用于表征生物细胞的行为特性的振动微板生物感测的制作方法

用于表征生物细胞的行为特性的振动微板生物感测的制作方法
【专利摘要】本文描述了表征至少一个生物细胞的特性或行为的方法。该方法包括如下步骤：提供微板；将所述微板的至少一个表面浸在细胞培养基中以使至少一个待表征的生物细胞与该微板接触；振动该微板；提供多个与所述微板偶联的彼此分隔开的传感器；在振动该微板的过程中，从每个传感器获得各自的传感数据时间序列，所述微板和传感器排列成使得所获得传感数据时间序列不彼此独立；处理所述传感数据时间序列以表征所述至少一个生物细胞的特性或行为。还描述了用于表征至少一个生物细胞的特性或行为的相应系统。
【专利说明】用于表征生物细胞的行为特性的振动微板生物感测
[0001]本申请是申请号为201080029139.9、发明名称为“用于表征生物细胞的行为特性的振动微板生物感测”的申请的分案申请，该母案申请是2010年6月25日提交的PCT申请PCT/GB2010/001252进入中国国家阶段的申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及用于表征至少一个生物细胞的特性或行为的方法和系统。例如，所述方法和系统可用于表征细胞特性和 行为，如细胞繁殖、细胞极性、细胞移动、细胞生长、细胞收缩、细胞迁移、细胞增殖、细胞分化和体外微生物生长。
【背景技术】
[0003]当前，对生物细胞物理特性和行为的测量主要在显微镜下利用显微成像系统进行。细胞培养、监测和操作的任务可能乏味而费时。细胞对外界刺激的应答常常难以实时观测。
[0004]工程师、物理学家、化学家和生物学家对机械换能器原理在设计微电子机械系统(MicroElectroMechanical Systems, MEMS)传感器中的应用越来越感兴趣。应用最广泛的机械装置是微悬臂梁。它已在MEMS中用于建立不同类型的传感器，如带有AFM集成尖头的力传感器(force sensors with integrated tips for AFM)、双金属温度和热传感器、质量载荷传感器、介质粘弹性传感器，以及热重法传感器和应力传感器。微制造技术、表面功能化生物化学和悬臂梁传感方法的结合为开发以临床和环境应用为目的的生物传感器提供了机遇。由Basel等撰写的文章“A high-sensitivity micromachinedbiosensor” (Biosensors and Bioelectronics,第 12 卷，第 8 期，1997,第 4页)提出了用微悬臂梁检测粘着于功能化表面上的受体包被磁珠的存在情况。由Fritz等撰写的文章“Translating biomolecular recognition into nanomechnaics，，(Science,第 288 卷，第5464期，2000年4月14日，第316-318页)用两个平行微悬臂梁监测了 ssDNA的杂交，两个平行微悬臂梁之间的差异性偏转允许区分仅有单个碱基错配的两个相同的12聚寡核苷酸。
[0005]尽管如此，仍需要能够实现在体外对基本生物学过程(例如细胞的移动、收缩、迁移、增殖或分化，以及微生物生长)进行动态和接触性测量的微传感系统。已经提出了此类传感器的许多应用领域。由Bhadriraju和Chen撰写的文章“Engineering cellularmicroenvironments to improve cell-based drug testing，，(DDT,第 7 卷，第 11 期，第612-620页，2000年6月)提出利用改造细胞微环境来改善基于细胞的药物测试。由Ono 等撰写的文章“Morphological changes and cellular dynamics of oligodentrocytelineage cells in the developing vertebrate central nervous system，，(Developmentalneuroscience，第23卷，第4_5期，第346-355页，2001年)认为，对少突胶质细胞谱系细胞的形态学变化及其包括细胞迁移和增殖在内的细胞动态的研究将提供对OPC在中枢神经系统中分布的潜在分子机制的认识。由Ludtke等撰写的文章“The Effect of Cell Divisionon the Cellular Dynamics of Microinjected DNA and Dextran”(卷 5:579-588 (2002),Molecular Therapy, 6 (I)，2002年7月，第134页)通过显微注射DNA和葡聚糖显示了细胞分裂对细胞动态的影响。
[0006]为提供除显微镜以外的另一种细胞测量手段，本发明试图提供一种微传感方法和系统以对细胞生长和动态特性(如体外移动、收缩、形态学变化、迁移)进行更好的检测和监测。本发明所述方法和系统旨在对现有成像系统提供补充。
[0007]发明概沭
[0008]根据本发明的第一个方面，提供了对至少一个生物细胞的特性或行为进行表征的方法。该方法包括以下步骤:提供微板；将所述微板的至少一个表面浸没于细胞培养基中，以使至少一个待表征的生物细胞与所述微板接触；振动所述微板；提供与所述微板偶联的彼此分隔开的多个传感器；在振动所述微板的过程中，从每个传感器获得各自的传感数据时间序列，所述微板和传感器排列成使得所得的传感数据时间序列不彼此独立；处理所述传感数据时间序列，以对所述至少一个生物细胞的特性或行为进行表征。
[0009]因此，为克服与使用显微成像系统测量生物细胞物理特性和行为有关的困难，并使得对细胞特性和行为进行一致的定量测量成为可能，本发明提供了集成的细胞监测方法，这通过利用来自于浸没于细胞培养液中的板的动态信息和先进的系统识别技术来实现。本发明克服了与利用显微成像系统使细胞对外界刺激的应答实时可见有关的常见难题。板动态和自动时间序列分析的集成能提供细胞的动态信息史，而不完全依赖于连续成像监测。现有技术 均不能提供本发明所能够提供的细胞信息。此外，本发明提供了一种天然的细胞生长环境，例如没有荧光或激光漂白。本发明还使得对生物细胞的实时连续监测成为可能。本发明具有高灵敏度和快速响应时间。
[0010]此外，微板的动态比上述公知的微悬梁臂更为复杂。由于其更有意思的动态特性，微板作为微传感介质与微悬梁臂相比可提供额外的信息。并且，微板因为活细胞可在其表面的细胞培养基中维持而具有维持细胞(和微生物)天然培养环境的新益处。
[0011]本发明的一个实施方案中，细胞表征方法的处理步骤包括:指定细胞动态行为类别；和处理传感数据时间序列以确定所述至少一个细胞的动态行为是否在所指定的细胞动态行为类别内。另一实施方案中，处理步骤包括:指定细胞特性；和处理传感数据时间序列以确定对至少一个细胞的指定特性的测量。
[0012]处理步骤可以包括在一个或多个时间域、频率域和小波域中分析传感数据时间序列。处理步骤可以包括分析频率响应函数(frequency response function, FRF)。处理步骤可以包括使用神经网络和Karhunen-Loeve分解。
[0013]—个实施方案中,微板被周期性地振动。另一实施方案中，微板被随机地振动。
[0014]根据本发明的第二个方面，提供了用于表征至少一个生物细胞的特性或行为的系统。该系统包括:细胞培养基容器；置于所述容器中的微板，以使得当所述容器至少部分充满细胞培养基时，所述微板的至少一个表面浸入细胞培养基中；至少一个可用于振动所述微板的驱动器；与所述微板偶联的彼此分隔开的多个传感器，每个传感器可在振动所述微板的过程中提供相应的传感数据时间序列，所述微板和传感器排列成使得所提供的传感数据时间序列不彼此独立；和处理器，其可接收来自传感器的传感数据时间序列处理所接收的传感数据时间序列，以对与该微板接触的至少一个生物细胞的特性或行为进行表征。[0015]微板边界条件可以选自例如夹具式、悬臂式、自由式和点支撑式。
[0016]传感器可以选自压阻计传感器(piezoresistive gauge sensor)、光学传感器、应变传感器和加速度传感器。
[0017]一个实施方案中，所述至少一个驱动器包括压阻式换能器。另一实施方案中，所述至少一个驱动器包括声驱动器。
[0018]—个实施方案中，所述容器为培养皿。
[0019]本发明的其它优选特征陈述于所附权利要求中。
【专利附图】

【附图说明】
[0020]现在将根据附图通过举例来阐述本发明的实施方案，其中:
[0021]图1a为用于本发明生物传感系统的生物传感平台的平面图。
[0022]图1b为图1a中生物传感平台的侧视图。
[0023]图2为用于本发明生物传感系统的生物传感平台的透视图。
[0024]图3为用于构建非线性处理模型的自动化生物传感系统装置示意图，显示了其主要功能及元件。
[0025]图4为集成式生 物传感平台的扫描电子显微镜(SEM)图像。
[0026]图5显示了生物传感平台的微板表面上覆盖的内皮细胞的激光扫描测微仪(LSM)图像。
[0027]图6展示了生物传感平台的动态测试装置。
[0028]图7、图8和图9展示了 3种不同类型微板在3种不同细胞密度下的频率响应函数(FRF)。图7使用了 100 μ m的正方形C-F-F-F微板；图8使用了 200 μ m的正方形C-F-C-F微板；图8使用了 300 μ m的正方形C-C-C-C微板。在各个实例中，(a)和(b)显示内皮细胞包被在微板表面上，和(c)显示根据细胞密度归一化的速度幅值。
[0029]图10、11和12表明随着三个测试微板(分别为N0.1,N0.1I和N0.1II)上细胞数量增加时FDRn的趋势。FDRn是频差比(Frequency Difference Ratio),通过在测量的共振模式η下装载细胞和不装载细胞的膜之间的归一化的共振频率差异来评估。
[0030]图13显示了每批实验中图10、11和12所示三种微膜的AFDR指标。AFDR是所有测量FDRn的平均值。
[0031]图14显示了基于简单图像处理技术进行的细胞群定量。
[0032]图15为用于细胞识别的BP神经网络的示意图。
[0033]图16显示了使用以样品I至14训练的BP神经网络所得的样品编号15至18的CDR预测结果。
[0034]优选实施方案详述
[0035]本发明的微米/纳米级生物传感系统包括细胞培养基(例如细胞培养液)容器(未显示)。生物传感平台置于细胞培养基容器中。
[0036]图1a和Ib显示了生物传感平台10的一个实施方案的平面图和侧视图。图2中的透视图显示了一个稍有不同的实施方案。
[0037]生物传感平台10主要是由SIO基底12形成的。生物传感平台10包括微板14，两个压阻式换能器(PZT)形式的驱动器16，四个彼此分隔开的传感器18，和电源输入(未显示)。该生物传感系统还包括可形成该生物传感系统的一部分的处理器(未显示)。生物传感平台10被设计为可在流体(如水)中运行，在高阻尼条件下具有良好的生物灵敏度。生物传感平台10可以单边或双边浸没于置于流体容器中的细胞培养液中，以维持天然细胞生活环境。生物传感平台12使用生物相容性材料，例如硅和金，以在其浸没于细胞培养基时使得生物细胞能够利用其作为天然的生长基底。
[0038]微板14是作为微米/纳米级传感平台的薄型微制造膜。微制造膜(板/隔板)是一种有望代替微悬臂梁的质量传感结构。与微悬臂梁相比，微膜可具有更大的传感面积、在液体中更高的灵敏度和更低的脆性。此外，微膜在质量传感的应用中具有与微悬臂梁相同的优点。微板14是可变形的。微板14在X和Y方向上具有数十至数百微米范围内的尺寸。例如，微板14在X和Y方向上可具有数十至数千微米(例如100-400μπι)的尺寸。如图1b中所示，板在Z方向上的深度约为3 μ m，但几纳米至几十微米范围内的深度也适用。这些尺寸意为代表性而非限定。微板14可以通过多种不同边界条件(例如，夹具式、悬臂式、自由式和点支撑式等)得以支撑。在图2所示的实施方案中，微板14为矩形。微板14通过四个铰合件(hinge) 20支撑，每个铰合件各自位于微板14四边之一的中心。这是微板边界条件的一个实例。
[0039]驱动器(即激发源)被用于使细胞培养基中的微板14振动。在图1a和Ib所示的实施方案中，驱动器为两个PZT(锆钛酸铅)薄膜16。PZT16放置于微板14区域的内部或旁边，以在有限的能耗下提供强大的激发力。因此，生物传感系统被设计为能够自激发。作为使用PZT驱动器的替代选择,微板14也可通过声激发(sound excitation)来驱动。驱动器16可集成到生物传感平台10中。驱动器16可集成到微板14中。
[0040]生物传感系统被设计为能够自传感(self-sensing)。图1a和图2显示了四个分布式(distributive)压阻计(PZR)传感器18。传感器18被置于精心选择的位置处，以得到微板14的全域动态/振动信息。传感器18可嵌入微板14内。使用先进的微制造技术来生产传感元件14和相关的连接轨道22，如图2所示。作为使用PZR传感器的替代选择，不同的传感器类型均可使用，例如光学、应变或加速度传感器。传感器18可集成到生物传感平台10中。传感器18可集成到微板14中。传感器18的位置可被优化，以使分辨灵敏度最大化并使微板表面上的高性能范围最大化。
[0041]PZT驱动器16和压阻计传感器18具有良好的CMOS电路相容性，并容易与其它电子组件集成在一起。生物传感平台10的电子部件(例如电极线、金片和连接探针)用生物相容性材料密封。整个生物传感平台10用标准DIL (双列直插式)封装。信号流(输入和输出信号)可由外部处理仪器或内部电子芯片来处理。
[0042]使用先进的工具和流程来进行生物传感平台的微米/纳米制造，包括纳米制造中的光和电子束蚀刻、等离子蚀刻和能够蚀刻并快速成型的聚焦离子束工具。
[0043]在使用中，生物传感系统用于区分单个细胞或细胞群的特性或行为。
[0044]细胞培养基容器部分地或完全地被细胞培养基充满。生物传感平台10的微板14被放置到细 胞培养基容器中，使得微板14的至少一个表面淹没或浸于细胞培养基中。例如，微板14可完全浸没于细胞培养基中。或者,仅微板14的底面浸入在细胞培养基中。微板14浸没在细胞培养基中使得细胞培养基中的生物细胞可以利用微板14作为天然生长基底。因此，至少一个生物细胞与微板14有接触，其行为/特性将通过所述生物传感系统和方法进行表征。
[0045]微板14随后由驱动器(例如PZT16)振动。微板14可被周期性地(例如，使用正弦函数)激发，或是以宽频段随机信号(例如，伪随机二元信号、白噪音或脉冲随机)随机地激发。激发/振动的类型将因实施目的而异。微板14被振动是因为接触的生物细胞自身对微板14不施加显著的力。接触的生物细胞对微板14的质量、刚度和拉伸特性产生影响。因此，这些变量的测量值(例如，应变仪测量值)可用于对接触的生物细胞对微板14的影响进行定量，并由此推断待表征细胞的行为/特性。使用静态微板14，接触细胞对微板14的偏转非常微弱，使得难以检测微板14内应力场的信号。所以，可能难以推断待表征细胞的特性/行为。因此， 有利地使微板14以朝向或远离所接触生物细胞的方向进行振动，以在微板14内应力场中由于细胞存在而产生的更强信号。作为替代/补充，微板14可向其它方向振动，而不仅朝向或远离接触生物细胞。振动微板14还具有其它优点:振动提供了关于微板14动态特征的额外信息(例如，固有频率偏移、模式形状变化和其他非线性耦合效应)。该额外的动态信息也可用于表征接触细胞的特性或行为。
[0046]当微板被振动时，从各个传感器18获取各自的传感数据时间序列。微板14是提供接触生物细胞和传感器18之间非线性偶联的连续型介质。因此，传感器18通过微板14的形变响应和与微板14接触的生物细胞偶联，以使得传感数据时间序列不彼此独立。这意味着，虽然传感器18从微板14接收局部传感数据，但来自于特定传感器18的传感数据时间序列可显示出远离该传感器的细胞运动。换言之，传感器18通过微板14间接感测生物细胞的特性/行为。生物传感平台利用其动态/振动特征的变化作为信息源，以感测表面接触的生物细胞和颗粒。通过解读同步集合感测到的传感器18的应答，任何细胞扰动的性质均可以确定接触生物细胞特性或行为的方式来进行区分。由于在传感器18之间以偶联机制起作用的微板14的存在，传感器18以非独立(即偶联)的形式应答。由于该系统的偶联性质，微板14上仅需要相对少数量的分布式传感器18。生物传感平台10的分辨率不受限于传感器18的分隔距离，因此可用于检测比最小制造量级还小很多的变化。此外，由于系统的偶联性质，还可以在微板14的除了细胞接触表面以外的表面上提供传感器18。这增加了该方法的鲁棒性(robustness)。
[0047]得到传感数据时间序列后，用先进的系统鉴定方法和嵌入式IT工具处理这些时间序列，以表征至少一个生物细胞的特性或行为。在处理步骤中，将来自每一个传感器的传感数据时间序列与来自每一个其它传感器的传感数据时间序列一起进行处理(即，对数据进行综合处理)。处理是非线性的。例如，非线性信号处理技术如神经网络或Karhunen-Loeve分解可用于处理偶联的同步时间序列(以时间域或是频率域)。
[0048]非线性处理模型利用传感数据时间序列中的动态信息来检测细胞特性和行为。来自微板14的空间动态信息(即模式形状、传感器之间的偶联等)用于导出关于微板14上细胞的空间动态信息(例如，极性、干细胞生长)。用系统鉴定工具将处理步骤的输出与待表征细胞/组织的特性或行为关联起来。换言之，动态信息将与动态细胞特性的状态和特征关联起来。例如，目的特性或行为可以是药物开发、微生物和肿瘤筛查或者干细胞生物学中所必需的。这可包括静态或动态特性或行为，如繁殖、极性、细胞的移动/生长、收缩、迁移、增殖或分化以及体外微生物生长。本发明的系统和方法可用于在细胞培养、细胞操作和细胞手术过程中导出接触的细胞或细胞团的大小、形状和运动信息。生物传感方法和系统的一个目标是检测细胞培养和生长过程中细胞在形态、迁移、增殖、分化和收缩性方面的变化。通过系统鉴定算法，使用相对少的传感元件18，利用微板14的动态特征(如速度和加速度)推导所需信息。将微板14的动态应答信号(即传感数据时间序列)应用于智能时间序列鉴定算法，以导出期望的细胞特性或行为信息。细胞特性/行为的辨识通过使用嵌入的信息工具完成。根据应用的目的，输出可以为各种描述符的离散形式或连续形式。
[0049]生物传感系统中所用非线性处理模型用训练数据进行训练。微板14在不同的载荷条件下差异性地振动。因此，非线性处理模型将已知的微板14在液体环境中的动态考虑在内。例如，微板动态将受因微板14与细胞培养基(通常具有比水稍高的密度)相互作用而导致的声压波的影响。因此，通过使用微扫描激光振动计研究微板14在液体中的动态和声波辐射的微尺度效应的结果，建立了非线性处理模型。微扫描激光振动计用于测量微板14在液体中的动态和声波辐射，如固有频率、固有模式、某些受迫条件下的受迫响应。因此，微扫描激振动计的使用使得适当的非线性处理模型(例如，神经网络)得以建立。换言之，将使用微扫描激光振动计获得的结果作为例如神经网络的训练数据。通过模拟浸没的微板的动态，可以建立非线性处理模型以从振动的微板14的传感数据时间序列推导出载荷条件。在建模过程中，可通过模拟获得不同传感位置处的位移/速度/加速度。将动态信号(即传感数据时间序列)中提取出的参数与外力/载荷联系在一起的非线性处理模型是利用系统鉴定技术如Karhunen-Loeve分解、小波分析和人工神经网络方法建立的。非线性处理模型可通过用伪随机二元序列(PRBS)激发和鉴定方法通过实验进行测试和验证。PRBS信号的优点在于具有这一特性:其自相关函数是脉冲函数的准确近似。所有频率的动态均由PRBS信号激发。因此可导出微板14在任何受力条件下的动态。振动模型随后可用于通过微板14上不同位置的振动传感时间序列来推导施加于微板14上的受力/载荷。当系统鉴定技术应用于细胞/组织监测时，可推导细胞动态的状态和条件。微板14的加速度幅度在微板被浸没时会更 小，这是由于各个模式在微板14平面上产生一个声压，简正模式(normal mode)开始在液体中偶联。尽管如此，通过将传感器18置于适当的位置，可通过适当的系统鉴定技术将主要的模式形状与微板14上的载荷和动态条件联系起来。非线性处理模型将所检测瞬间的细胞行为与从微板传感表面导出的信息之间的关联考虑在内。将利用显微镜系统的CCD照相机用于监测可视行为，其输出通过同步化视觉处理系统与来自生物传感系统的信息和传感数据输出相关联。图3中显示了实验性设置的功能。
[0050]如上所述，生物细胞受外部刺激而表现出的一系列响应常常难以用现有显微成像系统进行实时显现。本文中描述的生物传感方法和系统增强了显微成像系统的可用测量，并且显著提高了提供给细胞生物学家的信息水平。本发明微板动态方法和系统的三种可能的应用如下所述。以下各类应用实例中，生物传感平台均浸入细胞培养基中。细胞随后附着于微板并于其上生长。
[0051]第一种可能的应用涉及膜极性。白细胞如单核细胞和嗜中性粒细胞在静息状态不表现任何极性，不过，响应于趋化性刺激时，膜受体变成极化的并向刺激所在方向运动。类似地，肿瘤转移潜势可定义为极化并定殖于新位点的能力。现有分析细胞迁移的技术是基于应答于触发物而跨越多孔膜的移动，其中方法灵敏度的缺陷决定了需要大体积样品来观察迁移。在分析肿瘤对转移抑制因子的响应时，仅有小体积样品可用，需要提高分析的灵敏度。使用本发明系统和方法，可以检测细胞膜的再分布和跨微板的迁移，作为嗜中性粒细胞对一系列趋化剂以及肿瘤对可能抑制转移潜势的基质金属蛋白酶抑制剂(如TAPI)的响应的指示标记。此类技术的开发提供了更高的药物开发灵敏度和速度。
[0052]第二种潜在的应用涉及细胞增殖、分化和凋亡。在胚胎发生过程中和活跃再生组织如肿瘤中，其中的细胞持续分裂。细胞增殖表现为细胞数量增加，其中可在任何一个时间对数以千计的细胞进行研究。同样，这种技术是粗放的，需要大量数目的细胞，而研究中将必然会有细胞的混合物。需要简单的技术来允许用少量样品进行细胞生长的灵敏检测。为达到这一目的，显微解剖可用于从肿瘤中提取单个细胞，细胞分裂的速度将根据本发明的方法和系统用微板动态以大小和质量的变化来检测。可以研究不同时间和剂量范围下对一系列化学治疗剂包括甲氨蝶呤的响应性，作为分化或凋亡过程中引发的细胞形状变化。
[0053]第三种潜在的应用涉及从干细胞发育为肌细胞。干细胞缺乏祖细胞确定性，使得其能发育成一系列成熟细胞类型。干细胞生物学因此促成了干细胞生物工程领域的快速发展；对环境信号的操作影响细胞的存活、增殖、自我更新和分化。这样，多元分析方法已被成功用于优化不同的干细胞培养过程。同样，该过程可通过使用感测形态学和功能上微小变化(包括具有收缩表型的那些)的技术而得以增强。可以诱导干细胞成熟形成平滑肌细胞，并可随后根据本发明方法和系统用微板动态以单个细胞为基础分析成熟形成收缩肌的效率。
[0054]实验结果
[0055]现在提供关于已根据本发明利用生物传感平台10进行的实验的进一步细节。具体地，研究了基于微制造矩形硅膜(即微板14)的生物传感系统。一个分布式传感方案监测了传感结构的动态。将人工神经网络算法用于处理测量的数据并表征细胞的存在和密度。因此，在这些实验中，待表征的细胞特性是细胞的存在情况和密度。不指定任何特定的生物学应用，本研究主要着眼 于这类生物传感器作为普通生物传感平台的性能测试。对这些微制造膜进行的生物传感实验包括在膜的传感表面接种不同密度的细胞并以一系列频率响应函数(FRF)的形式检测各个测试硅膜的相应动态信息。所有实验均在细胞培养基中进行以模拟实际工作环境。选择EA.Hy926内皮细胞系用于生物实验。EA.Hy926内皮细胞系代表一种特定类别的生物颗粒，具有不规则的形状、不均一的密度和不确定的生长行为，难以用传统生物传感器进行检测。最终的预测结果显示，基于神经网络算法从分布式传感测量进行细胞特征鉴定的方法在生物传感器中的应用潜力巨大。
[0056]应当注意的是，这些实验仅作为实例展示，其任何方面均不应被认为限制所附权利要求中所述的本发明范围。
[0057]1、膜生物传感设备的制造
[0058]在这些实验中，硅膜(即微板14)是使用标准微制造技术从绝缘体上的硅(silicon on insulator, SOI)晶片制造的。通过电感I禹合等离子体(inductively coupledplasma, ICP)用深反应离子蚀刻(Deep Reactive 1n etching, DRIE)工艺从 SOI 晶片(即SOI基底12)的背面产生膜，终止于包埋的氧化物层。膜的边界条件也通过DRIE从晶片顶面界定，利用包埋的氧化物层作为终止层。包埋的氧化物层最终被移除以形成边界孔。制造并测试了三种不同的微膜边界条件:两个相对的夹具式边缘和另两个自由边缘(C-F-C-F)、悬臂梁(C-F-F-F)和全部夹具式边缘(C-C-C-C)。所有膜均被设计为正方形，其边长为100 μ m、200 μ m 或 300 μ m。[0059]为了动态测试上述膜结构，使用外部驱动器来激发，使用激光振动计进行振动测定。在这些膜上进行大量的生物学实验以检验其生物传感性能。
[0060]图4为基于100 μ m正方形传感膜的集成式微系统(即生物传感平台10)的扫描电子显微镜(SEM)图像，被制造成带有分布式压阻式传感器(即传感器18)和PZT驱动器(即驱动器16)。此类微系统使得该设备能够自我传感并自我激发。这个微系统能够嵌入电子线路中以建立芯片实验室系统。
[0061]就分布式压阻式传感器的制造而言，将500nm厚的多晶硅层通过低压化学气相沉积(PCVD)而沉积在SOI晶片的氧化设备层上。该层随后通过离子束植入术用50Kev硼源进行掺杂，产生lel5的掺杂密度，以增强压阻偏转灵敏度。两个传感器的形状通过光刻术和随后的反应离子蚀刻(reactive ion etching, RIE)形成。
[0062]在PZT膜的制造中，在SOI上沉积由IOOnm厚的Pt/Ti底部电极、Iym PZT膜和IOOnm厚的Pt顶部电极组成的三明治结构。顶部和底部电极用电子束蒸发器系统通过蒸镀方法沉积，沉积的PZT以旋转形式堆积在溶胶-凝胶上，随后退火以产生所需的PZT膜。将顶部和底部电极图案化，通过离子束铣削蚀刻。蚀刻掉多余的PZT材料。
[0063]2.牛物学实骀
[0064]这些实验中所用人杂交EA.hy926细胞来自于人脐静脉内皮细胞和A549/8人肺癌细胞系的融合。EA.hy926是表达人血管内皮的特征性高度分化功能的永生化人内皮细胞系。人EA.hy926内皮细胞 系维持于30ml添加有10% FBSUOOy g/ml链霉素和100U/ml青霉素以及IOml ΗΑΤ(100 μ M次黄嘌呤，0.4μ M氨基蝶呤，16 μ M胸苷)的Dulbecoo改良Eagle培养基(DMEM)中。细胞在5% CO2和95%空气气氛的37°C培养箱中培养。细胞培养于75cm2瓶中，并在达到90%会合时传代。一旦细胞大致达到90%会合，即除去培养基并用5ml磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞。EA.hy926细胞的传代过程简言之即为，从细胞中移除细胞培养基并随后用IOml无菌PBS清洗细胞直到培养基呈无色。随后通过加入2.5ml胰蛋白酶进行3分钟标准孵育而使EA.hy926细胞脱壁。还通过用5ml新DMEM培养基反复吸打而使细胞团均匀分散。
[0065]图5显不了微膜表面上包被的内皮细胞的激光扫描测微仪(LSM)图像。内皮细胞紧紧附着于硅表面，表现出典型的铺展模式。
[0066]生物实验分为两个阶段:(I)将一定量的细胞接种于膜上，和(2)测定膜的相应动态。动态测试设备显示于图6。相同的微膜被重复使用数次，以得到一批不同细胞密度的实验结果。每个实验进行如下:
[0067]1.首先，清洗硅微膜并用冲洗(乙醇和丙酮的混合物)、高压灭菌和紫
[0068]外线照射的方法灭菌。
[0069]2.将细胞接种于微膜上之前，确定传代过程中悬液的细胞密度。取20 μ I细胞悬液并与20 μ I台盼蓝混合，以估计活细胞数量。随后通过改良的纽鲍尔血球计数器对新的混合物进行细胞计数。一旦确定了细胞密度，用培养基制备5ml已知密度的EA.Hy926细胞悬液。通过控制孵育时间，可以获得膜表面上的多种细胞密度和分布。
[0070]3.使用LSM(激光扫描显微术)图像来记录细胞在膜传感表面上的分布。细胞的密度或分布可基于该LSM图像进行定量。
[0071]4.带有附着细胞的膜的动态通过图6中的基础激发装置进行测量。将带有细胞和不带细胞的每个特定微板的FRF数据进行比较以推断细胞的信息，记录在LSM扫描图像中。
[0072]5.最后，从微膜表面移除细胞，在重复第I步的清洁步骤后，再灭菌
[0073]的微膜被用于下一个实验。
[0074]图7、8和9展示了三种不同细胞密度下三种不同类型微膜的频率响应函数。图7使用了 100 μ m的正方形C-F-F-F微膜；图8使用了 200 μ m的正方形C-F-C-F微膜；图9使用了 300 μ m的正方形C-C-C-C微膜。在每种情况下，(a)和(b)显示内皮细胞包被在微膜表面上，(c)显示根据细胞密度归一化的速度幅值。
[0075]细胞载荷引起的膜动态的最主要变化是共振频率fn的改变。第一模式形状几乎保持恒定，各个FRF的幅值用第一共振模式的幅值自身归一化。发现共振模式的相对振幅在细胞装载后显著变化。这意味着附着细胞在膜表面上的额外质量载荷也引起了振动形状的扰动。靶细胞的质量m或数量可通过检测共振频率的迁移△4来估算。式(I)表明了在假设刚度k保持恒定的前提下，动态系统的质量变化Am与频率迁移Af之间的关系。该方法已被广泛用于以微悬臂梁为基础的生物传感器。
【权利要求】
1.表征至少一个微生物细胞的特性或行为的方法，该方法包括以下步骤: 提供微板； 将所述微板的至少一个表面浸入细胞培养基中，以使至少一个待表征的微生物细胞与该微板接触； 振动该微板； 提供与所述微板偶联的彼此分隔开的多个传感器； 在振动该微板的过程中，从各个传感器获得各自的传感数据时间序列，所述微板和所述传感器排列成使得所得传感数据时间序列不彼此独立； 处理所述传感数据时间序列，以对所述至少一个微生物细胞的特性或行为进行表征。
2.权利要求1的方法，其中所述处理步骤包括: 指定细胞动态行为类别；和 处理所述传感数据时间序列，以确定所述至少一个细胞的动态行为是否属于所指定的细胞动态行为类别。
3.权利要求1的方法，其中所述处理步骤包括: 指定细胞特性；和 处理所述传感数据时间序列，以确定对所述至少一个细胞的指定特性的测量。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述处理步骤包括在一个或多个时间域、频率域和小波域中分析所述传感数据时间序列。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述处理步骤包括分析频率响应函数(FRF)。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述处理步骤包括使用神经网络和Karhunen-Loeve分解中的一种或两种。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中振动所述微板的步骤包括周期性地振动该微板。
8.权利要求1至6中任一项的方法，其中振动所述微板的步骤包括随机地振动该微板。
9.用于表征至少一个微生物细胞的特性或行为的系统，该系统包括: 用于装细胞培养基的容器； 微板，其置于所述容器中，以使得当该容器至少部分充入细胞培养基时，所述微板的至少一个表面浸入细胞培养基中； 至少一个驱动器，其用于振动所述微板； 与所述微板偶联的彼此分隔开的多个传感器，每个传感器可用于在振动微板的过程中提供各自的传感数据时间序列，所述微板和传感器排列成使得所提供的传感数据时间序列不彼此独立；和 处理器，其可用于接收来自传感器的传感数据时间序列，并处理所接收的传感数据时间序列以对与该微板接触的至少一个微生物细胞的特性或行为进行表征。
10.权利要求9的系统，其中所述微板的边界条件选自夹具式、悬臂式、自由式和点支撑式。
11.权利要求9或10的系统，其中所述传感器选自于压阻计传感器、光学传感器、应变传感器和加速度传感器。
12.权利要求9至11中任一项的系统，其中所述至少一个驱动器包括压阻式换能器。
13.权利要求9至11中任一项的系统，其中所述至少一个驱动器包括声驱动器。
14.权利要求9至13 中任一项的系统，其中所述容器为培养皿。
【文档编号】C12M3/00GK104017855SQ201410214356
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2010年6月25日 优先权日:2009年6月30日
【发明者】马向红, 伍章明, 彼得·奈杰尔·布雷特, 迈克尔·T·赖特, 海伦·R·格里菲思 申请人:阿斯顿大学