一种与植物根系性状相关的snp位点及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与植物根系性状相关的SNP位点及其应用。本发明的与植物根系性状相关的SNP位点，该SNP位点为SEQ?ID?No.4中自5’末端起第55位核苷酸，该第55bp位核苷酸为C和/或G；SEQ?ID?No.4所示DNA片段在小麦染色体1BS上的19.3cM位置。本发明提供了一个新根系主效基因位点QRt.caas-1BS及该位点的辅助筛选优良根系小麦的SNP位点。利用该SNP位点可以筛选根系性状优良的小麦，在小麦根系相关育种中发挥重要作用。
【专利说明】一种与植物根系性状相关的SNP位点及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种与植物根系性状相关的SPN位点及其应用。
【背景技术】
[0002]培育高产、广适且水肥高效型小麦新品种，不仅需要优良的农艺性状，而且需要稳固且发达的根系系统及持久的根系活力。由于小麦根系生长环境的复杂性及其研究方法和手段的局限性，使根系性状的遗传研究相对地上部组织而言滞后严重，因此育种家尚缺少对小麦根系性状遗传规律的认识和了解，限制了品种根系遗传研究进程，制约了高产广适新品种的培育。随着研究者对根系重要性的认识程度加深，一些根系研究的方法相继发展，其中营养液培养法可简便且有效地测定小麦根系性状(An等，2006)。目前为止，根系性状与分子生物学的结合，使根系相关遗传研究也取得较大进展，但总体看来，此方面的研究仍然薄弱，至于对小麦根系有目的的遗传改良，明确的开展根系遗传育种工作，尚处于启蒙发展阶段。
[0003]由于小麦根系的重要作用，利用遗传育种方法塑造与地上部生长发育相适应的、具有持久稳定活力的，尤其是在生育后期还具有活力的根系是小麦根系育种的重要目标。分子标记辅助选择 技术可跟踪转育或聚合根系基因，为培育具有优良根系且高产广适型小麦品种提供的有效技术手段。发掘控制根系性状基因及其基因标记是开展分子标记辅助育种的前提。为此，有关禾本科作物根系性状的基因定位和克隆工作相继开展，尤其在水稻和玉米中研究进展较大。例如，水稻第9染色体上携带的控制根系深度相关的QTL不仅利于提高植物抗旱性，而且可增强植物对根系营养元素的吸收，该基因的遗传区段RM242-RM201对应的标记已应用于分子辅助育种中，并获得了携带该基因且根系性状优良的株系(Steele等，2006)。控制玉米叶片ABA浓度的基因L-ABA可促进叶片光合速率，且利于根系形态发育，目前该基因标记也已开发，正用于分子辅助育种中(Giuliani等，2005)。此外，一个与玉米产量和根系相关的主效QTL已被发掘，并得到应用(Landi等，2010)。小麦基因组结构较水稻和玉米复杂，根系性状如根长度、表面积、体积和干物质重等受多基因控制，通常呈簇存在，主要分布于1D、2A、2D、3A、5A、6A和7D染色体上，单个QTL位点可解释表型变异的3.2% -19.6%，部分QTL存在上位效应。多数根部性状基因与肥水利用、农艺性状及产量性状相关基因相关联(Bai等，2013)，但鲜有紧密连锁标记的报道。
[0004]SNP (Single-nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)标记是由 DNA 序列中单个碱基的变异引起的遗传多态性，突变频率高，是基因组分布密度最高的标记。随着检测SNP的方法越来越多，而且更加经济实用，使它成为继SSR之后的新一代分子标记。SNP标记在水稻遗传图谱的构建、图位克隆和QTL定位、物种进化、标记辅助选择育种等方面已得到广泛应用(潘存红等，2007)。目前在小麦基因组研究过程中，SNP标记主要应用于遗传图谱构建和基因定位方面研究(Cavanagh等，2013)。
[0005]关联分析以连锁不平衡为基础，是鉴定自然群体内性状与遗传标记间的关系并结合遗传连锁图谱定位QTL的一种方法，已广泛用于水稻、玉米和小麦等作物的基因定位。Thornsberry等(2001)首次利用92个玉米自交系对dwarf8基因的等位变异进行关联分析，证明了 dwarf8基因不仅控制株高而且影响开花期。Breseghello和Sorrells (2006)利用62个SSR标记对95个小麦品种进行关联分析，发现2D、5A和5B染色体上携带控制籽粒形态性状的主效基因位点；而且这些位点与他们利用连锁作图群体定位的结果一致(Breseghello和Sorrells, 2007),肯定了关联分析在小麦基因定位中的有效性。Crossa等(2007)利用813个DArT标记和831个其它遗传标记对170份CIMMYT春小麦的产量性状和杆锈、叶锈、条锈及白粉病进行全基因组关联分析，发现大部分产量性状和抗病基因位点与已报道的结果一致，并定位了许多新抗性基因位点。肖永贵等(2012)利用骨干亲本周8425B衍生群体关联分析，鉴定出抗条锈病基因QYr.caas_2BL，并发掘SSR引物Xgwm501可用于对该基因辅助选择。
[0006] 京411是20世纪90年代初育成的半矮杆小麦品种，具有抗寒性强、分蘖力强、成穗率高、抗病性好、高产稳产、适应性广等优点，是北部冬麦区的骨干亲本之一。目前，利用京411已育成14个新品种(系)，其中选育出的中麦175具有抗寒、高产、广适、多抗、面条品质优良等优点，并实现了高产稳产与面条品质优良、抗寒、节水与早熟性的良好结合。2007-2012年间分别通过北京市、山西省、国家北部水地、国家黄淮旱肥地、青海省、甘肃省审定，由于其株型紧凑，成穗率高，株高在水地和旱地变幅相对较小，适合水浇地、补充灌溉地及旱肥地种植，已成为北部冬麦区和黄淮旱肥地有重要推广价值的品种。由图1可见，中麦175的主根长和根干物质重等性状较京411改良显著，骨干亲本京411仍具有较好的侧根性状。任永哲等(2012)在京411的3A染色体上定位3个控制苗期最长根长、根干物质重和地上物质干重的QTL，解释表型变异均在10%以上，而且多数根部性状基因位点直接参与调控水肥利用效率(An等，2006 ;Xu等，2013)。因此，京411和中麦175之所以成为北部冬麦区高产广适小麦品种的代表品种，可能主要与其携带的根系基因有关，定位并发掘其携带新根系基因的标记，对今后育种过程中跟踪选择携带优良根系基因的品种具有重要实用价值。
【发明内容】
[0007]本发明的一个目的是提供一种与植物根系性状相关的SNP位点及含有该SNP位点的DNA片段。
[0008]本发明所提供的与植物根系性状相关的SNP位点，该SNP位点为SEQ ID N0.4中自5’末端起第55位核苷酸，该第55bp位核苷酸为C和/或G ；SEQ ID N0.4所示DNA片段在小麦染色体IBS上的19.3cM位置。
[0009]本发明所提供的与植物根系性状相关的含有SNP位点的DNA片段，该DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，其中，该序列第55bp处碱基为C和/或G ;并且该DNA片段在小麦染色体IBS上的19.3cM位置。
[0010]本发明的另一个目的是提供一种用于检测权利要求1所述SNP位点的特异引物组。
[0011]本发明所提供的用于检测权利要求1所述SNP位点的特异引物组包括两条引物，第一条引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0012]上述特异引物组还包括一条引物，该引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0013]本发明的另一个目的是提供一种辅助筛选优良根系植物的PCR试剂盒。
[0014]本发明所提供的辅助筛选优良根系植物的PCR试剂盒，包括上述特异引物组和PCR扩增缓冲液；
[0015]所述PCR扩增缓冲液包括DNA聚合酶、dNTP、MgCl2, KCUTris和水。
[0016]所述PCR扩增缓冲液的PH值为9.0 ；
[0017]所述特异引物组中每条引物在所述PCR试剂盒中的终浓度均为0.25uM ；
[0018]所述Tris-HCl在所述PCR试剂盒中的终浓度为1mmol.L-1 ；
[0019]所述KCl在所述PCR试剂盒中的终浓度为5mmol.L-1 ；
[0020]所述MgCl2在所述PCR试剂盒中的终浓度为2.5mmol.L-1 ；
[0021 ] 所述dNTPs在所述PCR试剂盒中的终浓度为200 μ mol.L-1 ；
[0022]所述DNA聚合酶在所述PCR试剂盒中的终浓度为1.5U。
[0023]上述SNP位点、上述含有SNP位点的DNA片段、上述特异引物组、或上述PCR试剂盒在辅助筛选优良根系植物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0024]上述应用中，所述植物可为小麦；所述小麦具体可为如下品种中的任一种或任几种:碧蚂I号、藁城8901、邯6172、淮麦18、淮麦20、济麦19、济麦21、京双16、济麦22、晋麦45、良星66、临旱2号、良星99、陕354、绵阳26、烟农19、皖麦38、汶农14、西农979、小偃54、扬麦9号、中优9507、豫麦63、中麦895、周麦16、周麦18、周麦22、周麦31、周麦32、济麦20。
[0025]本发明的另一个目的是提供一种鉴别优良根系植物的方法。
[0026]本发明所提供的鉴别优良根系植物的方法，包括如下步骤:检测待测植物的染色体IBS上的19.3cM位置是否含有上述SNP位点，并且检测该SNP位点的基因型；基因型为CC的植物的根系优于基因型为CG或GG的植物。
[0027]上述鉴别优良根系植物的方法中，所述植物可为小麦；所述小麦具体为如下品种中的任一种或任几种:碧蚂I号、藁城8901、邯6172、淮麦18、淮麦20、济麦19、济麦21、京双16、济麦22、晋麦45、良星66、临旱2号、良星99、陕354、绵阳26、烟农19、皖麦38、汶农14、西农979、小偃54、扬麦9号、中优9507、豫麦63、中麦895、周麦16、周麦18、周麦22、周麦31、周麦32、济麦20 ；
[0028]上述鉴别优良根系植物的方法中，所述“基因型为CC的植物的根系优于基因型为CG或GG的植物”为基因型为CC的植物的根系总长长于基因型为CG或GG的植物。
[0029]本发明的另一个目的是提供一种辅助筛选优良根系植物的方法。
[0030]本发明所提供的辅助筛选优良根系植物的方法，包括如下步骤:检测待测植物的染色体IBS上的19.3cM位置是否含有上述SNP位点，并且检测该SNP位点的基因型；若基因型为CC，则判定所述待测植物为候选的优良根系植物。
[0031]上述辅助 筛选优良根系植物的方法中，所述“检测待测植物的染色体IBS上的
19.3cM位置是否含有权利要求1所述SNP位点，并且检测该SNP位点的基因型”的方法为如下(I)或(2):
[0032](I)利用上述任一所述的特异引物组或上述任一所述的PCR试剂盒，对待测植物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序；若测序结果为SEQ ID N0.4，且自其5’末端起第55位为C，则判定待测植物的SNP位点的基因型为CC ;若测序结果为SEQ ID N0.4和SEQID N0.5，且自SEQ ID N0.45’末端起第55位为C或G，则判定待测植物的SNP位点的基因型为CG或GG ;
[0033](2)利用上述任一所述的特异引物组或上述任一所述的PCR试剂盒，对待测植物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行凝胶电泳；若电泳显示扩增产物为173bp的一种片段，则判定待测植物的SNP位点的基因型为CC ;若电泳显示扩增产物为173bp和138bp的两种片段，则判定待测植物的SNP位点的基因型为CG或GG。
[0034]上述辅助筛选优良根系植物的方法中，所述植物可为小麦；所述小麦具体为如下品种中的任一种或任几种:碧蚂I号、藁城8901、邯6172、淮麦18、淮麦20、济麦19、济麦21、京双16、济麦22、晋麦45、良星66、临旱2号、良星99、陕354、绵阳26、烟农19、皖麦38、汶农14、西农979、小偃54、扬麦9号、中优9507、豫麦63、中麦895、周麦16、周麦18、周麦22、周麦31、周麦32、济麦20 ；
[0035]所述优 良根系为根系总长长；所述根系总长长指小麦三叶期幼苗根系总长^ 340cm,具体为根系总长> 349cm。
[0036]本发明具有以下优点:本发明的实验证明，本发明提供了一个新根系主效基因位点QRt.caas-lBS及该位点的辅助筛选优良根系小麦的SNP位点。利用该SNP位点可以筛选根系性状优良的小麦，在小麦根系相关育种中发挥重要作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为京411和中麦175的苗期根系图
[0038]图2为利用SNP位点筛选优良根系小麦的PCR扩增的结果
[0039]图3为I个SNP标记与QRt.caas-lBS基因的连锁图
【具体实施方式】
[0040]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0041]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042]所有引物合成均由北京奥科生物技术有限责任公司完成。以下实施例中所有用到的小麦材料均来自中国农业科学院国家农作物种质保存中心。
[0043]实施例1、一、与根系性状相关的SNP标记BS00022505的获得
[0044]选用冬小麦骨干亲本京411及其14个衍生品种(系)，包括衍生一代6份，衍生二代8份。
[0045]1、根系性状调查
[0046]根部试验采用水培法，即每品种选取的种子50粒，用10%的处理20-30分钟，无菌水冲洗5-6次。选取H2O2处理过的种子饱满且大小一致置于铺有滤纸的培养皿中，在培养箱暗室催芽。每个材料挑选发芽一致的种子发苗培养，培养盘置于营养液中在可控温室培养，营养液配置参照文献(Ren等，2012)。连续培养15天后对苗期根部性状进行调查。调查性状包括最长根长、侧根长、主根长、总根长、侧根表面积、主根表面积、总根表面积、总根尖数和根系干重。[0047]2、引物获得和标记分析
[0048]SNP (单核苷酸多态性)标记在博奥生物有限公司(CapitalBio Corporation, Beijing, China;http://bioservices.capitalbi0.com)利用 Illumina SNP 基因分型检测，主要分为以下步骤:1)将待测小麦品种基因组DNA进行全基因组扩增；2)扩增产物用随机内切酶酶切断化；3)将DNA片段与将DNA片段与芯片进行杂交，芯片的微珠上连接有50-mers长度特异性捕获探针，gDNA酶切后产物与探针互补序列结合；4)清洗去除未杂交上的或错配杂交上的DNA片段；5)二硝基酹(dinitrophenol)和生物素(biotin)标记的核苷酸底物(A/T和C/G)在捕获探针上进行单碱基延伸，只有与gDNA发生互补结合的探针才能得到延伸；通过染色，A/T和C/G将分别标记不同的荧光染料；6)芯片扫描，并利用软件根据两种荧光判读并输出分型结果。
[0049]利用Illumina SNP基因分型研究平台对京411及其衍生品种(系)DNA进行90kSNP芯片分型，包括BS、BobWhite、CAP、D_contig等系列标记，共计81587个，其中24080个SNP标记在京411衍生群体内存在差异。 [0050]二、关联基因定位和连锁标记BS00022505的发现
[0051]利用SAS9.2软件(SAS Institute.2000)进行基本统计量、多重比较分析，并结合SAS的Glmselect程序对SNP数据和根系性状进行逐步回归，根据P值(P〈0.01)判断关联位点。定位出 BS00022505 与位点 QRt.caas-lBS 关联(P〈0.001)。
[0052]三、BS00022505位点的等位基因特异标记鉴定
[0053]分别提取京411及14个衍生品种的全基因组DNA。分别以各个基因组DNA为模板用SNP标记BS00022505位点的等位基因特异标记KASP?基因分型检测，出现C:C分型的片段表明SNP标记BS00022505能够有效鉴定小麦品种根长基因。
[0054]表1BS00022505标记等位变异在京411衍生群体中的分离
[0055]
【权利要求】
1.一种与植物根系性状相关的SNP位点，该SNP位点为SEQ ID N0.4中自5’末端起第55位核苷酸，该第55bp位核苷酸为C和/或G ;SEQ ID N0.4所示DNA片段在小麦染色体IBS上的19.3cM位置。
2.一种与植物根系性状相关的含有SNP位点的DNA片段，其特征在于:该DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，其中，该序列第55bp处碱基为C和/或G ; 并且该DNA片段在小麦染色体IBS上的19.3cM位置。
3.一种用于检测权利要求1所述SNP位点的特异引物组，所述特异引物组包括两条引物，第一条引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示。
4.根据权利要求3所述的特异引物组，其特征在于，还包括一条引物，该引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
5.一种辅助筛选优良根系植物的PCR试剂盒，其特征在于: 所述PCR试剂盒包括权利要求2或3所述特异引物组和PCR扩增缓冲液； 所述PCR扩增缓冲液包括DNA聚合酶、dNTP、MgCl2, KCUTris和水。 所述PCR扩增缓冲液的PH值为9.0 ; 所述特异引物组中每条引物在所述PCR试剂盒中的终浓度均为0.25uM ；
所述Tris-HCl在所述PCR试剂盒中的终浓度为1mmol.L—1 ； 所述KCl在所述PCR试剂盒中的终浓度为5mmol.L—1 ； 所述MgCl2在所述PCR试剂盒中的终浓度为2.5mmol.L-1 ； 所述dNTPs在所述PCR试剂盒中的终浓度为200 μ mo I.L-1 ； 所述DNA聚合酶在所述PCR试剂盒中的终浓度为1.5U。
6.权利要求1所述SNP位点、权利要求2所述DNA片段、权利要求3或4所述的特异引物组、或权利要求4所述PCR试剂盒在辅助筛选优良根系植物中的应用。
7.一种鉴别优良根系植物的方法，包括如下步骤:检测待测植物的染色体IBS上的19.3cM位置是否含有权利要求1所述SNP位点，并且检测该SNP位点的基因型；基因型为CC的植物的根系优于基因型为CG或GG的植物。
8.一种辅助筛选优良根系植物的方法，包括如下步骤:检测待测植物的染色体IBS上的19.3cM位置是否含有权利要求1所述SNP位点，并且检测该SNP位点的基因型；若基因型为CC，则判定所述待测植物为候选的优良根系植物。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述“检测待测植物的染色体IBS上的19.3cM位置是否含有权利要求1所述SNP位点，并且检测该SNP位点的基因型”的方法为如下(I)或(2): (1)利用权利要求3或4所述的特异引物组或权利要求4所述PCR试剂盒，对待测植物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序；若测序结果为SEQ ID N0.4，且自其5’末端起第55位为C，则判定待测植物的SNP位点的基因型为CC ;若测序结果为SEQ ID N0.4和SEQID N0.5，且自SEQ ID N0.45’末端起第55位为C或G，则判定待测植物的SNP位点的基因型为CG或GG ; (2)利用权利要求3或4所述的特异引物组或权利要求4所述PCR试剂盒，对待测植物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行凝胶电泳；若电泳显示扩增产物为173bp的一种片段，则判定待测植物的SNP位点的基因型为CC ;若电泳显示扩增产物为173bp和138bp的两种片段，则判定待测植物的SNP位点的基因型为CG或GG。
10.根据权利要求6所述的应用、权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于: 所述植物为小麦； 所述小麦具体为如下品种中的任一种或任几种:碧蚂I号、藁城8901、邯6172、淮麦18、淮麦20、济麦19、济麦21、京双16、济麦22、晋麦45、良星66、临旱2号、良星99、陕354、绵阳26、烟农19、皖麦38、汶农14、西农979、小偃54、扬麦9号、中优9507、豫麦63、中麦895、周麦16、周麦18、周麦22、周麦31、周麦32、济麦20 ； 所述优良根系为根系总长长； 所述“基因型为CC的植物的根系优于基因型为CG或GG的植物”为基因型为CC的植物的根系总长长于基因型为CG或GG的植物； 所述根系总长长为小麦三叶期幼苗根系总长> 340cm，具体为根系总长> 349cm。
【文档编号】C12Q1/68GK103952402SQ201410157719
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】何中虎, 肖永贵, 夏先春, 陈新民, 李思敏 申请人:中国农业科学院作物科学研究所