一种氧化葡萄糖酸杆菌梯度强度启动子的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌梯度强度启动子，属于基因和代谢工程领域。本发明挑选Gluconobacter?oxydans中组成型表达基因与上一基因间的序列，运用启动子预测软件进行初步筛选，然后将获得的高评分的潜在强启动子用加强绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因，分别通过荧光显微镜和荧光酶标仪的定性和定量检测，最终从G.oxydans?WSH-003中挑选出强度顺序为：Ptuf-WSH003>Ptuf-621H>Psldh≈Ppsldh≈Psod>Paldh的启动子。本发明筛选出系列梯度启动子和一种新的强启动子，为工业生产菌株G.oxydans?WSH-003的基因和代谢工程改造，特别是在基因转录水平的调节，提供很大的帮助。
【专利说明】一种氧化葡萄糖酸杆菌梯度强度启动子
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌梯度强度启动子，属于基因和代谢工程领域。【背景技术】
[0002]氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans) WSH-003能以D-山梨醇(D-sorbitol)为底物的L-山梨糖(L-sorbose)高产菌株，且高度耐受D-山梨醇和L-山梨糖，被广泛用于工业维生素C的生产。随着Ketogulonicigenium vulgare WSH-001(以山梨糖为底物的高产2-KLG生产菌株)和G.0xydans WSH-003的基因组测序的相继公布，基因工程和生物信息学等的综合运用使维生素C 一步菌的构建得到极大的促进。其中，通过构建一步基因工程菌，可在摇瓶发酵中实现从D-山梨醇到2-KLG的直接生产，但产量有待提高。除了从发酵条件优化方面提高一步菌的生产性能之外，还包括从G oxydans WSH-003中筛选比文献报道常用的强启动子(G oxydans 621H中的Ptuf)更强的启动子和系列梯度启动子用于代谢工程改造。
[0003]本发明根据G oxydans WSH-003的基因组测序结果，结合其基因组测序注释和高同源性菌株G oxy dans 621H等的基因组学、蛋白质组学和代谢组学分析，查找可能的强组成型基因启动子并用生物信息学进行软件初步检测，然后再运用报告基因在G oxydansWSH-003中进行鉴定，继而最终获得强启动子和系列梯度启动子。
[0004]目前国内在氧化葡萄糖酸杆菌启动子的转录调控水平的研究较少，而大多集中于菌体改良和诱变、重要脱氢酶学性质的研究上。因此，本发明从mRNA水平研究菌体的基因表达调控，筛选调控元件，进而为氧化葡萄糖酸杆菌的代谢调控提供强力支持。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的第一个技术问题是提供一组来源于氧化葡萄糖酸杆菌的强启动
了:Ptuf-WSH003、Psldh、Ppsldh、Psod、^aldh0
[0006]所述启动子Ptuf-WSHQQ3、Psldh、Ppsldh、PS()d、Paldh 的核苷酸序列分别如 SEQ ID N0.USEQID N0.3, SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.6 所示。
[0007]所述强启动子Ptuf-ws_，是比以往文献报导的最强的Gluconobacteroxydans 621H 中的 Ptuf-62iH 还强的强启动子(Merfort, M.，et al., High-yield5-keto-D-gluconic acid formation is mediated by soluble and membrane-boundgluconate-5-dehydrogenases of Gluconobacter oxydans, in Appl MicrobiolBiotechnol2006.p.443-51)。通过启动子截短方法，确定了其核心序列，是SEQ ID N0.1所示序列的450_599bp。
[0008]本发明要解决的第二个技术问题是提供一种来源于氧化葡萄糖酸杆菌的强度梯度强启动子，由 Ptuf-WSH003、Ptuf-621H、PsldhΛ PpsldhΛ Psod、Paldh 中两种或两种以上强度不同的启动子构成。所述启动子Ptuf?Q3、Ptuf-621H、Psldh、Ppsldh、Psml、Paldh 的核苷酸序列分别如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2, SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.4, SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.6 所示。[0009]所述6 种启动子构成了强度梯度是 Ptuf-ws_>Ptuf-621H>Psldh ^ Ppsldh ^ Psod>Paidh 的强度梯度启动子。
[0010]所述强度梯度启动子可用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因或代谢工程改造。
[0011]本发明要解决的第三个技术问题是提供一种在G oxydans中筛选梯度启动子和强启动子的方法。
[0012]所述方法包括以下步骤:
[0013](I)根据G.0xydans基因组序列,挑选G.0xydans中央代谢途径酶基因与上一个基因的ORF之间的所有核苷酸片段；
[0014](2)采用启动子在线评测软件，对可能的启动子序列进行评分；
[0015](3)将获得的高评分值的潜在强启动子，通过融合PCR与EGFP进行连接，然后连接到广宿主型载体PBBR1MCS2，构建成重组载pBBRlMCS2-promoter-egfp ；
[0016](4)将重组载体通过三亲本杂交的方法导入G.0xydans细胞，利用荧光显微镜和荧光酶标仪进行定性和定量检测，获得不同强度的启动子。 [0017]本发明筛选出一系列梯度启动子，通过不同强度的启动子之间的组合，可以调控不同酶的表达强度。为氧化葡萄糖酸感觉的基因和代谢工程改造，特别是在基因转录水平的调节，提供了新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为G oxydans WSH-003中的强启动子的筛选过程。
[0019]图2为4个不同梯度类型强弱的启动子的荧光检测菌株在各自荧光最大值时的荧光镜检图。
[0020]图3为图2中4个不同梯度类型的启动子荧光检测菌株的荧光酶标仪的定量检测。
[0021]图4为利用启动子序列截短方法构建的各检测菌株的荧光强度。
【具体实施方式】
[0022]实施例1启动子的挑选
[0023]G oxydans中含有与葡萄糖、甘油、山梨醇等代谢有关的多种重要脱氢酶，这些酶可能具有潜在的强组成型表达启动子，如山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase)、膜结合的醒脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)、膜结合的葡萄糖脱氢酶(membrane-boundglucose dehydrogenase)等的启动子。此外，选取文献报导的最强的Gluconobacteroxydans 62IH中的Ptuf_621H作为对照。根据G.0xydans WSH-003基因组序列信息(GenBankaccession N0.ΑΗΚΙ00000000)，选取目的基因与上一个基因的ORF (开放阅读框)之间的所有核苷酸片段，然后根据启动子软件(http://www.softberry.com)评测出的启动子区域的得分，挑选分值较高的启动子，运用EGFP作为报告基因进行鉴定。
[0024]实施例2表达载体pBBRlMCS2-promter_egfp的构建
[0025]根据G.0xydans WSH-003 基因组序列信息(GenBank accessionN0.ΑΗΚΙ00000000)，设计融合PCR引物，分别扩增获得高评分的启动子核苷酸序列和加强绿色荧光蛋白egfp的基因序列(egfp基因序列包括终止子，序列见SEQ ID N0.7)，然后通过融合PCR进行连接,得到两端带有酶切位点的promoter-egfp,进行T-A克隆并测序,将测序正确的阳性克隆连接带有相同酶切位点的广宿主型载体PBBR1MCS2，构建成表达载体pBBRlMCS2-promter-egfp (图1)。
[0026]实施例3荧光蛋白重组检测菌株的构建
[0027]用三亲本杂交的方法将测序验证正确的各克隆表达载体pBBRlMCS2-promoter-egfp导入G.0xydans WSH-003 (保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，编号为CICM-CU B7004)中。含有重组表达载体的E.coli JM109作为供体菌，含有接合辅助质粒PRK2013的E.coli HBlOl作为辅助菌。G.0xydans WSH-003生长到 OD600 = 0.9，E.coli 生长到 OD600 = 0.8。取 E.coli JM109 和 E.coli HBlOl 各 Iml 混合，离心，用2ml LB重悬菌体与4ml G.0xydans WSH-003混合、离心,用0.8ml Y-S培养基(酵母浸膏20g/L，山梨醇80g/L)重悬菌体，将菌液涂布在含有滤纸但不含抗生素的Y-S固体培养基平板上，30°C培养24h。将滤纸上长出的菌用无菌水洗脱后涂布在含氨苄西林和头孢西汀霉素的平板上 ，30°C培养2-4天，挑取抗性菌株进行PCR验证。
[0028]实施例4重组菌株的荧光检测
[0029]将验证正确的各阳性菌株G.0xydans WSH-003 pBBRlMCS2-promoter_egfp 接种于Y-S培养基，取各荧光检测菌株1.25ml种子液于含有25ml山梨醇培养基的250ml摇瓶(kana, 20ug/ml 头孢 50ug/ml) 30°C培养。在 4h、16h、24h、32h 分别取 2ml 菌液，运用 PBS 洗涤3次，去除培养基杂质和死细胞。用NUNC96孔黑色酶标板进行荧光检测，运用96孔白色细胞培养板进行0D_检测(荧光和0D_检测均做4个复孔，每孔加入200ul检测液)，所用仪器为BioTek Synergy4多功能酶标仪，操作软件为Gen5。荧光强度参数设置为，激发:488/9nm发射:509/9nm，顶端发光，氚气灯，增益为自动调整增益。0D_参数设置为，吸收光波长600nm，并选择调整光程。最后，运用荧光显微镜进行荧光镜检(图2)。
[0030]根据荧光酶标仪检测的荧光值(图3)，并结合荧光镜检图进而筛选G.0xydansWSH-003中的强启动子和系列强度不同的梯度启动子。
[0031]最终获得转录延伸因子Tu (elongation factor Tu)的启动子Ptuf,山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase)的启动子 Psldh,山梨醇脱氢酶前体(sorbitol dehydrogenaseprecursor)的启动子Ppsldh,膜结合的醒脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)的启动子Paidh,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)的启动子PS()d，和文献中常用的强启动子Gluconobacter oxydans 621H 中的 Ptuf_621H。上述启动子的强度顺序为:Ptuf_WSH(l(l3>Ptuf_621H>P
sldh ^ Ppsldh ^ Psod〉Paldh。
[0032]实施例5强启动子Ptuf_WSI_3的核心序列鉴定
[0033]Ptuf-wsHoos的启动子所在核苷酸序列总长度为599bp,利用启动子分段截短策略,分别PCR得到起始密码子上游100bp、150bp、200bp、250bp、300bp和400bp的核苷酸片段，并用全长599bp的核苷酸片段作为阳性对照。将以上各片段连接egfp基因，并构建表达载体pBBRlMCS2-pr0mter-egfp和荧光蛋白重组检测菌株，构建方法分别与实施例2和实施例3相同。然后，运用实施例4的方法检测重组菌的荧光强度，检测时间都统一在对数生长后期(第16小时)，并以G.0xydans WSH-003为阴性对照菌株。鉴定结果显示(参见图4)，Ptuf_ffSH003启动子在其起始密码子上游150bp处就具有启动egfp基因转录的活性，而这与先前的启动子预测软件(softberry软件为常用的启动子预测软件，其对细菌的启动子预测的准确度和特异性可以达到80% )所得结果非常接近(-35区存在于起始密码子上游147bp处，序列为CTGAAG，-10区存在于上游127bp处，序列为AGTCACTAT)。因此，结合启动子截短的结果和软件预测结果，该启动子的核心区域在其起始密码子150bp处(Seql中450-599bp)。
[0034]虽然本发明已以较佳实施例公开如 上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种来源于氧化葡萄糖酸杆菌的强启动子，其特征在于，是核苷酸序列如SEQ IDN0.1 的 Ptuf_ws_、SEQ ID N0.3所示的Psldh、SEQ ID N0.4 所示的 Ppsldh、SEQ ID N0.5 所示的Psod 或 SEQ ID N0.6 所示的 Paldh。
2.一种来源于氧化葡萄糖酸杆菌的梯度强度启动子，其特征在于，由Ρω?ο3、Ρω-621Η、Psldh、Ppsldh、^sodΛ Paldh
中两种或两种以上强度不同的启动子构成；所述启动子 Ptuf—WSH003、Ρω-621Η、Ρ—、Ρρ—、Ρ^、Ρ—的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6 所示。
3.根据权利要求2所述的梯度强度启动子，其特征在于，由所述6种启动子构成，启动 子强度梯度是 Ptuf-WSH003〉Ptuf-621H〉Psldh ^ Ppsldh ^ P sod〉Paldh。
4.一种筛选梯度启动子和强启动子的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)根据氧化葡萄糖酸杆菌的基因组序列，挑选中央代谢途径酶基因与上一个基因的ORF之间的所有核苷酸片段； (2)采用启动子在线评测软件，筛选潜在的启动子序列； (3)将获得的潜在的启动子序列，通过融合PCR与EGFP进行连接，然后连接到广宿主型载体 pBBRlMCS2，构建成重组载 pBBRlMCS2-promoter-egfp ； (4)将重组载体通过三亲本杂交的方法导入G.0xydans细胞，利用荧光显微镜和荧光酶标仪进行定性和定量检测，获得不同强度的启动子。
5.权利要求1-3任一所述的强启动子在氧化葡萄糖酸杆菌基因或代谢工程改造中的应用。
6.携带权利要求1所述启动子的载体或基因工程菌。
【文档编号】C12R1/01GK103966217SQ201410184839
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月4日 优先权日:2014年5月4日
【发明者】陈坚, 周景文, 胡于东, 堵国成 申请人:江南大学