一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用。本发明所提供的表达载体为同时表达草甘膦抗性基因1和草甘膦抗性基因2的环形载体；所述草甘膦抗性基因1编码的蛋白质为序列1所示的蛋白质或其氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有草甘膦抗性的蛋白质；所述草甘膦抗性基因2编码的蛋白质为序列2所示的蛋白质或其氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质。实验证明，转入了所述表达载体的转基因棉花具有非常强的草甘膦抗性。本发明对于进一步培育高抗草甘膦植物及其应用具有非常重要的意义。
【专利说明】—种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用。【背景技术】
[0002]转基因作物是指通过特定方法将来自于动物、植物、微生物等来源的目的基因转移到天然作物中，从而使作物定向获得某种特性并使之能稳定遗传，例如抗除草剂、抗虫、抗逆、抗病等。该技术能克服物种遗传壁垒，改变传统耕作方式，大幅度提升作物产量及品质。第一种转基因作物于1983年首次研发成功，至今已有35科120多种植物成功应用转基因技术，产生了巨大社会经济效益并在提高耕地利用效率、减少农药施用及环境污染、提高人工效率方面产生了巨大推动作用。
[0003]对于转基因作物的研究早在20世纪80年代初期就已经开始，至今已经有多种转基因作物的研究报道，涵盖了大部分粮食作物及经济作物，如水稻、玉米、棉花、烟草、番茄、辣椒、大豆、杨树等，目的基因大部分为抗虫，抗除草剂，抗病，抗逆等抗性基因。
[0004]草甘膦是一种具有广谱灭生性、内吸传导型除草剂。广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理，是全世界除草剂使用量最大的品种之一。草甘膦具有独特的除草机理，草甘膦是植物莽草酸合成途径关键酶EPSPS的抑制剂，从而打断植物的莽草酸合成途径，植物中的莽草酸含量增加，植物体所必需的芳香族氨基酸合成减弱或停止，随之植物失绿而死亡。草甘膦是一种灭生性除草剂，直接在田间喷施，会对作物产生危害。随着抗草甘膦EPSPS基因的发现和抗草甘膦作物的培育，使草甘膦在田间大量使用成为可能。
[0005]草甘膦化学名称N-磷酸甲基甘氨酸(N-(phosphonomethyl)-glyeine),结构式Ho2CCH2NHCH2Po3H2分子量为169.1，常态为白色固体，熔点200°C，230°C融化分解，密度
0.5g/cm3不可燃，常温能稳定储藏。草甘膦可与碱(有机或无机)生成极易溶于水的盐，而且又不损失其母体化合物的除草活性，草甘膦异丙胺盐是最常用的易容盐，溶解度达500g/L，且不降低草甘膦的毒性。
[0006]目前应用最广泛的抗草甘膦转基因棉花是美国孟山都公司，抗农达(草甘膦)棉花(Roundup ReadyCotton),于1994年通过环境释放许可，1997年开始在主要产棉区推广种植。已商业化的抗农达棉花含有CP4-EPSPS基因。该基因是从Agrobacterium spp中分离出来的对草甘膦 不敏感。草甘膦对CP4-EPSPS作用和结合位点与草甘膦对大多数植物中发现的敏感型EPSPS的作用和结合位点是一致的。总体来看，虽然CP4-EPSPS蛋白有50.1%与传统玉米的EPSPS相似，但只有23.3%是完全一致的。因此，通过在草甘膦与PEP (磷酸稀醇式丙酮酸)结合区以外的氨基酸序列变化所引起的构象变化，可以有效降低对草甘膦的亲和性CP4-EPSPS基因插入后，避开了植物体内原有的EPSPS系统，从而使莽草酸代谢得以正常进行，产生了对草甘膦的抗性。目前商业化的抗草甘膦作物大都采用了 CP4-EPSPS基因。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用。
[0008]本发明所提供的表达载体，为同时表达草甘膦抗性基因I和草甘膦抗性基因2的环形载体；
[0009]所述草甘膦抗性基因I (GR79基因)编码的蛋白质(GR79蛋白)可为下述al)或a2):
[0010]al)氨基酸序列为序列表中序列I所示的蛋白质；
[0011]a2)将al)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质；
[0012]所述草甘膦抗性基因2(GAT基因)编码的蛋白质(GAT蛋白)可为下述bl)或b2):
[0013]bl)氨基酸序列为序列表中序列2所示的蛋白质；
[0014]b2)将bl)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质。
[0015]为了便于蛋白的纯化，可在由序列表中序列I或序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
[0016]表:标签的序列
[0017]
【权利要求】
1.表达载体，其特征在于:所述表达载体为同时表达草甘膦抗性基因I和草甘膦抗性基因2的环形载体； 所述草甘膦抗性基因I编码的蛋白质为下述al)或a2): al)氨基酸序列为序列表中序列I所示的蛋白质； a2)将al)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质； 所述草甘膦抗性基因2编码的蛋白质为下述bl)或b2): bl)氨基酸序列为序列表中序列2所示的蛋白质； b2)将bl)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于:所述草甘膦抗性基因I为如下I)至3)中任一所述的DNA分子: 1)编码序列为序列表中序列3所示的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中al)所述蛋白质的DNA分子; 3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1中al)所述蛋白质的DNA分子；和/或 所述草甘膦抗性基因2为如下4)至6)中任一所述的DNA分子: 4)编码序列为序列表中序列4所示的DNA分子； 5)在严格条件下与4)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中bl)所述蛋白质的DNA分子; 6)与4)或5)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1中bl)所述蛋白质的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于:所述表达载体中，所述草甘膦抗性基因I存在于表达盒I中；所述草甘膦抗性基因2存在于表达盒2中； 所述表达盒I中启动所述草甘膦抗性基因I转录的启动子，以及所述表达盒2中启动所述草甘膦抗性基因2转录的启动子均为35S启动子； 所述35S启动子的序列具体为序列表中序列5的第1-710位。
4.根据权利要求1-3中任一所述的表达载体，其特征在于:所述表达盒I中终止所述草甘膦抗性基因I转录的终止子，以及所述表达盒2中终止所述草甘膦抗性基因2转录的终止子均为NosT终止子； 所述NosT终止子的序列具体为序列表中序列5的第2370-2846位。
5.根据权利要求1-4中任一所述的表达载体，其特征在于:所述表达盒I和所述表达盒2中，在所述35S启动子的下游均还包括Ω序列；和/或 所述表达盒I中，在所述Ω序列和所述草甘膦抗性基因I之间还包括叶绿体前导肽序列； 所述Ω序列具体为序列表中序列5的第717-787位；所述叶绿体前导肽序列具体为序列表中序列5的第792-1018位。
6.根据权利要求1-5中任一所述的表达载体，其特征在于:所述表达盒I的序列为序列表中序列5的第1-2846位；和/或 所述表达盒2的序列为序列表中序列5的第2863-4586位。
7.根据权利要求1-6中任一所述的表达载体，其特征在于:所述表达载体的序列为序列表中序列5。
8.含有权利要求1-7中任一所述表达载体的重组细胞系或转基因微生物。
9.如下(A)中的应用或(B)中的方法: (A)权利要求1-7中任一所述的表达载体在培育耐草甘膦转基因植物中的应用； (B)培育耐草甘膦转基因植物的方法，包括如下BI)和B2)的步骤: BI)向目的植物中导入权利要求1-7中任一所述表达载体，得到同时表达权利要求1-7任一中所述的草甘膦抗性基因I和所述的草甘膦抗性基因2的转基因植物； B2)从步骤BI)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，草甘膦抗性增强的转基因植物。
10.DNA分子I和/或DNA分子2: 所述DNA分子I为如下I)至3)中任一所述的DNA分子: 1)编码序列为序列表中序列3所示的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中al)所述蛋白质的DNA分子; 3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1中al)所述蛋白质的DNA分子； 所述DNA分子2为如下4)至6)中任一所述的DNA分子: 4)编码序列为序列表中序列4所示的DNA分子； 5)在严格条件下与4)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中bl)所述蛋白质的DNA分子; 6)与4)或5)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1中bl)所述蛋白质的DNA分子。
【文档编号】C12N15/84GK103981199SQ201410204703
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月15日 优先权日:2014年5月15日
【发明者】郭三堆, 孙豹, 张锐, 孟志刚, 孙国清, 林敏 , 陆伟 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 郭三堆