一种低能离子注入保护剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种低能离子注入保护剂及其应用。本发明公开的一种保护剂，该保护剂由溶剂和溶质组成，溶剂为蒸馏水，溶质为海藻糖、组氨酸、三聚磷酸钠、谷氨酸钠和透明质酸钠。本发明公开的保护剂可以大幅度提高菌种离子注入条件下的成活量。
【专利说明】一种低能离子注入保护剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】中用于离子注入时的一种保护剂及其应用；特别涉及一种低能离子注入保护剂及其应用。
【背景技术】
[0002]作为一种生物诱变手段，离子注入技术由于其独特的诱变机理和显著的生物学效应受到关注，应用于植物和微生物育种。低能离子束对微生物有很强的致突变作用，已被成功应用于微生物诱变育种研究，取得巨大的经济和社会效益。但离子注入需要在完全干燥、真空度为0.06帕的条件下，大多数微生物很难承受这样极端的环境，死亡率很高，甚至有些微生物很难存活，需要有效的保护剂来降低死亡率。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种低能离子注入保护剂及其应用。
[0004]本发明提供的一种保护剂，该保护剂由溶剂和溶质组成，溶剂为蒸馏水，溶质为海藻糖、组氨酸、三聚磷酸钠、谷氨酸钠和透明质酸钠。
[0005]上述保护剂中，所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为2.0-4.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.4-1.8g/100ml，所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为
1.0-1.6g/100ml,所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.3-0.8g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为 0.02-0.08g/100ml，溶液的pH值为6.0。
[0006]上述任一所述的保护剂中，所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为3.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.6g/100ml，所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.3g/100ml,所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.5g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml ；
[0007]所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或
0.08g/100ml。
[0008]上述任一所述的保护剂中，所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为2.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.8g/100ml，所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.6g/100ml，所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.3g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml ；
[0009]所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或
0.08g/100ml。
[0010]上述任一所述的保护剂中，所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为4.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.4g/100ml，所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.0g/100ml,所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.8g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml ；
[0011]所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或0.08g/100ml。
[0012]上述任一所述的保护剂中，所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为2.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.4g/100ml，所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.0g/100ml，所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.3g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml ；
[0013]所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或0.08g/100ml。
[0014]上述任一所述的保护剂中，所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为4.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.8g/100ml，所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.6g/100ml,所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.8g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml，溶液的pH值为6.0 ；
[0015]所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或0.08g/100ml。
[0016]上述任一所述的保护剂中，所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为2.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.4g/100ml，所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.0g/100ml,所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.8g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml ；
[0017]所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或
0.08g/100ml。
[0018]上述任一所述的保护剂中，所述pH具体用体积百分含量为I %的盐酸的水溶液调 节。
[0019]一种提高菌种离子注入条件下的成活量的方法也属于本发明的保护范围，是将灭菌的上述任一所述的保护剂与菌种的菌体混合，得到混合液；将混合液在无菌状态下干燥，再进行离子注入，得到离子注入后的菌种；
[0020]所述菌种与所述上述任一所述的保护剂的比例具体为108数量级的CFU:lml ；
[0021]所述菌具体为乳酸菌、酵母菌或大肠杆菌；
[0022]所述乳酸菌具体为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus JCM1136)、植物乳杆菌亚种(Lactobacillus pi ant arum subsp.plantarum JCM1149)、戍糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus JCM1558)或肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroidesJCM6124)；
[0023]所述酵母菌具体为酿酒酵母；
[0024]所述酿酒酵母具体为酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae JCM21855)；
[0025]上述菌均购自日本菌种保藏中心(JCM)；
[0026]所述大肠杆菌具体为大肠杆菌(Escherichia coli BL21)；
[0027]所述离子注入的条件具体为注入能量:30Kev，N+ ;注入条件:真空度为0.06Pa，所述菌完处于完全干燥状态。
[0028]上述任一所述的保护剂在提高菌种离子注入条件下的成活量中的应用也属于本发明的保护范围；
[0029]所述菌具体为乳酸菌、酵母菌或大肠杆菌；[0030]所述乳酸菌具体为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus JCM1136)、植物乳杆菌亚种(Lactobacillus pi ant arum subsp.plantarum JCM1149)、戍糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus JCM1558)或肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroidesJCM6124)；
[0031]所述酵母菌具体为酿酒酵母；
[0032]所述酿酒酵母具体为酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae JCM21855)；
[0033]上述菌均购自日本菌种保藏中心(JCM)；
[0034]所述大肠杆菌具体为大肠杆菌(Escherichia coli BL21)；
[0035]所述离子注入的条件具体为注入能量:30Kev, N+ ;注入条件:真空度为0.06Pa,所述菌完处于完全干燥状态。[0036]本发明提供的保护剂可以大幅度提高菌种离子注入条件下的成活率，对于进行生物诱变的菌普遍适用。
【具体实施方式】
[0037]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0038]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039]鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus JCMl 136)购自日本菌种保藏中心(JCM)。
[0040]植物乳杆菌亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum JCM1149)购自日本菌种保藏中心(JCM)。
[0041]戍糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus JCM1558)购自日本菌种保藏中心(JCM)。
[0042]肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides JCM6124)购自日本菌种保藏中心(JCM)。
[0043]酿酒酵母(Saccharomycecerevisiae JCM21855)购自日本菌种保藏中心(JCM)。
[0044]大肠杆菌(Escherichiacoli BL21)在文献“Bystander Effects Induced byHeavy1ns in Escherichia Col1.BL21”中公开过,公众可从郑州大学获得。
[0045]各种保护剂:
[0046]基础保护液由溶剂和溶质组成，溶剂为蒸馏水，溶质为海藻糖、组氨酸、三聚磷酸钠、谷氨酸钠；各溶质的浓度如实施例中所述，将溶液的PH值用体积百分含量为1%的盐酸的水溶液调节至6.0 ；
[0047]下述实施例中的保护剂I为在基础保护液中加0.02g/100ml的透明质酸钠；
[0048]下述实施例中的保护剂2为在基础保护液中加0.05g/100ml的透明质酸钠；
[0049]下述实施例中的保护剂3为在基础保护液中加0.08g/100ml的透明质酸钠。
[0050]加入透明质酸钠前后的保护液的体积变化可忽略。
[0051]下述实施例中的注入能量:30KeV，N+ ;注入条件:真空度为0.06Pa，微生物处于完全干燥状态。
[0052]实施例1、保护剂对鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus JCMl 136)的保护作用
[0053]该实施例中保护剂1、保护剂2和保护剂3配制时所用的基础保护液由溶剂和溶质组成，溶剂为蒸馏水，溶质为海藻糖、组氨酸、三聚磷酸钠、谷氨酸钠；所述海藻糖在所述基础保护液中的浓度为3.0g/100ml,所述组氨酸在所述基础保护液中的浓度为1.6g/100ml,所述三聚磷酸钠在所述基础保护液中的浓度为1.3g/100ml，所述谷氨酸钠在所述基础保护液中的浓度为0.5g/100ml,将溶液的pH值用体积百分含量为I %的盐酸的水溶液调节至
6.0。
[0054]保护试验:
[0055]将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus JCMl 136)菌用MRS液体培养基进行培养，得到菌液，并将菌液的浓度调整为约108CFU/mL。在注入能量:30Kev，N+ ;注入条件:真空度为0.06Pa，微生物处于完全干燥状态条件下进行注入实验，实验步骤如下:
[0056]ImL菌液一5000rpm离心一弃上清液,得沉淀,加ImL灭过菌的各保护剂(表1所示)混匀，得混合液一取0.2mL混合液均匀涂布在灭过菌的培养皿中一无菌状态下干燥一在注入能量:30Kev，N+ ;注入条件:真空度为0.06Pa，条件下注入一用无菌水将注入后的菌洗下，稀释涂MRS固体培养基，用稀释平板计数法计算菌的成活量。
[0057]以蒸馏水、体积百分含量为5%的甘油水溶液、体积百分含量为10%的甘油水溶液作为对照进行上述实验。
[0058]鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus JCMl 136)菌的原始菌量 3.0X IO8,保护剂对其保护效果如表1所示。
[0059]表1保护剂对鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus JCMl 136)的保护作用
[0060]
【权利要求】
1.一种保护剂，该保护剂由溶剂和溶质组成，溶剂为蒸馏水，溶质为海藻糖、组氨酸、三聚磷酸钠、谷氨酸钠和透明质酸钠。
2.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于:所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为2.0-4.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.4-1.8g/100ml,所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.0-1.6g/100ml，所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为`0.3-0.8g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml，溶液的pH值为6.0。
3.根据权利要求1或2所述的保护剂，其特征在于:所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为3.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.6g/100ml，所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.3g/100ml,所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.5g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml ； 所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或`0.08g/100ml。
4.根据权利要求 1或2所述的保护剂，其特征在于:所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为2.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.8g/100ml，所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.6g/100ml,所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.3g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml ； 所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或`0.08g/100ml。
5.根据权利要求1或2所述的保护剂，其特征在于:所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为4.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.4g/100ml，所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.0g/100ml,所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.8g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml ； 所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或`0.08g/100ml。
6.根据权利要求1或2所述的保护剂，其特征在于:所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为2.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.4g/100ml,所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.0g/100ml,所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.3g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml ； 所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或`0.08g/100ml。
7.根据权利要求1或2所述的保护剂，其特征在于:所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为4.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.8g/100ml,所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.6g/100ml,所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.8g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml，溶液的pH值为6.0 ; 所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或`0.08g/100ml。
8.根据权利要求1或2所述的保护剂，其特征在于:所述海藻糖在所述保护剂中的浓度为2.0g/100ml,所述组氨酸在所述保护剂中的浓度为1.4g/100ml,所述三聚磷酸钠在所述保护剂中的浓度为1.0g/100ml,所述谷氨酸钠在所述保护剂中的浓度为0.8g/100ml，所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度为0.02-0.08g/100ml ； 所述透明质酸钠在所述保护剂中的浓度具体为0.02g/100ml、0.05g/100ml或.0.08g/100ml。
9.一种提高菌种离子注入条件下的成活量的方法，是将灭菌的权利要求1-8任一所述的保护剂与菌种的菌体混合，得到混合液；将混合液在无菌状态下干燥，再进行离子注入，得到离子注入后的菌种。
10.权利要求1-8任一所述的保护剂在提高菌种离子注入条件下的成活量中的应用。
【文档编号】C12N13/00GK103937780SQ201410162043
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】谈重芳, 苏明杰, 庞会利, 焦浈, 王雁萍, 李宗伟 申请人:郑州大学