一种功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法及其抗炎活性应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法及其抗炎活性应用，特点是包括以下步骤：将嗜酸乳杆菌保藏号为CGMCCNo.8920按体积百分比2.0-4.0%接种在MRS培养基上，于37℃下厌氧培养18-24h后，于4000-8000g离心15-20min除去发酵液，再将沉淀菌体中加入4wt%的SDS溶液，100℃下高温裂解30min除去蛋白成分，在沉淀物中加入10wt%的三氯乙酸溶液，除去磷壁酸；取沉淀物于4℃过夜透析脱盐后，将沉淀物于-80℃预冻6h后，迅速放入真空冷冻干燥设备中于80-120Pa干燥处理24h，得到的粉末即为产品，优点是对LPS引起的炎症反应具有较好的抑炎调节功能。
【专利说明】一种功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法及其抗炎活性应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肽聚糖的制备方法，尤其是涉及一种功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法及其抗炎活性应用。
【背景技术】
[0002]乳酸菌作为一类重要的定植型肠道益生菌，被广泛的应用于发酵食品加工中，尤其是酸乳，干酪，泡菜等。肠内乳酸菌与宿主健康的密切关系，越来越多的被国内外微生物学家阐述，尤其在诱导有关免疫调控因子的释放来刺激免疫系统发挥其抗感染、抗肿瘤等生物效应方面。在乳酸菌对宿主的免疫调节活性方面，最近研究发现某些活菌和死菌间并没有显著差异，推测发挥其免疫调节作用的原因之一可能是其细胞壁中的肽聚糖(PGN)、磷壁酸(LTA)及表层蛋白等物质。益生菌肽聚糖，由于其在免疫调节中所发挥作用的探究相对缺乏，正潜移默化的被越来越多的研究者们所关注。
[0003]嗜酸乳杆菌acidophilus')作为一种重要的肠道益生菌,其细胞壁肽聚糖作为一种免疫增强剂，通过调节肠道免疫系统，可增强机体非特异性免疫功能，对机体健康具有重要作用。然而，嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法及抗炎活性研究未见相关报道，市场上也为出现以嗜酸乳 杆菌肽聚糖相关的功能食品。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种对LPS引起的炎症反应具有较好的抑炎调节功能的功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法及其抗炎活性应用。
[0005]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，具体包括以下步骤:将海洋源的嗜酸乳杆菌iLactobaciIIus acidophiIus、傾氣号为CGMCC N0.8920，按体积百分比2.0-4.0%的接种量，接种在MRS培养基上，于37°C下，厌氧培养18_24h后，于4000-8000g离心15_20min，除去菌体发酵液，然后将沉淀菌体中加入质量分数为4%的SDS溶液，100°C下高温裂解30min，除去蛋白成分；取沉淀物，在沉淀物中加入质量分数为10%的三氯乙酸溶液，除去磷壁酸；取沉淀物，将沉淀物于4°C过夜透析脱盐后，将沉淀物于-80°C预冻6h后，迅速放入真空冷冻干燥设备中于80-120Pa干燥处理24h，得到的粉末即为嗜酸乳杆菌肽聚糖。
[0006]所述的沉淀菌体与所述的SDS溶液的比例为Ig:100ml,所述的沉淀菌体与所述的三氯乙酸溶液的比例为Ig:100ml。
[0007]上述功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的抗炎活性应用，该功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖对大肠杆菌脂多糖(LPS)引起的炎症反应具有较好的抑炎调节功能，即嗜酸乳杆菌肽聚糖对iNOS及C0X-2蛋白表达具有抑制作用，在Raw264.7巨噬细胞模型上有效抑炎浓度为100_200M"g/mL。
[0008]该功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖经免疫切片发现，该功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖有效的降低了 iNOS在小肠肠壁细胞的表达量，在小鼠模型上的有效抑炎剂量为100mg/kg/d。
[0009]与现有技术相比，本发明的优点在于:
本发明一种功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法及其抗炎活性应用，首次证明该嗜酸乳杆菌肽聚糖存在着降低大肠杆菌脂多糖引起的炎症反应，为乳酸菌调节肠道免疫活性，调控相关免疫因子的释放来刺激免疫系统发挥其抗感染，开发乳酸菌新型保健因子、功能性食品或药品提供理论依据。
[0010]嗜酸乳杆菌{Lactobacillusacidophilus')，菌株为 WZ-D1,保藏号为 CGMCCN0.8920，于2014年03月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为实施例1中嗜酸乳杆菌菌体扫描电镜图；
图2为实施例1中制备的嗜酸乳杆菌肽聚糖扫描电镜图；
图3为实施例1中嗜酸乳杆菌肽聚糖的HPLC分析图谱；
图4为实施例2中嗜酸乳杆菌肽聚糖红外扫描光谱图；
图5为实施例3中嗜酸乳杆菌肽聚糖对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子的抑制作用的试验对比图；
图6为实施例3 ICR小鼠实验中不同处理组中的肠细胞中iNOS的表达量差异的试验对比图；从左到右依次为正常对照组、致病性大肠杆菌感染组、肽聚糖治疗组。
【具体实施方式】
[0012]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0013]具体实施例1
嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备
将海洋源的嗜酸乳杆菌acidophilus、保氣CGMCC N0.8920按体积百分比2.0-4.0%的接种量，接种在MRS培养基上，于37°C下，厌氧培养18_24h后，于4000-8000g离心15-20min，除去菌体发酵液，然后取沉淀菌体Ig加入质量分数为4%的SDS溶液，100°C下高温裂解30min，除去蛋白成分；取沉淀物，在沉淀物中加入质量分数为10%的三氯乙酸溶液，除去磷壁酸；取沉淀物，将沉淀物于4°C过夜透析脱盐后，将沉淀物于_80°C预冻6h后，迅速放入真空冷冻干燥设备中于80-120Pa干燥处理24h，得到的粉末即为嗜酸乳杆菌肽聚糖。样品贮藏于_40°C冰箱里以备用。其中图1为嗜酸乳杆菌菌体扫描电镜图，图2为制备的嗜酸乳杆菌肽聚糖扫描电镜图。嗜酸乳杆菌肽聚糖相比嗜酸乳杆菌有显著的不同，椭圆杆状的形态被破坏，而图2为提取的肽聚糖成分。
[0014]肽聚糖的提取率按下列公式计算，本实例所得到的肽聚糖提取率为26.5%。
[0015]提取率(%)=(肽聚糖干重/菌体干重)X 100
肽聚糖的纯度通过 HPLC方法验证,安捷伦Agilent 1200 Inf inity设备,伯乐公司的Aminex HPX-87H糖柱(300 X 7.8 mm)，进样量20ul，进样浓度lmg/ml，柱温37°C，洗脱液为5 mM硫酸溶液,流速0.5 ml/min,时间20min,检测方法225 nm紫外分光法。结果如图3所示，来源于嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的HPLC出峰时间为7.618min。本实例所得到的肽聚糖纯度为99.9%。
[0016]纯度(％)=(肽聚糖的出峰面积/检测样品的总出峰面积)X 100
上述嗜酸乳杆菌iLactobaciIlus acidophiIus)，菌株为WZ-DI,保藏号为CGMCCN0.8920，于2014年03月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0017]具体实施例2
将上述实施例1制备获得的嗜酸乳杆菌肽聚糖进行质谱(MALD1-TOF/TOF MS)检测分析；嗜酸乳杆菌肽聚糖粉末进行氨基酸分析及红外(RI)检测。
[0018]1、肽聚糖的分子量及亚结构
将I微升浓度为lmg/ml的嗜酸乳杆菌肽聚糖溶液与I微升50 mg/ml的2，5- 二羟基苯甲酸混合，混合均匀后，取I微升混合液上样，进行质谱分析。仪器型号FLEX-PC，类型为ultraflex T0F/T0F。该方案所检测到的肽聚糖的分子量为875.260 Da，具体分析如下表1所示。
[0019]表1肽聚糖离子片段表
【权利要求】
1.一种功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤:将海洋源的嗜酸乳杆菌acidophilus')嫁嚴CGMCC N0.8920,按体积百分比2.0-4.0%的接种量，接种在MRS培养基上，于37 °C下，厌氧培养18_24h后，于4000_8000g离心15-20min，除去菌体发酵液，然后将沉淀菌体中加入质量分数为4%的SDS溶液，100°C下高温裂解30min，除去蛋白成分；取沉淀物，在沉淀物中加入质量分数为10%的三氯乙酸溶液，除去磷壁酸；取沉淀物，将沉淀物于4°C过夜透析脱盐后，将沉淀物于-80°C预冻6h后，迅速放入真空冷冻干燥设备中于80-120Pa干燥处理24h，得到的粉末即为嗜酸乳杆菌肽聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，其特征在于:所述的沉淀菌体与所述的SDS溶液的比例为Ig:100ml，所述的沉淀菌体与所述的三氯乙酸溶液的比例为Ig:100ml。
3.一种根据权利要求1所述的功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的抗炎活性应用，其特征在于:该功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖对大肠杆菌脂多糖(LPS)引起的炎症反应具有较好的抑炎调节功能，即嗜酸乳杆菌肽聚糖对iNOS及C0X-2蛋白表达具有抑制作用，在Raw264.7巨噬细胞模型上有效抑炎浓度为100-200mg/mL。
4.一种根据权利要求1所述的功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖的抗炎活性应用，其特征在于:该功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖经免疫切片发现，该功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖有效的降低了 iNOS在小肠肠 壁细胞的表达量，在小鼠模型上的有效抑炎剂量为100mg/kg/d。
【文档编号】C12P19/04GK103981232SQ201410156383
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】潘道东, 吴振, 孙杨赢, 曾小群, 曹锦轩, 李桦 申请人:宁波大学