略。通过靶向敲除HIV感染人群的⑶4+T细胞上的CCR5，达到HIV感染人群治疗的目的。
[0007]规律成族间隔短回文重复系统(clusteredregularly interspaced shortpalindromic repeat; CRISPR-associated，CRISPR_Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strandbreaks, DSB),在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologous endjoining, NHEJ),造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除(图1)。
[0008]这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，在2012年开始像爆炸一般流行开来。由于其容易操作、可以同时靶向多个基因，可以高通量制备、造价低等优势，Cas9已经成为一种发展最快的技术(Pennisi，2013)。正是由于其优越性，这一技术在Nature推荐的2013十大进展中位列第一(http://www.nature, com/news/365-days-nature-s-10-l.14367)，在 Science 推荐的 2013 十大进展中位列第二位(http://news.sciencemag.0rg/breakthrough-of-the-year-2013)。[0009]Cas9 靶向切害 IjDNA 是通过两种小 RNA-crRNA (CRISPR RNA)和 tracrRNA
(trans-activating crRNA)和祀序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA (single guide RNA)。因此，sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性敲除目标基因的先决条件，无论是脱靶还是错误靶向，都会影响CRISPR-Cas9对目标基因的特异性敲除。因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术(图1)。
[0010]与ZFN相比，CRISPR-Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势。为高效靶向敲除CCR5，实现艾滋病及其相关疾病的治疗提供了一种可能的选择。本发明的目的就是要验证利用CRISPR-Cas9高效靶向敲除CCR5提供相应的技术方案，以达到特异性敲除CCR5的目的。
[0011]参考文献:
Mali P，Esvelt KMj Church GM.Cas9 as a versatile tool for engineeringbiology.Nat Methods.2013 Oct; 10 (10): 957-63.do1: 10.1038/nmeth.264.Pennisi E.The CRISPR craze.Science.2013 Aug 23;341 (6148):833-6.do1:10.1126/science.341.6148.833.Perez EEj Wang J，Miller JCj Jouvenot Y，Kim KAj Liu 0，Wang N，Lee G，Bartsevich VVj Lee YLj Guschin DY， Rupniewski I， Waite AJj Carpenito C， CarrollRGj Orange JSj Urnov FDj Rebar EJj Ando D，Gregory PD，Riley JLj Holmes MCj JuneCH.Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing usingzinc-finger nucleases.Nat Biotechnol.2008 Jul;26(7):808-16.do1: 10.1038/nbtl410.Badia R， Riveira-Munoz E， Clotet B， Este JAj Ballana E.Gene editing usinga zinc-finger nuclease mimicking the CCR5 Δ 32 mutation induces resistance toCCR5_using HIV-1.J Antimicrob Chemother.2014 Mar 20.Tebas P，Stein D，Tang WWj Frank I，Wang SQj Lee G，Spratt SKj SuroskyRTj Giedlin MAj Nichol G，Holmes MCj Gregory PD，Ando DGj Kalos M，Collman RGjBinder-Scholl G， Plesa G， Hwang WTj Levine BLj June CH.Gene editing of CCR5in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV.N Engl J Med.2014 Mar6;370(10):901-10.do1: 10.1056/NEJMoal300662.Kay MAj Walker BD.Engineering cellular resistance to HIV.N Engl J Med.2014 Mar 6;370 (10):968-9.do1: 10.1056/NEJMel400593。
【发明内容】
[0012]针对现有使用ZFN靶向CCR5进行艾滋病治疗所存在的问题:(I)效率较低，只能少量敲除CCR5 ;(2)单个靶位点可能只造成非移码突变从而无法有效敲除CCR5 ; (3)设计与合成一对特异性的ZFN费时、费力、费钱，使得其花费昂贵等。本发明设计、合成了一组在CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因中特异性靶向CCR5基因的sgRNA，并分别将该sgRNA与线性的pGL3-U6-sgRNA质粒连接成载体，将一对正向和反向sgRNA寡核苷酸载体与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒一起成功转染细胞即可实现CCR5基因的敲除。本申请提供了一种利用Cas9/sgRNA快速、简便、高效、特异性敲除CCR5的策略。有效地解决了利用ZFN治疗存在的问题:(I)效率高，CCR5敲除效率达到60%以上；(2)既可以针对CCR5的多个编码序列进行同时敲除，也可 以针对多个靶基因进行同时敲除；(3)提供了高效的sgRNA ； (4) sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产。
[0013]本申请的技术方案如下:
一、sgRNA寡核苷酸的设计和选择
1.靶向CCR5基因的sgRNA的设计:
因为没有使用体外转录，只是构建普通载体的方式制作。所以如无特殊说明，文中的sgRNA序列指的是sgRNA对应DNA序列。
[0014](I)在CCR5基因上选择5’-GGN(19)GG的序列，如果没有5’-GGN(19)GG的序列，5’ -GN(20)GG 或者 5’ -N(21)GG 也可以。
[0015](2) sgRNA在CCR5基因上的靶向位点位于基因的外显子。
[0016](3) sgRNA在CCR5基因上的靶向位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。
[0017](4)在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是
否唯一。
[0018]2.靶向CCR5基因的sgRNA的选择:
(I)不能离ATG起始子太近，防止转录会后下游另一个ATG开始而出现一个被截短的基因形式，不能保证基因完全失活。
[0019](2) sgRNA在CCR5基因上的靶向位点位于整个基因的前中段部分，尤其宜在自然界中存在的32bp缺失所造成的跨膜区域缺损型突变。
[0020](3)选择相隔一定距离(l(T30bp)成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。
[0021]二、构建sgRNA的寡聚核苷酸双链
根据选择的sgRNA,在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)(如果序列本身在5’端已经有I或者2个G，那么就对应的省略I或者2个G);根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火,退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链,如下:
【权利要求】
1.在CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因中用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA，其特征为: (1)所述sgRNA在CCR5基因上的靶序列符合5’_GGN(19)GG、5，_GN(20)GG或者5’ -N(21)GG的序列排列规则； (2)所述sgRNA在CCR5基因上的靶序列位于基因的外显子； (3)所述sgRNA在CCR5基因上的靶序列位于不同的各种剪切形式的共有外显子上； (4)所述sgRNA在CCR5基因上的靶序列是唯一的。
2.如权利要求1所述的在CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因中用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA，其特征为:其对应的DNA序列如序列表SEQ ID N0.15-114任意一条序列所示。
3.如权利要求1所述的在CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因中用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA，其特征为:其对应的DNA序列如序列表SEQ ID N0.20、22、28、29、38、47、53、55、56、58、60或者63任意一条序列所不。
4.如权利要求1所述的在CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因中用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA，其特征为:其对应的DNA序列如序列表SEQ ID N0.53或者58任意一条序列所示。
5.CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法，其特征为包括如下步骤: (I)权利要求1-4任意一项所述的sgRNA，在其对应DNA序列的5’加上CCGG，如果序列本身在5’端已经有I或者2个G，那么就对应的省略I或者2个G，合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo ;权利要求1_4任意一项所述的sgRNA,获得其对应DNA序列的互补链,并且在互补链的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo ;将合成的I对互补的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火,退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸； (2 )线性化序列如序列表SEQ ID N0.6所示的pGL3_U6_sgRNA质粒；将退火的双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3_U6-hCCR5sg质粒；pGL3-U6-hCCR5sg质粒转化感受态细菌并涂Amp+平板，挑选阳性克隆并用序列如序列表SEQ ID N0.5所示的通用引物U6测序的方法鉴定出阳性克隆；37° C摇床摇阳性克隆菌过夜并用 AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (AP-MN-P-250)抽提 pGL3_U6_hCCR5sg 质粒； (3)用脂质体装载pGL3-U6-hCCR5sg质粒和序列为SEQID N0.7的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF 质粒，共转染细胞； (4)用T7EN1酶切检测和TA克隆测序确认CCR5基因已经被敲除并获得基因敲除的细胞。
6.如权利要求5所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法，其特征为:步骤(3)所述的脂质体为 Lipofectamine ? 2000 Transfection Reagent。
7.如权利要求6所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法，其特征为:步骤(I)所述的sgRNA其对应的DNA序列为序列表SEQ ID N0.53或者58任意一条序列所示，分别对应的步骤(2)和(3)所述的pGL3-U6-hCCR5sg质粒的序列为序列表SEQ ID N0.10或者11任意一条序列所示，即sgRNA序列为SEQ ID N0.53对应的pGL3-U6_hCCR5sg质粒为 SEQ ID N0.10，sgRNA 序列为 SEQ ID N0.58 对应的 pGL3_U6_hCCR5sg 质粒为 SEQ IDN0.11。
8.在如权利要求6所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法中用到的pGL3-U6-hCCR5sg 质粒。
9.在如权利要求7所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法中用到的pGL3-U6-hCCR5sg质粒，其特征为序列如序列表SEQ ID N0.10或者11任意一条所述。
10.CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法，其特征为包括如下步骤: (I)权利要求1-4任意一项所述的sgRNA，在其对应的DNA链5’加上CCGG合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo ;权利要求1-4任意一项所述的sgRNA,获得其对应DNA的互补链，并且在互补链的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo ;将合成的I对互补的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火,退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸； (2 )线性化序列如序列表SEQ ID N0.6所示的pGL3_U6_sgRNA质粒；将退火的双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3_U6-hCCR5sg质粒；pGL3-U6-hCCR5sg质粒转化感受态细菌并涂Amp+平板，挑选阳性克隆并用序列如序列表SEQ ID N0.5所示的通用引物U6测序的方法鉴定出阳性克隆；37° C摇床摇阳性克隆菌过夜并用 AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (AP-MN-P-250)抽提 pGL3_U6_hCCR5sg 质粒； (3)用Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent装载两种或者两种以上不同的pGL3-U6-hCCR5sg质粒和序列为 SEQ ID N0.7 的 pST1374_NLS_flag_Cas9_ZF质粒，共转染细胞； (4)用T7EN1酶切检测和TA克隆测序确认CCR5基因已经被敲除并获得基因敲除的细胞。
11.如权利要求10所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法，其特征为:步骤(3)所述的不同的pGL3-U6-hCCR5sg质粒为两种，且这两种不同的pGL3-U6_hCCR5sg质粒对应所含的两个sgRNA片段在CCR5基因上的靶向起始位点相距10-30bp。
12.如权利要求11所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法，其特征为:步骤(3)所述的两种不同的pGL3-U6-hCCR5sg质粒的序列为SEQ ID N0.10和11，这两个pGL3-U6-hCCR5sg质粒对应所含的两个sgRNA片段在CCR5基因上的靶向起始位点相距15bp0
13.权利要求1-4任意一项所述的在CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因中用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA在非诊疗目的的敲除人CCR5基因中的应用。
14.权利要求8或者9任意一项所述的pGL3-U6-hCCR5sg质粒在非诊疗目的的特异性敲除人CCR5基因中的应用。
15.权利要求8或者9任意一项所述的pGL3-U6-hCCR5sg质粒在制备抗艾滋病药物中的应用。
16.权利要求8或者9任意一项所述的pGL3-U6-hCCR5sg质粒和序列为SEQID N0.7的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒的组合物在制备抗艾滋病药物中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103923911SQ201410149287
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】杜忆南, 黄行许 申请人:黄行许