一种金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定性的唾液酸酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定性的唾液酸酶，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示或在SEQ?ID?NO.1基础上经过缺失、突变仍保持唾液酸酶功能不变的氨基酸序列所示且通过大肠杆菌表达后纯化。本发明提供的唾液酸酶具有较强的二价金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定性，对α2,3及α2,6连接形式的底物均能进行水解，对猪脑中提取的总神经节苷脂能进行生物转化，制备纯度较高的GM1，同时首次发现该酶能够通过将癌细胞表面神经节苷脂转化为GM1而抑制膀胱癌细胞的迁移，具有重要应用前景。
【专利说明】-种金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定性的唾液酸酶及 其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种唾液酸酶，特别是一种外切唾液酸酶及其在抑制肿瘤迁移中的应 用。
【背景技术】
[0002] 唾液酸（sialic acid, SA)是一类分布广泛的带负电荷的九碳糖，通过不同的连键 方式存在于糖蛋白、糖脂等糖缀合物的糖链末端。在真核生物中，糖缀合物的唾液酸化修饰 在稳定细胞膜结构、促进神经发育、信号识别等过程中具有至关重要的作用，哺乳动物细胞 糖链唾液酸化与癌症的发生和转移过程呈相关性。
[0003] 细菌外切唾液酸酶可以水解糖缀合物末端的唾液酸，已有研究报道部分细菌唾液 酸酶在生物转化神经节苷脂制备药物GM1，以及治疗脊髓损伤等方面具有应用价值。然而上 述报道中所用的菌株多为致病菌或筛选获得的非常见菌株，遗传信息不明确且不易获得、 难以培养甚至还具有危害性，另外大多数报道中酶纯化过程繁琐、底物特异性不强，为该类 酶的应用推广带来极大的限制。因此，在遗传背景明晰的非致病菌中开发新的外切唾液酸 酶显得尤为重要。
[0004] 本发明中的唾液酸酶来源于阿维链霉菌，是一种常见的工业菌种，进一步研究该 酶制备药物GM1的能力并发现该酶能通过对癌细胞表面神经节苷脂上唾液酸的水解，而抑 制癌细胞的迁移。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种新型唾液酸酶，其氨基酸序列如1)或2)所 示且通过大肠杆菌表达后纯化；
[0006] 1)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0007] 在1)的基础上经过缺失、突变仍保持生物学功能不变的氨基酸序列。
[0008] 本发明所使用的阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis)菌株编号为 ATCC31267。
[0009] 编码所述唾液酸酶的核苷酸序列也为本发明要求保护的范围。
[0010] 能表达权利要求1所述唾液酸酶的载体或用于表达所述唾液酸酶的转基因细胞 系均为本发明要求保护的范围。
[0011] 本发明要解决的另一个技术问题为所述唾液酸酶在抑制癌细胞迁移中的应用。
[0012] 使用所述唾液酸酶制备获得的对应性抗体也为本发明要求保护的范围。
[0013] 本发明涉及内容包括如下方面：
[0014] 1.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3原核表达质粒的构建；其中涉及构建质粒所设 计的neuA3基因的特异性引物、阿维链霉菌基因组的获得、pET28a(+)载体的酶切及连接、 宿主菌E. coli BL21 (DE)的感受态制备及转化；
[0015] 2.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3在E. coli BL21 (DE)中的诱导表达；其中涉及 诱导表达的温度、时间、IPTG浓度及摇床转速；
[0016] 3.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3的分离纯化；其中涉及宿主菌超生破碎的条 件、镍柱纯化的条件、酶液的透析条件；
[0017] 4.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3酶学性质分析；其中涉及该酶反应的最适温 度、最适盐离子浓度、最适反应时间、最适pH、二价离子耐受性、热稳定性、酸稳定性以及底 物特异性；
[0018] 5.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3转化总神经节苷脂制备药物GM1的应用；其中 涉及猪脑中总神经节苷脂的提取、酶的生物转化体系、转化后产物的脱盐处理及高效薄层 色谱（HPTLC);
[0019] 6.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3抑制癌细胞迁移能力的研究；其中涉及膀胱癌 细胞YTS-1的培养、酶液对细胞的处理、划痕实验及胶体金实验。
[0020] 本发明提供的唾液酸酶具有较强的二价金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定性， 对α 2, 3及α 2, 6连接形式的底物均能进行水解，对猪脑中提取的总神经节苷脂能进行生 物转化，制备纯度较高的GM1，同时首次发现该酶能够通过将癌细胞表面神经节苷脂转化为 GM1而抑制膀胱癌细胞的迁移。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为唾液酸酶诱导表达及分离纯化后的SDS-PAGE图；
[0022] 图2为NeuA3最适反应条件；
[0023] 图3为NeuA3离子耐受性、热稳定性及pH稳定性；
[0024] 图4为NeuA3生物转化猪脑中提取的总神经节苷脂制备GM1的HPTLC ;
[0025] 图5为NeuA3处理膀胱癌细胞YTS-1后细胞迁移能力变化；
[0026] 图6为NeuA3处理YTS-1后细胞表面GM1分布的免疫荧光照片。
【具体实施方式】
[0027] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029] 实施例1 :唾液酸酶的获得
[0030] 1、克隆与表达
[0031] neuA3 基因的序列信息通过网站 http://avermitilis. Is. kitasato-u. ac. jp/ 获 得，并通过SignalP4. lServer网站对该酶的信号肽情况进行预测，结果显示该酶为不含有 信号肽的胞内酶，大小约为38kDa的小唾液酸酶。在neuA3基因的编码区进行引物设计，由 公司合成如下引物：neuA3-S:GGAATTCCATATGGCGATGACAGAAGCCAGTACAC (下划线处为 EcoRI 的酶切位点）和 neuA3-AS:CCCAAGCTTCAGTAGAGGTCATGGGGTGA(下划线处为 Hindlll 的酶切 位点），以上述提取的阿维链霉菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增条件如下：95°C lOmin， 96°C lmin，65°C 45s，72°C lmin30s 重复 34 个循环，72°C lOmin。PCR 扩增产物通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离，并采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，获得neuA3基因片段。
[0032] neuA3基因片段与载体质粒pET28a(+)分别经过EcoRI和Hindlll酶切后16°C连 接过夜，连接产物转化E. coli JM109,挑取卡那霉素抗性的转化子提取质粒进行酶切验证 和测序验证，获得构建正确的neuA3表达质粒。
[0033] 利用E. co 1 i BL21 (DE3)和pET28a⑴表达系统，将含有构建好表达质粒的宿 主菌接种于少量含有卡那霉素的LB液体培养基中，37°C过夜振荡培养。第二天以1 %接 种量接入含卡那霉素的大体积LB液体培养基中，37°C振荡培养。当0D_达到0. 3-0. 6 时，取出部分菌液作为蛋白表达的负对照。在剩余菌液中加入〇.〇5mM的IPTG后在16°C 培养 8h，离心收集，重悬于 Lysis Buffer(NaH2P0450mM，NaC1300mM，ImidazolelOmM)中， 超声波破碎后离心取上清备用，沉淀用Lysis Buffer悬浮。加适量5XSample Loading Buffer[pH6. 8Tris-HC1250mM，SDS10% (W/V)，BPBO. 5% (W/V)，甘油 50%，使用前加入 5% β -巯基乙醇]，沸水中煮5min，迅速插在冰上。SDS-PAGE凝胶电泳检测目标蛋白表达情况。
[0034] 2、唾液酸酶的纯化
[0035] (1)以合适条件扩大培养菌体并诱导蛋白表达，离心收集菌体悬于Lysis Buffer 中，超声破碎后离心得到上清。根据His标签与Ni+能相互吸附的原理，在上清中加入50% Ni-NTA(Roche)，在4°C缓慢摇晃60min，使表达产物与Ni-NTA充分结合；
[0036] ⑵将混合物转移到层析柱上，收集流出的液体，标记为FT ;
[0037] (3)用 Wash Buffer(NaH2P0450mM，NaC1300mM，Imidazole20-100mM)洗涤，收集流 出的液体，标记为W1、W2、W3、W4......；
[0038] (4)用少量 Elution Buffer (NaH2P0450mM, NaC1300mM, Imidazole500mM)洗脱，收 集流出的液体，标记为E1、E2、E3、E4……。
[0039] 以上收集起来的液体进行SDS-PAGE电泳（图1)。纯化后的蛋白经过透析以去除 其中的Imidazole和盐离子，再通过冷冻干燥获得酶粉。唾液酸酶的氨基酸序列如其氨基 酸序列如1)或2)所示，
[0040] 1)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0041] 在1)的基础上经过缺失、突变仍保持生物学功能不变的氨基酸序列。
[0042] 实施例2新型唾液酸酶的酶学性质研究
[0043] 将酶液稀释到0. lmg/mL，以Neu5Ac的衍生物4-MU-Neu5Ac为底物，在反应体系中 加入10 μ L该浓度的酶液，10 μ LlmM的底物4-MU-Neu5Ac，及80 μ L反应缓冲液，反应一定 时间之后加入100 μ L终止缓冲液（甘氨酸0· 133Μ，NaClO. 06Μ，Na2C030 . 08 3Μ，ρΗ10· 7)终止 酶解反应获得游离的4-MU，由于游离的4-MU在365nm的激发波长下可产生450nm的荧光， 而非游离的4-MU-Neu5Ac在这个激发波长只产生微弱的荧光信号，因此可通过荧光酶标仪 收集游离4-MU的荧光信号，并根据荧光信号与4-MU浓度关系的标准曲线即可计算酶活。1 个酶活单位的定义为：1分钟内水解底物释放出lnm 〇14-MU时所用的酶量。确定该酶在pH =5的含300mM NaAc的反应缓冲液中40°C反应具有最适的酶活（图2)，同时发现该酶能耐 受大多数二价金属离子并在铜离子存在的情况下表现出更高的酶活。该酶的另一个优点是 温度和pH耐受性好，长时间暴露在其反应温度和弱酸性的条件下酶活几乎不会发生明显 损失（图3)。
[0044]
【权利要求】
1. 一种金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定性的唾液酸酶，其特征在于氨基酸序列如 1)或2)所示且通过大肠杆菌表达后纯化； 1)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示； MTEASTPFRGGREGYASYRIPAVVATGVGTLLAFCEGRVDSAHDHGNIDIVLKRS⑶GGRTWGPLQAVAKNG DNLAGNPAPVVLDTGRVLLVHVRSAAGASEDAILRGKVKAADGRRVWVQHSDDDGLTWSGPREITGQVRKANWRWYA TTPGHALQLTTGRVVVPGNHTVPPTGTDNGTEAKYNSGHCLLSDDRGASWYLGYLDENTNGYINVNETTATELPDGR VYFNTRNDSPSPGNRADAYSKDGGKTLVKPFRPQAGLTTPVVQGSVLQLRDPDLLLYSGPADPAFRALMTVRASADG GTTWRTAHPLDGLPAAYSDLVRVDQDTVGLLYETCDFGAYETITFRRIPVTALT ; 在1)的基础上经过缺失、突变仍保持唾液酸酶功能不变的氨基酸序列。
2. 权利要求1所述的唾液酸酶，其特征在于所述大肠杆菌为E. coli BL21 (DE)。
3. 编码权利要求1所述唾液酸酶的核苷酸序列。
4. 能表达权利要求1所述唾液酸酶的载体。
5. 能表达权利要求1所述唾液酸酶的转基因细胞系。
6. 权利要求1所述唾液酸酶在抑制癌细胞迁移中的应用。
7. 应用权利要求1所述唾液酸酶制备获得的对应性抗体。
8. -种制备获得SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列唾液酸酶的方法，其特征在于包括如下 步骤：通过特异性引物扩增获得唾液酸酶基因；将获得的基因克隆到pET28a(+)载体；将获 得的重组载体转化宿主菌E. coli BL21 (DE);对获得的E. coli BL21 (DE)工程菌进行发酵诱 导表达唾液酸酶。
9. 权利要求8所述的方法，其特征在于引物序列如下：neuA3-S:GGAATTCCATATGGCGATG ACAGAAGCCAGTACAC ;neuA3-AS:CCCAAGCTTCAGTAGAGGTCATGGGGTGA。
10. 权利要求9所述的方法，其特征在于所述发酵诱导条件为：将构建好的 E. coliBL21 (DE)工程菌接种于少量含有卡那霉素的LB液体培养基中，37°C过夜振荡培养； 第二天以1%接种量接入含卡那霉素的大体积LB液体培养基中，37°C振荡培养；当0D600 达到0. 3-0. 6时，取出部分菌液作为蛋白表达的负对照；在剩余菌液中加入0. 05mM的IPTG 后在16°C培养8h，离心收集。
【文档编号】C12N9/24GK104046603SQ201410217540
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】关锋, 郭佳, 王宜成, 杨刚龙, 宋波 申请人:江南大学