一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法，主要包括以下步骤：a)菌种活化与增殖培养；b)收集菌体；c)预冻及真空冷冻干燥。本发明中采用白扁豆多糖等作为抗冻因子，使保加利亚乳杆菌具有更好的抗冻能力，同时使用薏苡仁和山药混合多糖提取物等为冻干保护剂，使菌粉有更高的存活率，同时更好地开发利用了我国“药食同源”中的药物资源。
【专利说明】—种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于保加利亚乳杆菌制品生产【技术领域】，涉及一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法。
【背景技术】
[0002]保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)是发酵生产乳制品的重要乳酸菌，其能赋予酸乳产品柔和的酸味和香气，可以改进产品的品质和营养，还具有维持微生态环境、抗突变、抗肿瘤、降血脂和提高免疫力等重要功能，因此一直是食品工业、医药和微生态学等领域关注的热点。
[0003]菌种在真空冷冻干燥时，酶的活性丧失少，并能保持菌种形态、色泽，冷冻干燥菌粉复水性好，脱水彻底，保存期长，储存运输和使用都很方便。但是，在实际的使用时，冷冻干燥过程中水的结晶、细胞的失水等情况使得菌体出现死亡或损伤，对于菌种的保存、生产使用非常不利。有报道称，菌体在无任何保护措施下冻干时会使其存活率很低，甚至低至
0.1%。
[0004] 目前，利用冻干技术制备和贮存保加利亚乳杆菌菌粉己有很多报道。在实际使用中，需要获得高活菌数的菌粉和减少细胞在冻干过程中的损伤。目前最主要的方法是在冷冻干燥前加入冻干保护剂来制备冻干菌粉，如CN102952755A中公开了一种保加利亚乳杆菌冻干复合保护剂，其配方如下:20~30重量份乳糖、20~30重量份脱脂乳粉、3~5重量份抗坏血酸钠、0.2~0.6重量份聚乙二醇4000、0.2~0.8重量份聚乙烯吡咯烷酮、0.5~
2.0重量份牛血清白蛋白和100份蒸馏水。另外也有大量关于保加利亚乳杆菌冻干菌粉的报道。对于保加利亚乳杆菌的増菌，专利CN102952722A公开了一种保加利亚乳杆菌的增菌培养基和制备方法，其增菌培养基配方如下:每IOOmL蒸馏水包括0.4g乳糖、0.4mL新生牛血清、0.8g酪蛋白水解物、0.090mL质量浓度为1%的羟脯氨酸、0.050mL质量浓度为1%的谷氨酸和0.59g Κ2ΗΡ04。专利CN1844354A也公开了一种保加利亚乳杆菌增菌培养基，其主要成分为:菊芋汁基础培养基100mL、5-15mL番茄汁、0.5_2g蛋白胨、0.1-1.0g乳糖。还有许多研究者也报道了保加利亚乳杆菌增菌培养基。专利CN103387939A报道了一种适于25°C发酵酸奶的保加利亚冻干菌粉的制备方法。
[0005]冻干保护剂的使用极大地提高了菌体在真空冷冻干燥下的存活率和冻干菌粉的稳定性，还可以在培养基中添加一些分子物质，这些物质可在保加利亚乳杆菌培养时于体内积累或转化成其它物质，进而抑制冻干过程中细胞损伤的发生。这些物质的添加也可改变保加利亚乳杆菌细胞膜脂肪酸组成，甚至诱导细胞产生大量的抗冻蛋白，从而有效提高保加利亚乳杆菌菌体的抗冷冻能力，可以达到减少甚至避免菌体冻干损伤、提高活菌存活率和菌粉活菌数、减少复合冻干保护剂的添加量、延长冻干保加利亚乳杆菌菌粉常温保存期的目的。目前还没有检索到有关使用保加利亚乳杆菌増菌抗冻培养基来制备冻干菌粉的报道和发明专利。同时，使用“药食同源”药物中的有效物质来刺激保加利亚乳杆菌的菌体增殖、作为抗冻因子和作为冻干保护剂的报道也较少。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种更好地开发利用我国中药资源作为冻干保护剂、提高菌体抗冻能力的保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法。
[0007]本发明的技术方案包括以下步骤:
[0008]a)菌种活化与增殖培养:将保加利亚乳杆菌接种到MRS液体培养基中活化，将已活化的菌种接种于增殖抗冻培养基中增殖培养，得到增殖的菌液；
[0009]b)收集菌体:将上述增殖的菌液离心处理，弃去上清液，得到菌泥；
[0010]c)干燥:在所制备的菌泥中按每克菌泥添加0.2-0.24g脱脂奶粉、0.06-0.1g抗坏血酸钠、0.8-1.4mL的磷酸缓冲液、0.1-0.3g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀后真空冷冻干燥，即得保加利亚乳杆菌冻干菌粉；
[0011]所述増殖抗冻培养基配方组成为:乳糖10-20g、海藻糖2_6g、白扁豆多糖
0.2-0.6g、低聚木糖2-4g、酵母提取物4-10g、大豆蛋白胨8_10g、谷氨酸钠0.6-1.0g、梓檬酸氢二铵 1.0-2.0g、乙酸钠 1.0-2.0g、磷酸氢二钾 1.0-2.0g, MnSO40.01-0.06g、吐温800.5-1.0mL、蒸馏水 1000mL。 [0012]所述步骤a)中活化是指将保加利亚乳杆菌接种到MRS液体培养基中于35_38°C培养22-26h，再按每IOOmL培养基中接种3_5mL菌种的比例，接种于与上述MRS液体培养基相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。
[0013]所述步骤a)中增殖培养的接种比例为每IOOmL增殖抗冻培养基中接种3_5mL已活化的菌种。
[0014]所述步骤a)中增殖培养是于35_38°C下培养16_18h。
[0015]所述增殖抗冻培养基的配置步骤包括:
[0016]首先按量称取乳糖、白扁豆多糖、酵母提取物、大豆蛋白胨、柠檬酸氢二铵、乙酸钠、磷酸氢二钾、MnSO4和吐温80溶解于蒸馏水a中，加热溶解、搅拌均匀，再调pH值至6.4-6.6，按照装量70% -90%盛放于厌氧瓶中，于118-121°C灭菌15min，冷却至室温，得到已灭菌的培养基；
[0017]再称取海藻糖、低聚木糖和谷氨酸钠溶解于蒸馏水b中，所述蒸馏水a和蒸馏水b的总量为1000mL,混合均匀后过滤除菌，将滤液与上述已灭菌的培养基按照无菌操作要求混合均匀，即得保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基。
[0018]所述白扁豆多糖的制备步骤包括:
[0019]首先将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100-150份蒸馏水中，调节pH值至
5.0-6.8 ；
[0020]其次在40-55 °C的水浴温度下加入白扁豆质量0.5-2%、活力为8000-1000(^/^的纤维素酶和白扁豆质量1-2%、活力为20000-30000U/g的果胶酶，保温1.5-2.5h后加热至沸腾，再保温15-20min ；
[0021]然后抽滤并将滤液浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，静置10_14h后抽滤，将所得滤渣于45-55°C烘干，即得白扁豆粗多糖；
[0022]最后取干燥的白扁豆粗多糖溶于水浴加热至50_70°C的蒸馏水中，按每0.5g白扁豆粗多糖溶于15_20mL蒸馏水的比例计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量1-4%的木瓜蛋白酶，酶解0.5-lh后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15-25%体积的Sevag试剂除蛋白20_30min ;2000-4000rpm离心15_20min后取上清液，反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。
[0023]所述步骤b)中离心处理为0-4°C、8000-10000rpm离心15_20min。
[0024]所述薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备步骤包括:
[0025]首先将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药混合物粉碎后浸泡于150-200份蒸馏水中，其中薏苡仁和去皮的山药按1:1混合，调节pH值至6.0-7.0，在80-100°C水浴温度下提取 1-2h，冷却至 40-55°C ；
[0026]接着在40_55°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量1-2.5%的果胶酶和0.8-1 %的α -淀粉酶，并保温1.5-2.0h后加热至沸腾，再保温10_15min ；
[0027]然后抽滤并将滤液浓缩，向浓缩液中加入3-4倍体积的95%乙醇，静置10_14h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖；
[0028]最后用80%乙醇溶液洗涤粗混合多糖，过滤后将所得沉淀于45_55°C烘干，即得薏苡仁和山药混合多糖提取物。
[0029]所述步骤c)中真空冷冻干燥是在冻干机中进行18-24h。
[0030]所述步骤c)中真空冷冻干燥之前在_40°C预冻6_14h。
[0031]与现有技术相比，本发明的保加利亚乳杆菌冻干菌粉是在含白扁豆多糖等物质的增殖抗冻培养基中进行增殖的，增殖的菌液经离心处理，再加入薏苡仁和山药混合多糖提取物等物质，干燥后得到冻干菌粉，本发明中采用白扁豆多糖等作为抗冻因子，使保加利亚乳杆菌具有更好的抗冻能力，同时使用薏苡仁和山药混合多糖提取物等为冻干保护剂，使菌粉有更高的存活率，根据本发明制备的保加利亚乳杆菌冻干菌粉可使其冻干存活率最高可达75.21%，菌粉活菌数最高达1.96X10nCFU/g ;而以常用的商业MRS肉汤培养基培养、使用磷酸缓冲液为冻干保护剂制备的保加利亚乳杆菌菌粉冻干存活率最高仅为19.72%,活菌数最高仅为7.8X109cfu/g。本发明中白扁豆多糖中所含有的各种糖类对保加利亚乳杆菌的生长具有刺激作用、也是渗透性抗冻因子，另外，其具有抗氧化、增强免疫等作用，对人体有较大的益处；薏苡仁和山药多糖中的许多低聚糖对保加利亚乳杆菌具有良好的冷冻保护和增殖效果，同样有利于人体健康，本发明更好地开发利用了我国“药食同源”中的药物资源，提高了中药使用价值，能够增加保加利亚乳杆菌的使用价值。
【具体实施方式】
[0032]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0033]实施例1
[0034]a)菌种活化与增殖培养:
[0035]将保加利亚乳杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37°C培养22_26h，再按体积比(v/v)为3%的比例接种于与上述相同的培养基中，即每IOOmL培养基中接种3mL菌种，并在相同条件下活化至第三代。
[0036] 向增殖抗冻培养基中接入4% (v/v)已活化的保加利亚乳杆菌，36°C恒温培养16h0
[0037]b)收集菌体:[0038]然后在4°C、8000rpm下离心20min,弃去上清液,获得菌泥。
[0039]c)预冻及真空冷冻干燥:
[0040]向每克菌泥中加入0.24g脱脂奶粉、0.06g抗坏血酸钠、1.0mL磷酸缓冲液、0.1g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀，于_40°C预冻10h，然后放入冻干机于_56°C、5Pa下进行真空冷冻干燥24h，即得保加利亚乳杆菌冻干菌粉。
[0041]其冻干存活率可为72.31 % (对照培养基为19.72 % )，菌粉活菌数达1.34X 10nCFU/g(对照培养基为 7.1 X 109CFU/g)。
[0042]其中，保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基的配置步骤包括:
[0043]首先准确称取乳糖20g、白扁豆多糖0.4g、酵母提取物4g、大豆蛋白胨8g、柠檬酸氢二铵1.5g、乙酸钠1.2g、磷酸氢二钾1.5g、MnSO40.05g和吐温800.8mL溶解于950mL蒸馏水中，加热溶解、搅拌均匀，再调PH值至6.4-6.6，按照装量70 %盛放于厌氧瓶中，并在瓶盖的橡胶塞上向内插ImL注射器针头，于121°C灭菌15min后拔下针头，冷却至室温；
[0044]然后准确称取3g海藻糖、3g低聚木糖和1.0g谷氨酸钠溶解于50mL蒸馏水中，混合均匀，再用0.22 μ m无菌滤膜进行过滤除菌，将滤液与上述已灭菌的培养基在超净工作台中按照无菌操作要求混合均匀，即得保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基。
[0045]白扁豆多糖的制备方法包括以下步骤:将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于150份蒸馏水中，调节PH值 至5.0-6.8，在45°C的水浴温度下加入白扁豆质量1.5%、活力为8000U/g的纤维素酶和白扁豆质量I %、活力为30000U/g的果胶酶，保温2h后于电磁炉上加热至沸腾，其后调节电磁率功率为1000W保温20min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，在冰箱中静置IOh后抽滤，所得滤渣即为粗白扁豆多糖，将所得滤渣于50°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于20mL、水浴加热至55°C的蒸馏水中计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量I %的木瓜蛋白酶，酶解0.9h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15%体积的Sevag试剂除蛋白20min,其中Sevag试剂中氯仿:正丁醇=4:1 ;2000rpm离心15min后取上清液，反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。
[0046]薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备:将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药混合物粉碎后浸泡于150份蒸馏水中，其中薏苡仁和去皮的山药按1:1混合，调节pH值至
6.0-7.0，在80°C水浴温度下提取2h，冷却至40°C后，在40°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量I %的果胶酶和0.8%的α -淀粉酶，并保温2.0h，其后于电磁炉上加热至沸腾，保温lOmin，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇，在冰箱中静置IOh后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗涤粗多糖，过滤后将所得沉淀于45°C烘干，即得薏苡仁和山药混合多糖提取物。
[0047]实施例2
[0048]a)菌种活化与增殖培养:
[0049]将保加利亚乳杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于35°C培养22_26h，再按4% (v/v)比例接种于与上述相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。
[0050]向增殖抗冻培养基中接入3% (v/v)已活化的保加利亚乳杆菌，37°C恒温培养16h0
[0051]b)收集菌体:[0052]然后在4°C、1000Orpm下离心15min,弃去上清液,获得菌泥。
[0053]c)预冻及真空冷冻干燥:
[0054]向每克菌泥中加入0.24g脱脂奶粉、0.06g抗坏血酸钠、0.8mL磷酸缓冲液、0.2g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀，于_40°C预冻10h，然后放入冻干机于_56°C、5Pa下进行真空冷冻干燥20h，即得保加利亚乳杆菌冻干菌粉。
[0055]其冻干存活率可为74.82 % (对照培养基为10.2 % )，菌粉活菌数达1.96X 10nCFU/g(对照培养基为 6.4X109CFU/g)。
[0056]其中，保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基的配置步骤包括:
[0057]首先准确称取乳糖16g、白扁豆多糖0.5g、酵母提取物6g、大豆蛋白胨10g、柠檬酸氢二铵1.8g、乙酸钠1.0g、磷酸氢二钾1.2g、MnSO40.04g和吐温801.0mL溶解于95OmL蒸馏水中，加热溶解、搅拌均匀，再调PH值至6.4-6.6，按照装量80%盛放于厌氧瓶中，并在瓶盖的橡胶塞上向内插ImL注射器针头，于121°C灭菌15min后拔下针头，冷却至室温；
[0058]然后准确称取5g海藻糖、2g低聚木糖和0.6g谷氨酸钠溶解于50mL蒸馏水中，混合均匀，再用0.22 μ m无菌滤膜进行过滤除菌，将滤液与上述已灭菌的培养基在超净工作台中按照无菌操作要求混合均匀，即得保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基。
[0059]白扁豆多糖的制备方法包括以下步骤:将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于125份蒸馏水中，调节pH值至5.0-6.8，在40°C的水浴温度下加入白扁豆质量I %、活力为9000U/g的纤维素酶和白扁豆质量1.5%、活力为20000U/g的果胶酶，保温2.5h后于电磁炉上加热至沸腾，其后调节电磁率功率为1000W保温18min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，在冰箱中静置IOh后抽滤，所得滤渣即为粗白扁豆多糖，将所得滤渣于55°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于15mL、水浴加热至50°C的蒸馏水中计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量3%的木瓜蛋白酶，酶解0.6h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液18%体积的Sevag试剂(氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白25min, 3000rpm离心20min后取上清液,反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。
[0060]薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备:将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药(1:1混合)粉碎后浸泡于200份蒸馏水中，调节pH值至6.0-7.0，在100°C水浴温度下提取lh，冷却至45°C后，在45°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量2%的果胶酶和1%的α -淀粉酶，并保温1.5h，其后于电磁炉上加热至沸腾，保温15min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇，在冰箱中静置12h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗涤粗多糖，过滤后将所得沉淀于50°C烘干，即得薏苡仁和山药混合多糖提取物。
[0061]实施例3
[0062]a)菌种活化与增殖培养:
[0063]将保加利亚乳杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于38°C培养22_26h，再按5% (v/v)比 例接种于与上述相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。
[0064]向增殖抗冻培养基中接入4% (v/v)已活化的保加利亚乳杆菌，35°C恒温培养16h0
[0065]b)收集菌体:[0066]然后在0°C、1000Orpm下离心15min,弃去上清液,获得菌泥。
[0067]c)预冻及真空冷冻干燥:
[0068]向每克菌泥中加入0.2g脱脂奶粉、0.08g抗坏血酸钠、1.2mL磷酸缓冲液、0.3g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀，于_40°C预冻14h，然后放入冻干机于_56°C、5Pa下进行真空冷冻干燥22h，即得保加利亚乳杆菌冻干菌粉。
[0069]其冻干存活率可为75.20 % (对照培养基为15.4 % )，菌粉活菌数达1.80 X 10nCFU/g (对照培养基为 7.8 X 109CFU/g)。
[0070]其中，保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基的配置步骤包括:
[0071]首先准确称取乳糖18g、白扁豆多糖0.6g、酵母提取物5g、大豆蛋白胨10g、柠檬酸氢二铵1.2g、乙酸钠1.0g、磷酸氢二钾1.8g、MnSO40.03g和吐温801.0mL溶解于950mL蒸馏水中，加热溶解、搅拌均匀，再调PH值至6.4-6.6，按照装量90%盛放于厌氧瓶中，并在瓶盖的橡胶塞上向内插ImL注射器针头，于120°C灭菌15min后拔下针头，冷却至室温；[0072]然后准确称取4g海藻糖、4g低聚木糖和0.Sg谷氨酸钠溶解于50mL蒸馏水中，混合均匀，再用0.22 μ m无菌滤膜进行过滤除菌，将滤液与上述已灭菌的培养基在超净工作台中按照无菌操作要求混合均匀，即得保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基。
[0073]白扁豆多糖的制备方法包括以下步骤:将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100份蒸馏水中，调节PH值至5.0-6.8，在55 °C的水浴温度下加入白扁豆质量2 %、活力为10000U/g的纤维素酶和白扁豆质量2%、活力为20000U/g的果胶酶，保温1.5h后于电磁炉上加热至沸腾，其后调节电磁率功率为1000W保温20min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，在冰箱中静置14h后抽滤，所得滤渣即为粗白扁豆多糖，将所得滤渣于50°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于20mL、水浴加热至70°C的蒸馏水中计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量4%的木瓜蛋白酶，酶解Ih后得酶解液，酶解液使用多糖溶液25%体积的Sevag试剂 (氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白30min, 4000rpm离心20min后取上清液,反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。
[0074]薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备:将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药(1:1混合)粉碎后浸泡于200份蒸馏水中，调节pH值至6.0-7.0，在90°C水浴温度下提取1.5h，冷却至50°C后，在50°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量1.5%的果胶酶和1%的α-淀粉酶，并保温2.0h，其后于电磁炉上加热至沸腾，保温15min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入4倍体积的95%乙醇，在冰箱中静置14h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗涤粗多糖，过滤后将所得沉淀于55°C烘干，即得薏苡仁和山药混合多糖提取物。
[0075]实施例4
[0076]a)菌种活化与增殖培养:
[0077]将保加利亚乳杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于36°C培养22_26h，再按3% (v/v)比例接种于与上述相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。
[0078]向增殖抗冻培养基中接入5% (v/v)已活化的保加利亚乳杆菌，38°C恒温培养17h。
[0079]b)收集菌体:[0080]然后在l°C、9000rpm下离心16min,弃去上清液,获得菌泥。
[0081]c)预冻及真空冷冻干燥:
[0082]向每克菌泥中加入0.22g脱脂奶粉、0.1g抗坏血酸钠、1.4mL磷酸缓冲液、0.3g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀，于_40°C预冻8h，然后放入冻干机于-56°C、5Pa下进行真空冷冻干燥21h，即得保加利亚乳杆菌冻干菌粉。
[0083]其冻干存活率可为75.21 % (对照培养基为18.63 % )，菌粉活菌数达
1.85X 10nCFU/g(对照培养基为 7.6X 109CFU/g)。
[0084]其中，保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基的配置步骤包括:
[0085]首先准确称取乳糖13g、白扁豆多糖0.3g、酵母提取物8g、大豆蛋白胨9g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠1.5g、磷酸氢二钾1.0g、MnSO40.06g和吐温800.6mL溶解于95OmL蒸馏水中，加热溶解、搅拌均匀，再调PH值至6.4-6.6，按照装量70 %盛放于厌氧瓶中，并在瓶盖的橡胶塞上向内插ImL注射器针头，于119°C灭菌15min后拔下针头，冷却至室温；
[0086]然后准确称取2g海藻糖、4g低聚木糖和0.7g谷氨酸钠溶解于50mL蒸馏水中，混合均匀，再用0.22 μ m无菌滤膜进行过滤除菌，将滤液与上述已灭菌的培养基在超净工作台中按照无菌操作要求混合均匀，即得保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基。
[0087]白扁豆多糖的制备方法包括以下步骤:将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于120份蒸馏水中，调节pH值至5.0-6.8，在48°C的水浴温度下加入白扁豆质量I %、活力为8000U/g的纤维素酶和白扁豆质量I %、活力为20000U/g的果胶酶，保温1.8h后于电磁炉上加热至沸腾，其后调节电磁率功率为1000W保温17min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，在冰箱中静置13h后抽滤，所得滤渣即为粗白扁豆多糖，将所得滤渣于53°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于16mL、水浴加热至60°C的蒸馏水中计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量2%的木瓜蛋白酶，酶解0.Sh后得酶解液，酶解液使用多糖溶液20%体积的Sevag试剂(氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白23min, 3000rpm离心16min后取上清液,反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。
[0088]薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备:将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药(1:1混合)粉碎后浸泡于170份蒸馏水中，调节pH值至6.0-7.0，在100°C水浴温度下提取1.5h，冷却至45°C后，在45°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量2%的果胶酶和
0.8%的α -淀粉酶，并保温1.9h，其后于电磁炉上加热至沸腾，保温13min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇，在冰箱中静置Ilh后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗涤粗多糖，过滤后将所得沉淀于48°C烘干，即得薏苡仁和山药混合多糖提取物。
[0089]实施例5
[0090]a)菌种活化与增殖培养:
[0091]将保加利亚乳杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37°C培养22_26h，再按3% (v/v)比例接种于与上述相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。
[0092]向增殖抗冻培养基中接入5% (v/v)已活化的保加利亚乳杆菌，38°C恒温培养18h。
[0093]b)收集菌体:[0094]然后在2°C、8000rpm下离心17min,弃去上清液,获得菌泥。
[0095]c)预冻及真空冷冻干燥:
[0096]向每克菌泥中加入0.21g脱脂奶粉、0.07g抗坏血酸钠、1.0mL磷酸缓冲液、0.2g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀，于_40°C预冻6h，然后放入冻干机于-56°C、5Pa下进行真空冷冻干燥18h，即得保加利亚乳杆菌冻干菌粉。
[0097]其冻干存活率可为73.46 % (对照培养基为15.4 % )，菌粉活菌数达
1.65 X 10nCFU/g (对照培养基为 6.9 X 109CFU/g)。
[0098]其中，保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基的配置步骤包括:
[0099]首先准确称取乳糖10g、白扁豆多糖0.2g、酵母提取物10g、大豆蛋白胨9g、柠檬酸氢二铵1.0g、乙酸钠2.0g、磷酸氢二钾2.0g、MnSO40.01g和吐温800.5mL溶解于950mL蒸馏水中，加热溶解、搅拌均匀，再调PH值至6.4-6.6，按照装量80%盛放于厌氧瓶中，并在瓶盖的橡胶塞上向内插ImL注射器针头，于118°C灭菌15min后拔下针头，冷却至室温；
[0100]然后准确称取6g海藻糖、3g低聚木糖和0.9g谷氨酸钠溶解于50mL蒸馏水中，混合均匀，再用0.22 μ m无菌滤膜进行过滤除菌，将滤液与上述已灭菌的培养基在超净工作台中按照无菌操作要求混合均匀，即得保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基。
[0101]白扁豆多糖的制备方法包括以下步骤:将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于140份蒸馏水中，调节PH 值至5.0-6.8，在50°C的水浴温度下加入白扁豆质量0.5%、活力为10000U/g的纤维素酶和白扁豆质量2%、活力为30000U/g的果胶酶，保温2.5h后于电磁炉上加热至沸腾，其后调节电磁率功率为1000W保温15min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，在冰箱中静置12h后抽滤，所得滤渣即为粗白扁豆多糖，将所得滤渣于45°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于18mL、水浴加热至65°C的蒸馏水中计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量2.5%的木瓜蛋白酶，酶解0.5h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液23%体积的Sevag试剂(氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白28min, 2000rpm离心18min后取上清液，反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。
[0102]薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备:将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药(1:1混合)粉碎后浸泡于180份蒸馏水中，调节pH值至6.0-7.0，在90°C水浴温度下提取lh，冷却至55°C后，在55°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量2.5%的果胶酶和
0.9%的α-淀粉酶，并保温1.8h，其后于电磁炉上加热至沸腾，保温12min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入4倍体积的95%乙醇，在冰箱中静置13h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗涤粗多糖，过滤后将所得沉淀于52°C烘干，即得薏苡仁和山药混合多糖提取物。
【权利要求】
1.一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法，其特征在于:包括以下步骤: a)菌种活化与增殖培养:将保加利亚乳杆菌接种到MRS液体培养基中活化，将已活化的菌种接种于增殖抗冻培养基中增殖培养，得到增殖的菌液； b)收集菌体:将上述增殖的菌液离心处理，弃去上清液，得到菌泥； c)干燥:在所制备的菌泥中按每克菌泥添加0.2-0.24g脱脂奶粉、0.06-0.1g抗坏血酸钠、0.8-1.4mL的磷酸缓冲液、0.1-0.3g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀后真空冷冻干燥，即得保加利亚乳杆菌冻干菌粉； 所述増殖抗冻培养基配方组成为:乳糖10-20g、海藻糖2-6g、白扁豆多糖0.2-0.6g、低聚木糖2-4g、酵母提取物4-10g、大豆蛋白胨8-10g、谷氨酸钠0.6-1.0g、柠檬酸氢二铵`1.0-2.0g、乙酸钠 1.0-2.0g、磷酸氢二钾 1.0-2.0g、MnS040.01-0.06g、吐温 800.5-1.0mL、蒸馏水 1000mL。
2.根据权利要求1所述的一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法，其特征在于:所述步骤a)中活化是指将保加利亚乳杆菌接种到MRS液体培养基中于35-38 °C培养22_26h，再按每IOOmL培养基中接种 3-5mL菌种的比例，接种于与上述MRS液体培养基相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。
3.根据权利要求2所述的一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法，其特征在于:所述步骤a)中增殖培养的接种比例为每IOOmL增殖抗冻培养基中接种3_5mL已活化的菌种。
4.根据权利要求3所述的一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法，其特征在于:所述步骤a)中增殖培养是于35-38°C下培养16_18h。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法，其特征在于:所述增殖抗冻培养基的配置步骤包括: 首先按量称取乳糖、白扁豆多糖、酵母提取物、大豆蛋白胨、柠檬酸氢二铵、乙酸钠、磷酸氢二钾、MnSO4和吐温80溶解于蒸馏水a中，加热溶解、搅拌均匀，再调pH值至6.4-6.6，按照装量70%-90%盛放于厌氧瓶中，于118-1211:灭菌151^11，冷却至室温，得到已灭菌的培养基； 再称取海藻糖、低聚木糖和谷氨酸钠溶解于蒸馏水b中，所述蒸馏水a和蒸馏水b的总量为1000mL,混合均匀后过滤除菌，将滤液与上述已灭菌的培养基按照无菌操作要求混合均匀，即得保加利亚乳杆菌增殖抗冻培养基。
6.根据权利要求1所述的一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法，其特征在于:所述白扁豆多糖的制备步骤包括: 首先将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100-150份蒸馏水中，调节pH值至5.0-6.8 ； 其次在40-55°C的水浴温度下加入白扁豆质量0.5-2%、活力为8000-1000(^/^的纤维素酶和白扁豆质量1-2%、活力为20000-3000(^/^的果胶酶，保温1.5-2.5h后加热至沸腾，再保温15-20min ； 然后抽滤并将滤液浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，静置10-14h后抽滤，将所得滤渣于45-55°C烘干，即得白扁豆粗多糖； 最后取干燥的白扁豆粗多糖溶于水浴加热至50-70°C的蒸馏水中，按每0.5g白扁豆粗多糖溶于15_20mL蒸馏水的比例计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量1-4%的木瓜蛋白酶，酶解0.5-lh后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15-25%体积的Sevag试剂除蛋白20_30min ;2000-4000rpm离心15_20min后取上清液，反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。
7.根据权利要求1所述的一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法，其特征在于:所述步骤b)中离心处理为0_4°C、8000-10000rpm离心15_20min。
8.根据权利要求1所述的一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法，其特征在于:所述薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备步骤包括: 首先将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药混合物粉碎后浸泡于150-200份蒸馏水中，其中薏苡仁和去皮的山药按1:1混合，调节PH值至6.0-7.0，在80-100°C水浴温度下提取1-2h，冷却至 40-550C ； 接着在40-55°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量1-2.5%的果胶酶和0.8-1 %的α -淀粉酶，并保温1.5-2.0h后加热至沸腾，再保温10_15min ； 然后抽滤并将滤液浓缩，向浓缩液中加入3-4倍体积的95%乙醇，静置10-14h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖； 最后用80%乙醇溶液洗涤粗混合多糖，过滤后将所得沉淀于45-55°C烘干，即得薏苡仁和山药混合多糖提取物。
9.根据权利要求1所述的一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉制备方法，其特征在于:所述步骤c)中真空冷冻干燥是在冻干机中进行18-24h。
10.根据权利要求1或9所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于:所述步骤c)中真空冷冻干燥 之前在_40°C预冻6-14h。
【文档编号】C12N1/04GK103923835SQ201410171964
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】陈合, 陈世伟, 舒国伟 申请人:陕西科技大学