一种重组伪狂犬病病毒及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组伪狂犬病病毒及其构建方法和应用，所述重组伪狂犬病毒是以重组伪狂犬病病毒PRV/TK-/gE-/EGFP+为母本，将含猪圆环病毒2型的主要免疫原性基因ORF2的表达盒替换插入gE基因中的EGFP基因表达盒获得的一种重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-ORF2。本发明的重组伪狂犬病病毒用于重组伪狂犬病病毒疫苗，具有安全性和有效性。
【专利说明】一种重组伪狂犬病病毒及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于动物病毒基因工程【技术领域】，具体涉及一种重组伪狂犬病病毒及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus, PRV)属于疱疫病毒(Herpesviridae) α抱疫病毒亚科(Alpha-herpesvirinae)水痕病毒属(Varicello virus)的抱疫病毒I型(Porcine herpesvirus Type I),能引发猪的严重疾病。伪狂犬病在猪常呈爆发性流行,对妊娠母猪的危害尤其严重，常引起死胎、流产、木乃伊；后备母猪和空怀母猪感染病毒后可引起不育症，不发情、返情和屡配不孕。公猪感染后表现为睾丸肿胀、萎缩，失去种用能力。新生仔猪感染PRV后大量死亡，15日龄以内死亡率可达100%，3~4周龄仔猪的死亡率可达30%~40%。育肥猪感染伪狂犬病毒后，则表现为发热，呼吸道症状以及生长迟缓，影响增重，降低饲料报酬。除猪以外的其它动物发生该病表现为发热、奇痒及脑脊髓炎症状，均以死亡而告终，但表现为散发或呈地方性流行。同时，猪既是伪狂犬病病毒的贮存者，也是伪狂犬病毒的传染源，控制猪伪狂犬病不仅对养猪业本身，而且对其它动物养殖的顺利发展也有着十分重要的意义。疫苗免疫接种是预防控制与消灭伪狂犬病的根本措施。目前市售的PRV疫苗绝大多数为具有鉴别诊断能力的活疫苗，有匈牙利的天然弱毒Bartha-K/61株疫苗产品，及四川农大郭万柱教授主持研发的猪伪狂犬病活疫苗(SA215株)和华中农业大学陈焕春教授主持研发的猪伪狂犬病活疫苗(HB98株)。该类疫苗已投放市场使用多年，对猪伪狂犬的预防与控制发挥了重要作用。SA215株与HB98株均为基因工程活疫苗毒株，即采用分子生物学方法缺失其母本病毒的主要毒力基因(如TK)与非必须糖蛋白基因(如gE、gl)，使其毒力大大降低，并具有鉴别诊断能力，为猪伪狂犬病的控制做出了巨大贡献。
[0003]自1991年在加拿大北部猪群中出现由猪圆环病毒2型(Porcine circovirusType2，PCV2)感染引起的PMWS以来，全球的绝大多数国家和地区均相继有PCV2感染及导致的疾病的报道。PCV2感染不仅引起PMWS1DNS等PCV2相关疾病，感染猪死亡率高，而且其主要病毒特征为淋巴系统损伤和免疫缺陷，造成感染猪对其它病原的易感性增高，因此，PCV2感染给各国养猪业造成了极大的经济损失和潜在危险，成为了严重危害世界养猪业的重大传染病。
[0004]在我国，通过血清学和流行病学调查证实PCV2感染相当严重，全国各省(市)的大小猪场均存在PCV2感染。2002年由PCV2感染引起的PMWS在全国各地呈暴发流行，给我国养猪业造成了巨大经济损失，己成为我国规模化猪场危害养猪生产的重要免疫抑制性疫病之一。据2011年各科研院所的检测结果发现，我国猪场的PCV2阳性率已达100%，具有流行范围广、各生长阶段猪感染严重、混合感染突出等特点，严重威胁我国养猪业的发展。PCV2对养猪业的另一影响为其感染可导致其它疫苗免疫时的免疫效力显著降低。
[0005] 由于PCV2感染细胞后不表现细胞病变、病毒增殖滴度低，为疫苗的研制造成了极大的困难。直至2007年，全球第一个PCV2疫苗即梅里亚Circovace在欧盟被批准上市，随后先后有英特威Circumvent?、富道Suvaxyn PCV2*及勃林格CircoFLEX?上市，但仅勃林格CircoFLEX?在我国成功获批上市。2010年后，我国先后有5个PCV2全病毒灭活疫苗批准上市。该类疫苗由于生产成本高,价格昂贵,仔猪用疫苗每头份10~14元，按免疫两次计算，每头仔猪的费用至少30元，母猪用疫苗每头份至少30元，一般至少免疫3次，每头猪的费用为90元以上，由此可见，该类疫苗的使用大大提高了养猪的成本。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组伪狂犬病病毒，应用于活疫苗中具有高安全性和有效性。
[0007]本发明的另一目的在于提供一种重组伪狂犬病病毒的构建方法，通过分子生物学手段获得一种重组伪狂犬病病毒。
[0008]本发明的另一方法在于提供重组伪狂犬病病毒在制备猪伪狂犬病与猪圆环病毒2型疫苗中的应用。
[0009]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0010]一种重组伪狂犬病病毒，其是以重组伪狂犬病病毒PRV/TK_/gE7EGFP+为母本，将含猪圆环病毒2型的主要免疫原性基因0RF2的表达盒替换插入gE基因中的EGFP基因表达盒获得的重组伪狂犬病病毒rPRV_0RF2,拉丁文名为Recombinant Herpesvirus SuisrPRV-0RF2 ;该病毒保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学，邮编430072)，保藏号为:CCTCC-V201408，保藏日期为:2014年03月10日。
[0011]上述方案中所采用的重组伪狂犬病病毒母本为本研究室在申请号为CN201210128876.5中所披露的重组伪狂犬病病毒PRV/TK7gE_/EGFP+，拉丁文名为Recombinant pseudorabies PRV/TKVgEVEGFP+,该病毒保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学，邮编430072)，保藏号为:CCTCC-V201410，保藏日期为:2014年03月24日。
[0012]一种重组伪狂犬病病毒的构建方法，其步骤如下:
[0013]l)pgE-0RF2的构建:设计0RF2扩增引物，以PCV2阳性病料中提取的PCV2DNA为模板，经PCR扩增获得0RF2全基因，经KpnI与XhoI消化后，克隆至pUC19_gE/EGFP替换EGFP 获得 pgE-0RF2 ；
[0014]2)转染:在细胞培养板上培养BHK-21细胞，待BHK-21细胞80 %融合时以PRV/TKVgEVEGFP+感染BHK-21细胞后，再以pgE_0RF2转染；转染后，继续培养60h~72h，冻融收获病毒；
[0015]3)纯化与鉴定:将转染后收获的病毒接种于细胞培养板中80%融合细胞后培养至明显病变出现，挑选无荧光噬斑，并纯化至100%无荧光，获得重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-0RF2o
[0016]所述的重组伪狂犬病病毒在制备猪伪狂犬病与猪圆环病毒2型疫苗中的应用。
[0017]一种重组伪狂犬病病毒疫苗包括上述rPRV_0RF2病毒液和保护剂或佐剂。
[0018]本发明所述的伪狂犬病病毒疫苗中，rPRV-0RF2的TCID5tl为105_7/0.1ml0
[0019]本发明所述的伪狂犬病病毒疫苗中，所述保护剂为rPRV_0RF2病毒液和保护剂的体积比为1:1。
[0020]本发明所述的伪狂犬病病毒疫苗中，所述保护剂可以采用药学上可以接受的疫苗保护剂或佐剂，作为优选的，所述保护剂为由去离子水、蔗糖、明胶组成，其中每10ml保护剂中蔗糖30-50g，明胶5-10g。
[0021]相比现有技术，本发明的有益效果在于:
[0022]1、本发明所用的载体材料为重组伪狂犬病病毒PRV/TK_/gE7EGFP+基因工程弱毒株，该病毒的增殖滴度高，且重组伪狂犬病病毒株PRV/TK_和PRV/TK_/gE_不但对断奶仔猪十分安全有效，即使对怀孕母猪及初生仔猪也十分安全，可产生坚强的保护力，这就为将其开发成一种良好的病毒活疫苗载体提供了广阔的前景；
[0023]2、本发明利用DNA重组同源重组技术成功地将PCV2的主要免疫原性基因0RF2替换了 EGFP基因，克服了 PCV2增殖滴度低的缺点，并采用强启动子(人巨细胞病毒CMV启动子)进一步提高了 0RF2的表达效率，使其高水平表达；
[0024]3、本发明深入评价了 rPRV_0RF2制备防制猪伪狂犬病与猪圆环病毒2型相关疾病疫苗上的应用，将该毒株制成猪伪狂犬病-猪圆环病毒2型基因工程活疫苗进行了小鼠安全性与免疫效力试验，表明其是一株安全、有效的疫苗毒株。
[0025]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图lrPRV_0RF2的构建技术路线示意图；
[0027]图2pgE_0RF2转移载体构建示意图；
[0028]图 3、pgE-0RF2 的酶切鉴定，其中 M:DNA Ladder, Lanel ~3:HindIII+ClaI 酶切鉴定 pgE-0RF2 ；
[0029]图4、纯化前rPRV_0RF2感染ST细胞荧光观察，其中A:可见光观察；B:荧光观察；箭头所示为无荧光的rPRV-0RF2感染ST细胞；
[0030]图5、纯化后rPRV_0RF2感染ST细胞荧光观察，其中A:可见光观察；B:荧光观察；
[0031]图6、PCR 鉴定 rPRV-0RF2，其中 M:DNA Ladder, Lanel ~6 分别为噬斑毒 A4、A7、A8、A19、A23、A24 中 0RF2 基因 PCR 扩增；
[0032]图 7、RT-PCR 鉴定 rPRV_0RF2 中 0RF2 的表达，其中 M:DNA Ladder, Lanel ~6 分别为噬斑毒 A4、A7、A8、A19、A23、A24 的 RT-PCR 扩增。
[0033]图8、Western blot 鉴定 rPRV-ORF2 中 ORF2 的表达；
[0034]图9、PCR 鉴定 rPRV-0RF2 中 TK 基因缺失，其中 M:DNA Ladder, Lane I ~6 分别为 rPRV-0RF2 的噬斑毒 A4、A7、A8、A19、A23、A24 的 TK 基因 PCR 扩增；
[0035]图10、PCR 鉴定 rPRV-0RF2 中 gE 基因缺失，其中 M:DNA Ladder, Lanel ~6 分别为噬斑毒A4、A7、A8、A19、A23、A24中gE基因缺失检测；
[0036]图11、rPRV-0RF2免疫Balb/C小鼠后PCV2抗体水平比较；
[0037]图 12、rPRV-0RF2免疫Balb/C小鼠后PRV抗体水平比较。
【具体实施方式】
[0038]除另有说明外，本申请中所有的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而不应理解为对本发明的限制。
[0039]在本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的常规技术。这些技术在下了文件中有详细描述:Sambrook 等人编著的 Molecular Cloning:Alaboratory Mannual,第二版(1989) ；Nucleic Acid Hybridizat1n (B.D.Hames 和 S.J.Higgin 编著，1984)；Immnochemical Methods in Cell And Molecular B1logy(Academic Press, London)。
[0040]本发明所用的材料来源如下:
[0041]病毒和细胞:重组伪狂犬病病毒PRV/TK_/gE7EGFP+为本研究室自主构建(专利申请号:CN201210128876.5中公开，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC-V201410)，BHK-21细胞、ST细胞由肇庆大华农生物药品有限公司农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室保存。
[0042]质粒和菌株:pUC19_gE/EGFP为本研究室自主构建(专利申请号:CN2 01210128876.5) ；DH5 α菌株由肇庆大华农生物药品有限公司农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室保存。
[0043]工具酶和其它试剂:EXTaq Premix 试剂盒、TaKaRa LA Taq? with GC Buffer试剂盒、病毒 DNA 提取试剂盒、KpnI> XhoI> Hindlll、Clal、Agarose GEL DNAPurificat1nKit、DNA Ligat1n Kit 购自 TaKaRa 公司，One-step RT-PCR Kit 购自 Τ0Υ0Β0 公司。Lipofectamine?2000购自Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司。
[0044]引物:参考PCV2全基因组序列(EU921254)，设计合成引物，用于检测PCV2及扩增0RF2全基因。引物序列及预期PCR产物的大小见表1 ;FTK/RTK、FgE/RgE分别为PRV TK与gE基因缺失检测引物，均与已申请专利:CN201210128876.5中公开的相同。
[0045]表1检测PCV2及扩增0RF2全基因的PCR引物
[0046]
【权利要求】
1.一种重组伪狂犬病病毒，其特征在于:其是以重组伪狂犬病病毒PRV/TK7gE-/EGFP+为母本，将含猪圆环病毒2型的主要免疫原性基因0RF2的表达盒替换插入gE基因中的EGFP基因表达盒获得的重组伪狂犬病病毒，即rPRV-0RF2 ;该病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC-V201408。
2.一种如权利要求1所述的重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于:其步骤如下: 1)pgE-0RF2的构建:设计0RF2扩增引物，以PCV2阳性病料中提取的PCV2DNA为模板，经PCR扩增获得0RF2全基因，经KpnI与XhoI消化后，克隆至pUC19_gE/EGFP替换EGFP获得 pgE-0RF2 ； 2)转染:在细胞培养板上培养BHK-21细胞，待BHK-21细胞80%融合时以PRV/TK7gE-/EGFP+感染BHK-21细胞后，再以pgE_0RF2转染；转染后，继续培养60h~72h，冻融收获病毒； 3)纯化与鉴定:将转染后收获的病毒接种于细胞培养板中80%融合细胞后培养至明显病变出现，挑选无荧光噬斑，并纯化至100%无荧光，获得一种重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-0RF2o
3.如权利要求1所述的重组伪狂犬病病毒在制备猪伪狂犬病与猪圆环病毒2型疫苗中的应用。
4.一种重组伪狂犬病病毒疫苗，其特征在于:其包括如权利要求1所述rPRV-0RF2病毒液和保护剂/佐剂。
5.根据权利要求4所述的重组伪狂犬病病毒疫苗，其特征在于:所述的rPRV-0RF2的TCID50 为 105-7/0.Imlo
6.根据权利要求4所述的重组伪狂犬病病毒疫苗，其特征在于:所述保护剂为rPRV-0RF2病毒液和保护剂的体积比为1:1。
7.根据权利要求4所述的重组伪狂犬病病毒疫苗，其特征在于:所述保护剂为由去离子水、蔗糖、明胶组成，其中每10ml保护剂中蔗糖30-50g，明胶5_10g。
【文档编号】C12N7/01GK104130982SQ201410183100
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】黄红亮, 陈瑞爱, 谢小雨, 任常宝, 何玲 申请人:肇庆大华农生物药品有限公司, 广东大华农动物保健品股份有限公司