一种发酵培养基及利用其生产黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的方法
【专利摘要】本发明公开了一种发酵培养基及利用其生产黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的方法。每1L高产发酵培养基含：酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3.05mL，NH4Cl1g，0.17mol/L?KH2PO4和0.72mol/L?K2HPO4混合溶液100mL，MgSO40.185g，微量元素1mL，利用工程菌E.coli?XL10-Gold/CAVA工作种子和该发酵培养基可获得容积产率高的质粒，实现黑色素瘤治疗性DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵生产。
【专利说明】一种发酵培养基及利用其生产黑色素瘤治疗性质粒DNA疫
苗pSVK-CAVA的方法
[0001]本申请为申请日2013年4月16日，申请号为201310131566.3，发明名称为“黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制备方法及其专用工程菌及发酵培养基”专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明属于生物【技术领域】中质粒DNA疫苗的制备方法及其专用工程菌及高产发酵培养基，特别是涉及一种黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制备方法及其专用工程菌及高产发酵培养基。
【背景技术】[0003]质粒DNA疫苗是近年来经研究发现的一种极具发展潜力的新疫苗，从上世纪九十年代初期质粒DNA疫苗受到了科学家的关注，到现在发展近三十年，已经有了长足的发展。质粒DNA疫苗具有高安全性、无载体免疫原性和易于生产等特点，因此，同活病毒和病毒基础的疫苗相比，其具有独特的优势。数百项疫苗进入临床试验阶段，目前已有4种动物用质粒 DNA 疫苗及产品上市(Michele AK, David BW.DNA vaccines:ready for prime time ?Nature Reviews Genetics, 2008，9:776-788.)，人用质粒DNA疫苗及产品呼之欲出。因此，随着质粒DNA疫苗及产品的快速发展，建立符合药用标准的质粒DNA的大规模生产平台成为一个重大的研究课题。本发明针对质粒DNA疫苗的发酵工艺进行探索，是质粒DNA疫苗大规模生产发展中的基石，其重要性不言而喻。
[0004]在质粒DNA疫苗大规模生产中，建立稳定的质粒DNA(或简称质粒)的种子库非常关键，由于质粒DNA(pSVK-CAVA)的分子量比较大，达到15kb左右，对于宿主菌是一种沉重的负担，在宿主菌的生长过程中，极易造成质粒DNA的不稳定性。质粒DNA的不稳定性，是指工程菌在生长过程中质粒DNA发生变化，结果不呈现原有的表型特征。质粒DNA的不稳定可分为两类:分离不稳定性和结构不稳定性(Filomena AQ, Fernanda OIPlasmid DNAfermentation stratagies:1nfluence on plasmid stability and cell physiology.Applied Microbial Biotechnology, 2012，93:2571-2580.)。分离不稳定是指在细胞分裂中由于缺陷分配引起部分或全部质粒DNA的丢失；结构不稳定则是由于质粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，质粒DNA的分配不稳定性和结构不稳定性的结果都将使我们得不到预期的质粒DNA产量和质量。如果发生质粒DNA的分离不稳定，由于部分质粒DNA的丢失，工程菌的发酵过程实际上是工程菌和不含有质粒DNA的宿主菌的混合培养(ClarenceMO，Raelene P，Diane Wj et al.Cultivation of E.coli carrying a plasmid-basedMeasles vaccine construct (4.2kbp pcDNA3F)employing medium optimisation andpH-temperature induction techniques.Microbial Cell Factories,2011， 10:16.do1: 10.1186/1475-2859-10-16.)，在非选择性条件下，含有质粒DNA的工程菌的比生长速率(μ+)往往小于宿主细胞的比生长速率(μ _)，经过25代后，培养液中几乎都是无质粒DNA的细胞。由此可见，设计和筛选一种合适的工程菌来提高质粒DNA的生产率是非常重要的。
[0005]培养基对质粒的稳定性和质粒质量也起着非常重要的作用，Silva(Silva, Filomena, Passarinha L, et al.1nfluence of growth conditions onplasmid DNA production.Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,19(
11):1408-1414.)研究表明质粒在以葡萄糖作为碳源时的丢失频率大于以淀粉为碳源的培养基。FDA认为开环和线性化质粒DNA的治疗效果不如超螺旋质粒DNA(Food andDrug Administration(FDA), Guidance for industry: considerations for plasmiddeoxyribonucleic acid vaccines for infectious disease indications, 2007, http://www.fda.gov/cber/gdlns/plasdnavac.htm.),然而质粒DNA的几种形态在纯化的过程中很难分开，所以在发酵过程中应该在如何得到高比例的超螺旋质粒DNA方面进行优化(Ying C，Rodriguez S，Hebel H.DNA vaccine manufacture: scale and quality.ExpertReviews Vaccines, 2009, 8 (9): 1277-1291.)。由此可见，设计和筛选一种合适的工程菌发酵培养基来提高质粒DNA的生产率是至关重要的。
【发明内容】
[0006]一个方面，本发明提供一个稳定性高、能多次传代的用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌。
[0007]本发明所提供的用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，是转化有黑色素瘤治疗性质粒DNA pSVK-CAVA (或称PSCK_2PFcGB)的大肠杆菌XLIO-Gold，命名为 E.coli XLIO-Gold/CAVA ο
[0008]将黑色素瘤治疗性pSVK-CAVA质粒DNA转化大肠杆菌XLlO-Gold得到转化菌XLlO-Gold,转化方法包括但不限于Hananhan法、Inoue法、氯化钙法和电击转化法。将转化菌XLlO-Gold涂布于LB固体平板培养基，在37°C、200rpm下培养15小时后挑取单克隆菌落；将单克隆菌落接种于5mL LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后按照1:100进行连续传代培养，12小时转接传代I次，可连续传代30代；单克隆菌株以及传代30代以内历次传代菌株均为转化大肠杆菌XLlO-Gold的工程菌。
[0009]用氯化钙法转化大肠杆菌XLlO-Gold的工程菌，转化方法为:将-70 V保存的100 μ I感受态细胞XLlO-Gold于冰浴中解冻10分钟，然后加入pSVK-CAVA质粒DNA25-50ng,轻柔混匀后，置冰浴中30分钟；冰浴结束后，于42°C水浴中热击90秒，后迅速置于冰浴中冷却3-5分钟，加入800 μ I无抗性的LB液体培养基，混匀后于37°C，200rpm振荡培养I小时，得到pSVK-CAVA质粒DNA的转化菌XLIO-Gold。
[0010]另一方面，本发明提供一种用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的高产发酵培养基。
[0011]该制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵培养基ITB，每IL培养基含:酪蛋白胨 10_14g，酵母提取物 16-20g，甘油 2.4-4mL, NH4Cl0.75_lg，0.17mol/L KH2PO4和 0.72mol/L K2HPO4 混合溶液 75-100mL，MgSO40.168-0.216g，微量元素 0.75-lmL。
[0012]较佳的，每IL培养基含:酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3.05mL，NH4Cllg，0.17mol/L KH2PO4 和 0.72mol/L K2HPO4 混合溶液 IOOmL, MgSO40.185g，微量元素 ImL0[0013]所述发酵培养基ITB中，微量元素包括=FeCl3.6H2027g/L、ZnCl22g/L、CoCl2.6H202g/L、Na2MoO4.2H202g/L、CaCl2.2H201g/L,或无水 CaCl20.76g/L、CuCl2.2H201.27g/L、H3BO30.5g/L，溶于 1.2mol/L HCl。
[0014]所述发酵培养基ITB中，K2HPO4和KH2PO4混合溶液的配制方法为:用90mL去离子水溶解2.31g KH2PO4和12.54g K2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至lOOmL。
[0015]再一方面，本发明提供一种行之有效的用上述工程菌和发酵培养基来进行黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA生产的方法。
[0016]本发明提供的黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生产方法，是复苏一支所述工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA工作种子，按体积比1:100比例接种于5mL LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时，按照1:100再转接于IOOmL的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养12小时左右，得到种子液；
[0017]将种子液按体积比1:100的量接种于含3L所述发酵培养基ITB的5L发酵罐内，pH值控制在7.0±0.1，培养温度为37°C，溶解氧控制在30%左右，发酵培养6h ;之后按照lmL/min的流速补加发酵培养基ITB，总共补加500mL，发酵15小时后，结束发酵，收菌，提取质粒，得到黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA。
[0018]又一方面，本发明提供生产黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA 种子库的构建方法及种子库产品。
[0019]该种子库的构建包括:
[0020]I)制备原始种子库:将所述工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA菌液0.5mL扩大至IOOmL LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时，加入30%甘油，分装50管并冻存于-70°C冰箱，得到原始种子库；
[0021]2)制备主种子库:复苏一支原始种子接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至IOOmL LB培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后加入30%甘油，并分装50管得到主种子库，冻存于-70°C冰箱，得到主种子库；
[0022]3)制备工作种子库:从主种子库中取I管菌种，接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至IOOmL LB培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后加入30%甘油，分装50管并冻存于-70°C冰箱，得到工作种子库；每支工作种子库中的菌种限传5代用于权利要求9黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生产。
[0023]以上构建得到的包括原始种子、主种子以及工作种子在内的种子库及各种子均为本
【发明内容】
。
[0024]质粒DNA的稳定性和工程菌发酵培养基是影响质粒产量的重要因素，本发明为了能提供一个稳定性高、能多次传代的用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌以满足中试工艺的需求，首先通过实验对宿主菌进行了优化筛选，最终发现大肠杆菌XLlO-Gold是一个更利于该质粒DNA扩增的宿主菌，将携带质粒pSVK-CAVA的工程菌命名为E.coli XLIO-Gold/CAVA，质粒pSVK-CAVA以大肠杆菌XLlO-Gold为宿主菌时，表现出了同常规质粒DNA类似的稳定性，能转接传代30次也未发生重组或片段丢失，这可能与大肠杆菌XLlO-Gold的特性有关系，因为该菌具有一个大分子量质粒高效转化基因；除了保持质粒DNA在宿主菌中的稳定传代以外，质粒DNA生产工艺中极为重要的一个方面是质粒DNA的高产量问题，想要得到较高的产品量，必须使携带质粒的工程菌具有较高的菌体量，一般要经过优化培养基的成分和特殊的发酵(补料分批发酵)策略来实现，而理想的发酵培养基是获得高产量的首要条件，因此，分别用单次单因子法和响应面法对其最适培养基进行了筛选和优化，单次单因子法优化结果显示，TB培养基是其最适基础培养基，质粒的容积产率为9.9mg/L,明显高于LB和M9培养基；最适碳源和氮源分别是甘油和酪蛋白胨；PB实验结果表明，影响质粒产量的3个主要影响因子为酵母提取物、甘油、MgSO4，最后经过最陡爬坡和CXD优化后，确定了工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA发酵培养基ITB的成份和水平，在500mL摇瓶的发酵规模下，质粒的容积产率达到12.38mg/L,是基础培养基LB发酵产量的2倍以上。综上所述，本发明的工程菌及培养基将在黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
[0025]下面结合具体实施 例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA连续传代30代，每隔5代抽提质粒，用PVU I进行单酶切，用PVU I和Spe I进行双酶切的酶切鉴定结果
[0027]图2为工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA连续传代30代，每隔5代抽提质粒，质粒的I %琼脂糖凝胶电泳图谱
[0028]图3为工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA的平板点种结果
[0029]图4为工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA的革兰氏染色镜检结果
[0030]图5为工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在生化检测培养基中的生长情况
[0031]图6A为工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在4种培养基中随培养时间菌密度的变化情况
[0032]图6B为工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在4种培养基生长的工程菌中质粒的结构I %琼脂糖凝胶电泳检测结果
[0033]图7为不同碳源对工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA质粒产量(容积产率)影响的柱状图
[0034]图8为不同氮源对工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA质粒产量(容积产率)影响的柱状图
[0035]图9为三个显著影响因子交互作用对质粒产量(容积产率)影响的曲面图和等值线图
【具体实施方式】
[0036]本发明的发明人前期经研究获得了具有突出原创性的基于甲病毒复制子载体的新型黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA (参见文献:张亮，阎瑾琦，王越，等.可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达[J].南方医科大学学报，2011,3(6):937-942.该文献中命名“PSCK_2PFcGB”的可复制型抗肿瘤DNA疫苗即为本发明黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA，发明人为商业推广在本发明中对该疫苗进行了重新命名)，初步药效学研究显示，该疫苗可以有效地诱导小鼠体内特异的细胞免疫及体液免疫应答，能够有效地抑制移植瘤的生长。目前正在进行该疫苗的中试工艺及质量控制体系的建立，以促进该新型黑色素瘤治疗性疫苗的进一步发展。基于甲病毒复制子载体的质粒DNA疫苗一般分子量都较大，能达到14kb以上，而黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA分子量接近15kb，分子量如此大的质粒DNA (命名为“pSVK-CAVA质粒DNA”或“质粒DNA pSVK-CAVA”)无论是在上游的设计和构建，还是到下游的提取和工艺研究，都具有较大的挑战性。前期的实验发现:在以大肠杆菌DH5ci为宿主菌时，随着传代次数的增加，该质粒DNA疫苗会发生分子量变小的情况，代数越多变小的情况越严重，到最后提取的质粒已经不是所需要的目的质粒，这对于后续的中试工艺研究以及产品的发展极为不利。发明人进一步分析研究，由于质粒在宿主菌里发生了重组或丢失，造成这种现象的原因可能是由于宿主菌本身负荷过大的问题，也可能是质粒分子量过大或由于其源于甲病毒，易发生重组或片段丢失等自身原因造成的。造成宿主菌里质粒发生重组或片段丢失与质粒本身的特性以及宿主菌等都有一定的关联，首先黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA是一种基于病毒的载体，比常规的质粒DNA更易发生重组或片段丢失；另外，由于该质粒pSVK-CAVA自身相对分子质量将近15kb，在宿主菌里复制时会给菌体造成严重的负荷，从而引发质粒的不稳定性增加，产生上述截短质粒的情况。
[0037]想要解决上述问题，发明人提出:筛选质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的最适宜宿主菌，并进行培养基成分的优化。
[0038]因此，第一方面，本发明提供一种用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，其是转化有黑色素瘤治疗性质粒DNA pSVK-CAVA的大肠杆菌XLIO-Gold，命名为 E.coli XLIO-Gold/CAVA。
[0039]可用本领域技术人员熟知的常规技术，将黑色素瘤治疗性质粒DNA pSVK-CAVA转化大肠杆菌XLlO-Gold,转化方法包括但不限于Hananhan法(分子克隆实验指南(第三版)87-92页)、Inoue 法(分子克隆实验指南(第三版)93-96页)、氯化钙法(分子克隆实验指南(第三版)96-99页)、电击转化法(分子克隆实验指南(第三版)99-102页)。
[0040]另一方面，本发明还提供一种用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的高产发酵培养基(ITB)。每IL该培养基中含:酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油
3.05mL, NH4Cllg,0.17mol/L KH2PO4 和 0.72mol/L K2HPO4 混合溶液 IOOmL, Mg2SO40.185g，微量元素 lmL，微量元素包括 FeCl3.6H2027g/L,ZnCl22g/L,CoCl2.6H202g/L、Na2MoO4.2H202g/UCaCl2.2H201g/L 或无水 CaCl20.76g/L、CuCl2.2H201.27g/L、H3BO30.5g/L，溶于 1.2mol/LHCl ;所述K2HPO4和KH2PO4混合溶液的配制方法是:用90mL去离子水溶解2.31g KH2PO4和12.54g K2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至lOOmL。
[0041]还一方面，本发明还提供一种用上述工程菌和高产发酵培养基生产黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的方法。该方法是:
[0042]I)种子液的制备:从_70°C复苏一支E.coli XLIO-Gold/CAVA工作种子，按1:100接种于5mL的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养12小时。按照1:100再转接于IOOmL的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养12小时左右，此时得到种子液；
[0043]2)发酵培养:将种子液按照1:100的量种于5L发酵罐(中试生产)内进行发酵培养，发酵罐内含有高产发酵培养基ITB的量为3L，pH值控制在7.0±0.1(通过发酵罐自动补入H2SO4和NH3.H2O来调节培养基的pH值)，培养温度为37°C，溶解氧控制在30%左右(当溶解氧降低到该值时，通过补充纯氧和提高搅拌速度来调节)。发酵培养6h后，按照lmL/min的流速补加高产发酵培养基ITB，总共补加500mL。发酵15小时后，结束发酵，收菌，提取质粒，得到黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA。
[0044]本发明还构建多级种子库,所述E.coli XLIO-Gold/CAVA工作种子来源于该种子库。种子库的构建过程包括:
[0045]I)制备原始种子库:将E.coli XLIO-Gold/CAVA工程菌菌液0.5mL扩大至IOOmLLB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时，加入30%甘油，分装50管并冻存于-70°C冰箱，得到原始种子库；
[0046]2)制备主种子库:复苏一支原始种子接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至IOOmL LB培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后加入30%甘油，并分装50管得到主种子库，冻存于-70°C冰箱，得到主种子库；
[0047]3)制备工作种子库:从主种子库中取I管菌种，接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至IOOmL LB培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后加入30%甘油，分装50管并冻存于-70°C冰箱，得到工作种子库，每支工作种子库中的菌种限传5代，用于黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生产。
[0048]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J.,Russell,David ff.,MolecularCloning:A Laborat ory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0049]所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(mg/100ml)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
[0050]实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0051]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0052]实施例1、黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的高稳定性宿主菌的筛选及稳定性检测
[0053]将黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA质粒DNA分别转化不同基因型的大肠杆菌感受态细胞DH5 a、DHlO β、ToplO和XLIO-Gold，转化方法为Hananhan法(分子克隆实验指南(第三版)87-92页)、Inoue法(分子克隆实验指南(第三版)93-96页)、氯化钙法(分子克隆实验指南(第三版)96-99页)、电击转化法(分子克隆实验指南(第三版)99-102 页)。
[0054]以氯化钙法转化XLlO-Gold为例进行示例性说明:
[0055]pSVK-CAVA质粒DNA的获得参见文献(张亮，阎瑾琦，王越，等.可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达[J].南方医科大学学报，2011,3(6):937-942.)。该文献中命名“PSCK_2PFcGB”的可复制型抗肿瘤DNA疫苗即为本发明黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗“pSVK-CAVA”，发明人为商业推广在本发明中对其进行了重新命名。本发明中pSVK-CAVA质粒DNA即为文献中介绍的PSCK_2PFcGB质粒。
[0056]从_70°C冰箱中取100 μ I感受态细胞XLlO-Gold,立即于冰浴中解冻10分钟，然后加入pSVK-CAVA质粒DNA25-50ng，轻柔混匀后，置冰浴中30分钟。冰浴结束后，于42°C水浴中热击90秒，后迅速置于冰浴中冷却3-5分钟，向管中加入800 μ I无抗性的LB液体培养基，混匀后于37°C，200rpm振荡培养I小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因，此时得到pSVK-CAVA质粒DNA的转化菌XLIO-Gold。
[0057]将转化菌XLlO-Gold涂布于LB (Luria-bertani Medium)固体平板培养基(LB液体培养基配方:胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g,似(:11(^,加入蒸懼水溶解,51]101/]^^0!1调节pH至7.0，定容至1000mL,高压灭菌后4°C保存备用。LB固体平板培养基则是在LB液体培养基中加入琼脂(15g/L)，高压灭菌，当温度降至50°C时加入硫酸卡那霉素至终浓度为20 μ g/mL,以下培养基均为此抗性水平)，在37°C、200rpm下培养15小时后挑取单克隆菌落，接种于5mL LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后按照1:100进行连续传代培养(12小时转接传代I次)，传代之前取ImL菌液抽提质粒，通过I %琼脂糖凝胶电泳检测质粒的形态以及超螺旋比例，紫外分光光度计测量质粒浓度，联合连续传代法(每12小时转接I代)对工程菌的稳定性进行检测。[0058]转化有pSVK-CAVA质粒DNA的大肠杆菌XLlO-Gold工程菌连续传代30代，每隔5代抽提质粒，用PVU I进行单酶切，用PVU I和Spe I进行双酶切，酶切鉴定结果如图1所示(M:DL15000Marker ；1:质粒 pSVK-CAVA ；2:PVU I 单酶切片段；3:PVU I 和 Spe I 双酶切片段)，用PVU I单切得到14748bp线性化质粒片段，用PVU I和Spe I双酶切得到12751bp和1997bp两个DNA片段，与预期结果一致，表明质粒的结构稳定性良好。转化有pSVK-CAVA质粒DNA的大肠杆菌XLlO-Gold工程菌连续传代30代，每隔5代抽提质粒，质粒的I %琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示(1:原代；2:5代；3:10代；4:15代；5:20代；6:25代；7:30代；M:DL15000Marker)，工程菌表现出良好地遗传稳定性，质粒拷贝数基本保持稳定，同时保持了较高的超螺旋比例。
[0059]本实施例用示例的方法对4种备选宿主菌进行筛选，结果都能成功生长单克隆；挑取单克隆进行传代培养，其中大肠杆菌DH5a、DHlO β , Τ0Ρ10在传代2次以后均出现不同程度的质粒重组和丢失，而且往下继续传代，这种重组和丢失情况变得更加严重，传代5次之后就几乎没有原质粒了。但是大肠杆菌XL10-G0LD能够很好的保持质粒进行稳定的拷贝，传代30代后依然很稳定，非常适合作为高达15kb之大的黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的宿主菌，解决了大质粒容易发生重组和丢失这一难题。
[0060]本发明将该转化有pSVK-CAVA质粒DNA的大肠杆菌XLIO-Gold，命名为“黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA”。经鉴定(参见实施例
2)，该工程菌表现出良好地遗传稳定性，质粒拷贝数基本保持稳定，同时保持了较高的超螺旋比例。
[0061]利用该工程菌建立三级种子库，可将E.coli XLIO-Gold/CAVA菌液扩大至IOOmLLB液体培养基(配方:胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g, NaCllOg,加入蒸懼水溶解,5mol/LNaOH调节pH至7.0，定容至1000mL,高压灭菌后4°C保存备用。)培养，在37°C、200rpm下培养12小时，加入30%甘油，分装50管并冻存于_70°C冰箱，得到原始种子库。复苏一支原始种子接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至IOOmL LB培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后加入30%甘油，并分装50管作为主种子库，冻存于-70°C冰箱。从主种子库中取I管菌种，按上述方法操作，冻存50管作为工作种子库，用于常规生产。每支工作种子库中的菌种限传5代。
[0062]实施例2、黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA工程菌E.coliXLlO-Gold/CAVA的鉴定
[0063]—、工作种子库遗传稳定性和结构稳定性检测
[0064]37°C水浴加热复苏I支工作种子，按接种于5mL LB培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后1:100传代，以此方法连续传代30代，选原代、5代、10代、15代、20代、25代、30代菌液抽提质粒，经I %琼脂糖凝胶电泳及酶切检测工作种子库的结构稳定性。
[0065]结果工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA连续传代30代，每隔5代抽提质粒，质粒的1%琼脂糖凝胶电泳图谱(见图2)表明工程菌表现出良好地遗传稳定性，质粒拷贝数基本保持稳定，同时保持了较高的超螺旋比例；此外，用PVUl单切得到14748bp线性化质粒片段，用PVU I和Spe I双酶切得到12751bp和1997bp两个DNA片段，与预期结果一致，表明质粒的结构稳定性良好。[0066]二、工作种子库的质粒丢失率检测
[0067]对第30代菌液检测质粒丢失率，取第30代菌液稀释后铺于不含卡那霉素的LB平板上培养过夜，选取100个单克隆点种于含20 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，在37°C、200rpm下培养15个小时，计数生长的单克隆菌落数，计算质粒丢失率:质粒丢失率=(100-在平板上长出的菌落数)/100 X 100 %。
[0068]结果如图3所示,生长了 100个点,质粒丢失率为O,表明该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性，传代30代后依然保持稳定。
[0069]二、细菌形态和革兰氏染色特征及其生化特征
[0070]工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA的革兰氏染色镜检图如图4 (放大倍数1000倍)所示，根据镜检显示，工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA为杆菌，革兰氏染色为红色(图中显示为深色)，说明是革兰氏阴性菌。还考察了工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在含葡萄糖、乳糖、甘露醇三种不同糖类培养基中的生长情况，方法为:将工程菌E.coli XLlO-Gold/CAVA以穿刺的方法接种在生化检测培养基[配方:用邓亨氏(Dunham)蛋白胨水溶液(蛋白胨lg，氯化钠0.5g，水IOOmL,pH7.6)，每IOOmL加入1.2mL的0.2%溴麝香草酚蓝作指示剂。在培养基中加入琼脂达0.5-0.7%，分装于试管，高压灭菌10分钟。0.2%溴麝香草酚蓝溶液配法:溴磨香草酹蓝0.2g, 0.lmol/L Na0H5mL,蒸懼水95mL。
[0071]在37°C、200rpm下培养24小时，观测其发酵和产气情况，分析生化特征。结果如图5所示，工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在葡萄糖和甘露醇培养基中出现黄色(图中浅色部分)，在乳糖培养基中未出现黄色，试管溶液显示为蓝色(图中深色部分)，说明工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA能够发酵葡萄糖、甘露醇，不能发酵乳糖，两种变黄的培养基中都没有气泡的产生，说明工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA发酵过程中不产气。
[0072]实施例3、不同基础培养基对工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA生长和质粒产量(容积广率)的影响
[0073]为了找出适合工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA生长和质粒生产的培养基，将工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在四种不同的细菌培养基中进行培养:
[0074]LB——配方:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g，加入蒸馏水溶解，5N NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL,高压灭菌后4°C保存备用。[0075]TB——配方:酪蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，加入蒸馏水溶解，定容至900mL，高压灭菌后4°C保存备用。当溶液冷却至50°C时加入IOOmL无菌的0.17mol/LKH2PO4,0.72mol/L K2HPO4溶液。该溶液的配制方法是:用90mL去离子水溶解2.31g KH2PO4和12.54g K2HPO4,完全溶解后,用去离子水定容至IOOmL并高压灭菌20min。
[0076]M9(葡萄糖)-配方:5XM9 盐溶液 200mL, lmol/LMgS042mL, 20 % 葡萄糖溶液
2OmL, lmol/LCaCl20.1mL,灭菌的蒸懼水定容至1000mL。5XM9盐溶液的配制方法:用蒸懼水溶解下列盐类，终体积为 IL =Na2HPO4.7H2064g, KHP0415g, NaC12.5g，NH4Cl5.0g，高压灭菌后4 C保存备用。
[0077]M9(甘油)-配方:5XM9 盐溶液 200mL，lmol/LMgS042mL，20 % 甘油溶液 20mL，
lmol/LCaCl20.lmL，灭菌的蒸馏水定容至1000mL。5XM9盐溶液的配置方法:用蒸馏水溶解下列盐类，终体积为 IL =Na2HPO4.7H2064g, KHP0415g, NaC12.5g，NH4Cl5.0g，高压灭菌后 4°C
保存备用。
[0078]培养方法为:复苏一支E.coli XLIO-Gold/CAVA工作种子，按1:100接种于511^ LB培养基中，37°C、200rpm培养12小时，1:100传代一次后接种于IOOmL上述四种基础培养基中，每隔3h取ImL菌夜，一部分用于测定菌体密度(采用分光光度计测定600nm波长的A值一0D600)监测菌体生长情况，一部分用于小量提取质粒并测定质粒浓度，发酵结束后取IOmL菌液离心洗涤后，烘干并测菌体干重。
[0079]菌体的干重通过分析天秤进行测定，具体操作:干燥的EP管，准确称重(Gl)，取大肠杆菌发酵液5mL，8000rmp离心10min，弃上清，沉淀用PBS洗涤两次，将沉淀连同离心管置于烘箱中，80°C干燥至恒重(约24h)，在干燥器中冷却至室温，准确称重(G2)，菌体干重为G2-G1。最终取每个发酵菌液3次平行样品测量结果的平均值。
[0080]选择菌体生长情况最佳、质粒容积产率最高和质粒特异性产率最好的培养基作为基础发酵培养基。在不同培养基中的菌体密度测定结果如图6A所示，菌体生物量、质粒容积产率和特异性产率如表1所示，可以看到工程菌E.coli XLIO-GoId/CAVA在TB培养基体现出了明显的生长优势，特别是容积产率，比LB培养基有了较大的提升。在不同培养基生长的工程菌中质粒的I %琼脂糖凝胶电泳检测结果如图6B(M:DL15000Marker ；1:LB培养基；2:TB培养基；3:M9 (甘油)培养基；4:M9 (葡萄糖)培养基)所示，2号泳道(TB培养基)的质粒浓度和超螺旋的比例均优于其它泳道的质粒，在质粒抽提过程中，用同样体积的洗脱液进行洗脱，即说明了用TB培养基发酵能够得到更高的质粒产量以及更高的超螺旋比例。因此，选择TB作为基础培养基，进行进一步的研究。
[0081]表1菌体生物量、质粒容积产率和特异性产率
[0082]
【权利要求】
1.一种用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵培养基ITB，每IL培养基含:酪蛋白胨10_14g，酵母提取物16-20g，甘油2.4-4mL, NH4Cl0.75_lg，0.17mol/LKH2PO4 和 0.72mol/L K2HPO4 混合溶液 75-100mL，MgSO40.168-0.216g，微量元素 0.75-lmL。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基ITB，其特征在于，每IL培养基含:酪蛋白胨12g，酵母提取物 16.61g，甘油 3.05mL, NH4Cllg, 0.17mol/L KH2PO4 和 0.72mol/L K2HPO4 混合溶液 lOOmL，MgSO40.185g，微量元素 lmL。
3.根据权利要求1或2所述发酵培养基ITB，其特征在于，微量元素包括:FeCl3.6H2027g/L、ZnCl22g/L、CoCl2.6H202g/L、Na2MoO4.2H202g/L、CaCl2.2H201g/L，或无水 CaCl20.76g/L、CuCl2.2Η201.27g/L、H3BO30.5g/L，溶于 1.2mol/L HCl。
4.根据权利要求1或2或3所述的发酵培养基ITB，其特征在于=K2HPO4和KH2PO4混合溶液的配制方法为:用90mL去离子水溶解2.31g KH2PO4和12.54g K2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至lOOmL。
5.一种黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生产方法，是复苏工程菌E.coliXLIO-Gold/CAVA工作种子，按体积比1:100比例接种于5mL LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时，按照1:100再转接于IOOmL的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养12小时左右，得到种子液； 将种子液按体积比1:100的量接种于含3L权利要求1或2或3或4所述发酵培养基ITB的5L发酵罐内，pH值控制在7.0 ± 0.1，培养温度为37°C，溶解氧控制在30 %左右，发酵培养6h ;之后按照lmL/min的流速补加发酵培养基ITB,总共补加500mL,发酵15小时后，结束发酵，收菌，提取 质粒，得到黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA。
6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于:所述工程菌E.coli XLlO-Gold/CAVA,是将黑色素瘤治疗性pSVK-CAVA质粒DNA转化大肠杆菌XLlO-Gold得到转化菌XLlO-Gold ;再将转化菌XLlO-Gold涂布于LB固体平板培养基，在37°C、200rpm下培养15小时后挑取单克隆菌落；将单克隆菌落接种于5mL LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后按照1:100进行连续传代培养，12小时转接传代I次，可连续传代30代；单克隆菌株以及传代30代以内历次传代菌株均为转化大肠杆菌XLlO-Gold的工程菌。
7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于:所述工程菌E.coli XLlO-Gold/CAVA，为用氯化钙法转化大肠杆菌XLlO-Gold的工程菌，转化方法包括:将-70 °C保存的100 μ I感受态细胞XLlO-Gold于冰浴中解冻10分钟，然后加入pSVK-CAVA质粒DNA25-50ng,轻柔混匀后，置冰浴中30分钟；冰浴结束后，于42°C水浴中热击90秒，后迅速置于冰浴中冷却3-5分钟，加入800 μ I无抗性的LB液体培养基，混匀后于37°C，200rpm振荡培养I小时，得到pSVK-CAVA质粒DNA的转化菌XL10_Gold。
8.根据权利要求5或6或7所述的生产方法，其特征在于:所述E.coli XLlO-Gold/CAVA工程菌工作种子按以下方法得到: 1)制备原始种子库:将所述工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA菌液0.5mL扩大至IOOmLLB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时，加入30 %甘油，分装50管并冻存于-70 V冰箱，得到原始种子库； 2)制备主种子库:复苏一支原始种子接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至IOOmL LB培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后加入30%甘油，并分装50管得到主种子库，冻存于-70°C冰箱，得到主种子库； 3)制备工作种子库:从主种子库中取I管菌种，接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至IOOmL LB培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后加入30%甘油，分装50管并冻存于-70°C冰箱，得到工作种子库；每支工作种子库中的菌种限 传5代用于黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生产。
【文档编号】C12N1/21GK103952367SQ201410214231
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2013年4月16日 优先权日:2013年4月16日
【发明者】于继云, 阎瑾琦, 王宇, 徐元基, 张巍, 吴昊, 张亮, 朱晓明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所