一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器的制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，通过输液管依次将反应室、储液罐和蠕动泵连接；反应室包括侧壁、底壁、截流装置、溢流插板、筛网架、静压槽、泄流槽、引流槽等构成的盒体和盖体，截流装置为闸门或堰流坝并且沿其纵向截面同一水平上开设有若干均匀排列的透水孔，静压槽侧壁设有与引流槽相配合的溢流口,筛网架固定在盒体的两侧壁上。本发明还涉及一种层叠结构的生物反应器。本发明解决了现有灌注式培养中存在的流场不均一、营养传递不均匀容易造成细胞死亡的问题，适合组织细胞的三维培养，能够提高组织工程产品的质量，本反应器具有扩展性好、通用性强、适用范围广的特点。
【专利说明】—种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养装置领域，涉及一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，尤其是多种组织器官共培养的生物反应器。
【背景技术】
[0002]通常情况下已构建好的工程化组织(或称三维构建物)需要在体外进行一段时间的培养，使其成熟后才能移植或供研究用，而目前最常用的培养模式是采用培养板进行定期换液的静态培养法，即先移去旧培养液再添加新培养液，然后放入培养箱中予以静置培养，其优点是适合小批量的培养，换液周期可随组织、细胞的不同而采取相应的策略。但其缺点显而易见:一是营养液的消耗呈进行性下降，而代谢产物不断增加，会对细胞造成一些生理性损伤；二是依靠弥散方式提供营养，存在营养供应受限的显著缺点，甚至导致工程化组织内部的细胞得不到营养而死亡；三是周期性换液使营养成分呈周期性波动，不利于细胞的均匀生长。
[0003]在体内，丰富的毛细血管网构架起一个有效的传质通道，为细胞提供充足的氧和营养物。因此体外培养时为了保证营养物的供应，须建立培养液有效循环的方法，目前有以下几个策略:滚瓶培养、旋转培养和灌注式培养，其中灌注式培养的优点尤为显著，一方面，由于培养液连续地流经三维构建物内部或周围，能够克服营养物质传递受限的缺点，即使构建物厚度超过500 μ m也能得到可靠的营养供应；另一方面，灌注培养时的液流能够产生一定的剪切力，提 供适当的机械刺激，有利于构建物的发育和成熟。Kalyanaraman等(Kalyanaraman BM, Dorothy MS, Steven TB.Medium Flow Rate Regulates Viability andBarrier Function of Engineered Skin Substitutes in Perfusion Culture.Tis Eng:Part A.2008, 14(5):583-93)已设计了一种生物反应室，进、出水口管是从培养室的底面两侧分别接入培养室，通过设置出液管的高度来控制培养室液面的高度，即培养室液面高于出水管后液体将溢进管子而流出，通过对构建的组织工程皮肤进行熟化培养，结果表明在灌注速度为5ml / min或15ml / min培养条件下,组织学结构好于静态培养,其中,通过细胞活力检测结果表明，在5ml / min的灌注速度下的细胞活力明显好于静态培养下的细胞活力；采用BrdU掺入法检测细胞的增生情况也表明，在灌注速度5ml / min或15ml /min时的细胞增生情况明显好于静态培养下的细胞增生情况。对比还发现灌注速度50ml /min时只显示少量细胞增生，实验研究证明了低流速能够增加细胞活力和维持表皮的屏障，适合于移植，而高流速产生高的剪切力则可导致细胞的变性坏死。
[0004]尽管现有的灌注式培养装置简单地实现了液体的循环，但却没有考虑流场的整体情况，一方面，因培养液在循环过程中流速不稳定，变化频繁，无法保证在流经待培植组织工程产品时处于低流速的均匀流场，对细胞增生不利；另一方面，处于边缘的培养液不易流动，培养装置内流场不均一，营养传递不均，容易造成细胞生长不均匀；况且，在流速不均的情况下液体对细胞所施加的剪切力大小不同，流速快时剪切力过大而使细胞易受到损伤，流速过低(接近静止)时又不利于细胞增生。本发明人在第三军医大学学报第35卷第7期《基于准静态平面流场的新型皮肤组织工程灌注式生物反应室设计与初步模拟》中公开了一种灌注式生物反应器，包括培养基瓶、蠕动泵、无菌硅胶管、缓冲槽、溢流坝、培养室和泄流沟。该生物反应器是培养液通过溢流的方式来实现准静态平面流场，培养液进入缓冲槽，经高溢流坝溢流进入培养室，从而在培养中对组织细胞进行供养，然后培养液经低溢流坝溢出至泄流沟，最后培养液进入到下一层反应器缓冲槽中。利用这种生物反应器，由于培养液存在表面张力，流入缓冲槽的流速不恒定和不均匀所造成的压头不稳定，加之高溢流坝的泄流斜面不可能处于绝对平整，所以培养液在缓冲槽积蓄势能后流经高溢流坝的泄流斜面时，形成一股或几股不均匀的流液，更有甚者，在较低流速下泄流斜面的某些区域形成了断流以致培养基在进入培养段流场时出现了不均匀的流场，造成某些区域的细胞得不到或得到很少的营养物质以及不能及时排除代谢产物而出现损伤或者死亡；而且现有的筛网大多固定在反应室的底壁上，必定需要一定的支架用来固定筛网，由此就会造成在流场方向上，固定筛网架的支柱后侧不能形成均匀的流场也会对部分培养区域造成一定的影响。
[0005]由此可见，在灌注式培养中，使流经待培育组织细胞的液体流场均匀，流速始终保持在低流速，对提高组织工程产品质量、缩短培植时间、提高培育效率至关重要。
【发明内容】
[0006]针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种适用于三维组织细胞培养的生物反应器，该生物反应器能够实现平面流场的培养液流速合适，流场均匀稳定；本发明还提供了一种结构紧凑、扩展性好、更加优化的层叠生物反应器。
[0007]为了解决上述技术问题，适用于三维组织细胞培养的生物反应器，包括储液罐、蠕动泵和至少一个包括顶部敞口的长方体盒体和盖体组成的反应室；盒体一端固定一截流装置，与盒体构成静压槽，另一端固定一溢流插板，与盒体构成泄流槽，静压槽和泄流槽之间固定有与截流装置和溢流插板均不接触的筛网架；筛网架固定在盒体上，筛网固定在筛网架当中；截流装置与溢流插板之间形成反应区域；反应室上设置一与静压槽连通并能将液体直接注入静压槽的进液孔，在盒体的壁上设置一与泄流槽连通并能将液体直接排出泄流槽的出液孔；截流装置沿纵向截面同一水平上开设有若干均匀排列的能将静压槽内的液体匀速均匀引入反应区域的透水孔；静压槽的侧壁上设置有溢流口，在盒体的侧壁上设置有能将静压槽经溢流口溢出的多余液体通过进流口排入泄流槽的引流槽；截流装置等于或低于盒体的深度，筛网架低于截流装置的高度，溢流插板高于或等于筛网架上筛网的高度，溢流口的下缘低于截流装置的上表面的高度并高于溢流插板上表面、进流口和透水孔上缘的高度，以在静压槽、反应区域和泄流槽中形成阶梯状的差位液面；输液管将储液罐、蠕动泵依次连接在出液孔与进液孔之间。
[0008]本发明中筛网架固定在盒体的两侧壁上，截流装置、溢流插板和筛网架分别与盒体通过卡合连接，截流装置、溢流插板与盒体接触的面上以及筛网架与盒体侧壁接触的面上设有台阶状的卡子，盒体的侧壁与底壁上设置有与卡子相卡合的卡合凹槽。通过卡合连接方便反应室的拆卸与清洗，而且将筛网架固定在盒体的侧壁上与以前的筛网架固定在底壁上相比，减少了筛网架支架对反应区域内培养液的阻挡，形成了均匀的流场。 [0009]优选的本发明中的溢流口包括U型槽以及在静压槽内U型槽旁设置的能通过定位轴转动盖合U型槽并能通过调节U型槽下缘高度来调节静压槽内液面高度的挡片。通过设置溢流口，能够方便的调节静压槽内液面的高度以控制培养液均匀地流过截流装置的透水孔。
[0010] 本发明中透水孔为若干个均匀排列的相同的条形孔、圆形孔、半圆形孔或异形孔。通过设置均匀排列的透水孔，可以实现培养基进入反应区域时形成均匀的流道，以实现均匀的流场。
[0011]本发明中，筛网的网平面上设置有与筛网架的支架等高的规格模具，规格模具可以为方形、圆形、三角形或异形结构。
[0012]本发明中优选的溢流插板高出筛网架上筛网高度为O~4mm。通过设置略高于筛网高度的溢流插板，可以使培养液与筛网上的培养物形成良好的接触。
[0013]本发明的改进方案中，截流装置为带有透水孔的闸门，透水孔位于闸门的中下部。
[0014]本发明的另一改进方案中，截流装置为带有泄流斜面的堰流坝，堰流坝包括上坝体和下坝体，下坝体与筛网架相邻的一侧具有泄流斜面，透水孔位于该堰流坝的上坝体，该泄流斜面与盒体底面呈15°~25。夹角，泄流斜面的高度为堰流坝高度的1/3~1/2。
[0015]通过上述两种改进的截流装置，与现有的截流装置相比，培养液通过透水孔时不仅能够产生匀速均匀的流场，而且拆卸、清洗更加方便。
[0016]本发明的另一种改进方案是提供了一种能够批量生产的层叠盒体，该层叠盒体是通过盒体相互反向嵌合在一起构成。
[0017]本发明中盒体的侧壁的上表面的外侧设有台阶状的凸缘，盒体的底壁的四周设有与侧壁上表面的凸缘相嵌合的对象嵌合凹槽。多个盒体通过嵌合对接构成盒体的层叠盒体，盖体盖合在层叠盒体的顶部盒体上，盖体与上部的盒体构成反应室，上部的盒体的底壁与相邻下部的盒体共同组成一个反应室；层叠盒体中上部盒体的出液孔通过输液管与下部盒体的进液孔连接，层叠盒体底部的盒体的出液孔通过输液管、储液罐、蠕动泵与顶部的反应室的进液孔相连接；层叠盒体与盖体、输液管、储液罐、蠕动泵共同组成层叠生物反应器。
[0018]优选的上述改进方案中层叠盒体中的上部的盒体的出液孔设置在泄流槽的底壁上，并与其相邻嵌合的下部的盒体的静压槽相连通，构成了下部盒体的进液孔，以便液体从层叠盒体的上部盒体直接流入下部盒体的静压槽当中。通过开设在底壁上的出液孔，简化了层叠生物反应器的结构。
[0019]优选的层叠盒体中的盒体的数目为2到20个；
上述层叠生物反应器还可以在层叠盒体的外部设有由箱体和箱盖组成并带有与顶部盒体静压槽和底部盒体出液孔相配合的能使输液管通过的孔道的无菌反应箱，层叠盒体位于箱体中，储液罐和蠕动泵位于反应箱外。通过设置反应箱，可以使层叠生物反应器在无菌密闭的环境下进行反应。
[0020]上述外部带有反应箱的生物反应器还可以在反应箱外围设有循环水套，储液罐和蠕动泵位于循环水套外。以便生物反应器内部处于恒温状态。
[0021 ] 在上述技术方案中，当向静压槽内注入培养液，培养液在静压槽内积蓄，调节溢流口的高度，多余液体从溢流口溢出，保证静压槽内形成稳定压力后随截流装置上的透水孔缓慢地流入筛网架底部，而且流场中没有了筛网架支架的阻挡，使反应盒体中部形成均匀的稳态平面流场，进行均匀的营养扩散；由于培养液是从静压槽内形成稳定压力后自然浸流入筛网架底部的，故流入筛网架底部的培养液始终保持在较低的均匀稳定流速，该流速能够为筛网架上的拟培养或生产的三维组织器官或组织工程产品提供均匀一致的剪切力，有利于细胞增生和组织发育。
[0022]本发明是一种适用于三维组织器官、细胞或组织工程产品灌注培养的生物反应器，尤其适用于对组织工程皮肤或其他膜状组织如角膜、心瓣膜以及多种组织器官、细胞进行灌注培养包括共培养。其工作原理为:先将拟培养或生产的三维组织器官或组织工程产品的原料溶液注入筛网架上，在筛网架上放入规格模具制成特定形状的规格，取出规格模具，盖上盖体；然后向静压槽内注入培养液，培养液在静压槽内积蓄，多余液体从溢流口溢出，保证静压槽内形成稳定压力后经截流装置上的透水孔流向筛网架，使反应盒体中部形成均匀的稳态平面流场，筛网架上的拟培养或生产的三维组织器官或组织工程产品恰好被流动的营养液浸没，也可适当降低液面使筛网架上待培养的三维组织始终处于气液界面培养状态，为拟研究或生产的三维组织器官或组织工程产品提供充足的营养和适宜的剪切力，当反应盒体中部的液面蓄水高度高于溢流插板高度时，培养液经溢流插板顶部流入泄流槽，进而从出液孔流入储液罐内，通过蠕动泵再将液体泵入静压槽内，实现封闭式的循环培养。
[0023]由于以上结构，本发明具有以下优点:1.通过设置溢流口和带有能将静压槽内的液体匀速均匀引入反应区域的透水孔的截流装置，培养液流过透水孔时，容易突破自身的张力形成均匀的流道，使培养液在流经筛网架时始终保持较低的稳定的均匀流速，反应盒体反应区域内形成稳定均匀的平面流场，有利于细胞增生；2、本发明的生物反应器可以单个独立使用，也可以多个串联或层叠使用，具有良好的扩展性，既能维持三维组织器官的生物学特性，保证了三维组织器官或产品的质量，又提高了基础研究或生产的效率；3.本发明的截流装置、规格模具、筛网架和溢流插板可根据实际需要拆取更换，不仅适合组织工程皮肤的培养，也适合膜状材料如角膜、心瓣膜、神经、血管、肠系膜，或其它组织器官等的培养，而且可同时培养不同类型的组织器官，拆除筛网架后还可用于培养贴壁生长的种子细胞，具有通用性强、适 用范围广的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明反应室的立体示意图；
图2是本发明盒体体壁的立体示意图；
图3是本发明生物反应器的结构示意图；
图4是本发明中闸门的立体示意图；
图5是本发明中堰流坝的立体示意图；
图6是本发明中筛网及筛网架的立体示意图；
图7是本发明层叠生物反应器的结构示意图；
图8是本发明实施例二的结构不意图；
图9是本发明流场的示意图；
图中:1、盒体；2、盖体；3、截流装置；4、闸门；5、堰流坝；6、透水孔；7、静压槽；8、溢流插板；9、泄流槽；10、上坝体；11、下坝体；12、泄流斜面；13、溢流口 ；14、定位轴；15、挡片；16、引流槽；17、进流口 ； 18进液孔；19、出液孔；20、筛网架；21、筛网；22、规格模具；23卡子；24、卡合凹槽；25、凸缘；26、嵌合凹槽；27、输液管；28、储液罐；29、蠕动泵；30、层叠盒体；31、箱体；32、箱盖；33、循环水套；34、孔道。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图对本发明做进一步说明。
[0026]实施例一: 参见图1、图2、图3、图4、图6、图9，本发明一种适用于组织细胞三维灌注培养的生物反应器，包括储液罐28、蠕动泵29和至少一个包括顶部敞口的长方体盒体I和盖体2组成的反应室；盒体I 一端固定一截流装置3，与盒体I构成静压槽7，另一端固定一溢流插板8，与盒体I构成泄流槽9，静压槽7和泄流槽9之间固定有与截流装置3和溢流插板8均不接触的筛网架20 ;筛网架20卡和在盒体I的两侧壁上，筛网21固定在筛网架20当中；截流装置3沿纵向截面同一水平上开设有若干均匀排列的能将静压槽7内的液体匀速均匀引入反应区域的透水孔6，透水孔6为若干个均匀排列的条形孔、圆形孔、半圆形孔或异形孔；静压槽7与盒体I共用的侧壁上设置有溢流口 13，溢流口 13包括U型槽以及在静压槽7内设置的能通过定位轴14转动盖合U型槽并能调节U型槽高度和大小的挡片15，在盒体I的侧壁上设置有能将静压槽7经溢流口 13溢出的多余液体通过进流口 17排入泄流槽9的引流槽16 ;反应室上设置一与静压槽7连通并能将液体直接注入静压槽7的进液孔18，在盒体I的壁上设置一与泄流槽9连通并能将液体直接排出泄流槽9的出液孔19 ;截流装置3等于或低于盒体I的深度，筛网架20低于截流装置3的高度，溢流插板8高于或等于筛网架20上筛网21的高度，溢流口 13的下缘低于截流装置3的上表面的高度并高于溢流插板8上表面、进流口 17和透水孔6上缘的高度；输液管27将储液罐28、蠕动泵29依次连接在出液孔19与进液孔18之间。
[0027]如图2、图3所示，本实施例中的截流装置3为闸门4，蠕动泵29将储液罐28中的培养液泵向静压槽7内的过程中，注入高于透水孔6高度的培养液，多余液体从溢流口 13溢出，通过溢流槽、进流口 17流入泄流槽9中，培养液通过闸门4上的透水孔6，并缓慢地流入筛网架20底部，使盒体I中部形成均匀的平面流场(参见图9)，进行均匀的营养扩散，并使筛网21上的拟生产组织工程产品受到均匀一致的剪切力，避免因培养液营养扩散不均匀或剪切力过高而造成的细胞死亡。
[0028]为使本发明适用范围更广、拆装清洗更便捷，盒体I侧壁和底壁上具有卡合凹槽
24,闸门4、筛网架20和溢流插板8上具有能够插入所述卡合凹槽24内卡合固定的卡子23,闸门4、筛网架20和溢流插板8可分离的固定在盒体I上。溢流插板8高于筛网架20上筛网21为O~4_，通过更换溢流插板8可以调节盒体I中部的液面高度，不仅能够为组织工程皮肤提供气液界面培养环境，而且也可为膜状材料如角膜、心瓣膜、神经、血管、肠系膜等提供浸没培养环境，通过更换闸门4、筛网架20、溢流插板8以及滑动溢流口 13旁的挡片15，可调节流场的剪切力大小及液面高度，用于其它三维组织器官如肝、肾、肺、骨、软骨等组织及细胞如干细胞、癌细胞的培养，而且在移除筛网架20时，还可用于培养贴壁生长的种子细胞。
[0029]所述筛网架20可为一整体，也可为多个相互独立的筛网架20，相隔一定的间距排列。所述规格模具22卡合在筛网架20的筛网21上并与筛网架20的支架等高，规格模具22根据产品品种需求可以设计为方形、圆形、三角形或异形结构。[0030](I)将拟研究三维构建物或拟生产组织工程产品的原料溶液注入筛网架20上，在筛网21上放入规格模具22制成特定形状的规格，取出规格模具22，盖上盖体2 ;然后以400ml/min的高灌注速度向静压槽7内灌注培养液，当培养液的液面高度积蓄到一定程度时，滑动溢流口 13的挡片15以调节溢流口 13高度及大小，使培养液有少量液体刚要从溢流口 13溢出，产生稳定的静压，培养液从闸门4下透水孔6流向筛网架20 ;实验对比表明，在该400ml/min的低流速条件下，每天灌注2次，每次半小时，培养10天，细胞增生是静态培养条件下相同天数细胞增生的2.37倍，可缩短组织工程皮肤培育时间5天。
[0031](2)将拟研究三维构建物或拟生产组织工程产品的原料溶液注入筛网架20上，在筛网21上放入规格模具22制成特定形状的规格，取出规格模具22，盖上盖体2 ;然后以200ml/min的中等灌注速度向静压槽7内灌注培养液，当培养液的液面高度积蓄到一定程度时，滑动溢流口 13的挡片15以调节溢流口 13高度及大小，使培养液有少量液体刚要从溢流口 13溢出，产生稳定的静压，培养液从闸门4下透水孔6流向筛网架20 ;实验对比表明，在该200ml/min的低流速条件下，每天灌注2次，每次半小时，培养10天，细胞增生是静态培养条件下相同天数细胞增生的2.48倍，可缩短组织工程皮肤培育时间5天。
[0032](3)将拟研究三维构建物或拟生产组织工程产品的原料溶液注入筛网架20上，在筛网21上放入规格模具22制成特定形状的规格，取出规格模具22，盖上盖体2 ;然后以lOOml/min的低灌注速度向静压槽7内灌注培养液，当培养液的液面高度积蓄到一定程度时，滑动溢流口 13的挡片15以调节溢流口 13高度及大小，使培养液有少量液体刚要从溢流口 13溢出，产生稳定的静压，培养液从闸门4下透水孔6流向筛网架20 ;实验对比表明，在该lOOml/min的 低流速条件下，每天灌注2次，每次半小时，培养10天，细胞增生是静态培养条件下相同天数细胞增生的2.75倍，缩短组织工程产品培植时间5天。
[0033]实施例二:
如图1、图2、图3、图5、图6、图9所示，上述实施例一中，闸门4的功能也可以通过堰流坝5实现，所述堰流坝5包括上坝体10和下坝体11，下坝体11与筛网架20相邻的一侧具有泄流斜面12，透水孔位于该堰流坝的上坝体10，该泄流斜面12与盒体底面呈15°~
25。夹角，泄流斜面12的高度为堰流坝高度的1/3~1/2。因泄流斜面12具有一定高度，为避免流经泄流斜面12的培养液对筛网架20造成过大冲击，可调整泄流斜面12的高度控制流向筛网架20的液体流速处于低流速状态。
[0034]实施例三:
参见图1、图3、图7，第一个实施例或第二个实施例中的生物反应器的盒体I的侧壁的上表面的外侧设有台阶状的凸缘25，盒体I的底壁的四周设有与侧壁上表面的凸缘25相嵌合的对象嵌合凹槽26。多个盒体I通过反向嵌合对接构成层叠盒体30,盖体2盖合在顶部的盒体I上；相邻的层叠盒体30上部的盒体I的底壁与下部的盒体I构成反应室,顶部的盒体I与盖体2构成反应室；其中盒体I的出液孔19位于盒体I的底壁上，开设在盒体I底壁上的出液孔19构成了下部盒体I的进液孔18并能将上部盒体I的泄流槽9中的液体直接输入下部盒体I的静压槽7当中，顶部盒体I的进液孔18位于其反应室上，并通过蠕动泵29将底部盒体I出液孔19排出的液体直接泵入到顶部盒体I的静压槽7当中；层叠盒体30中的盒体I的数目可以是2到20个，层叠盒体30与盖体2、输液管27、储液罐28、蠕动泵29共同构成层叠生物反应器。[0035]使用时，培养液自顶部盒体I的静压槽7流经截流装置3、筛网架20、溢流插板8后流入泄流槽9，多余液体从溢流口 13经引流槽16流入泄流槽9，然后通过出液孔19直接注入下层盒体I的静压槽7，再从底部的盒体I的出液孔19流入储液罐28，再经蠕动泵29将储液罐28中的培养液泵入到顶部盒体I的静压槽7中，来实现培养液的封闭式循环。其中，安装在中部的盒体I的数量可根据需要增加或减少。如此循环流动，所有流经盒体I的中部的液体流速始终处于低流速状态，使筛网架20上的拟生产组织工程产品或拟培养的三维组织器官都能得到充足的营养和适宜的剪切力，保证了产品质量。
[0036]本实施方式中的层叠盒体30中的盒体I也可使用如图1、图3当中的盒体1，使用时层叠盒体30上部的盒体I的出液孔19和相邻下部盒体I的进液孔18也可通过输液管27连接。
[0037]实施例四:
附图8是将实施例三中的层叠盒体30放入无菌反应箱中，反应箱由箱体31和箱盖32组成，反应箱上开设有与层叠盒体30顶部盒体I的进液孔18和底部盒体I的出液孔19相配合的能使输液管27通过的孔道34，层叠盒体30位于箱体31中，储液罐28和蠕动泵29位于箱体31外。
[0038]在反应箱外围还可以设一循环水套33，储液罐28和蠕动泵29位于循环水套33外。使用时，反应箱可使层叠盒体30处于无菌环境下，循环水套可以使层叠盒体处于恒温状态，培养液在反应箱内外循环流动，流经盒体I的中部的液体流速始终处于低流速状态，为反应箱内的拟生产组织工程产品或拟培养的三维组织器官提供了充足的营养和适宜的剪切力。在反应箱外面设置的循环水套33，保障了反应箱内处于恒温的反应状态。
[0039]本发明通过设置闸门4或堰流坝5，与溢流口 13相配合，无论在何种灌注速度下，都能使培养液在静压槽7内形成稳定的压力，流经筛网架20时始终保持较低流速，盒体I中部形成均匀的稳态平面流场，克服了现有灌注式培养中存在的流场不均一、营养传递不均匀容易造成细胞坏死的问题，提高了产品质量、缩短了培育时间；还可用于三维构建物或组织器官的共培养研究和药物筛选。本发明还具有扩展性好、通用性强、适用范围广的特点，实现了对组织工程产品的标准化培养，大幅降低了劳动强度，提高了生产效率，具有很好的推广和应用价值。
[0040]显然，上述描述的所有实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范畴。
【权利要求】
1.一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，包括储液罐(28)、蠕动泵(29)以及盖体(2)和至少一个顶部敞口的长方体盒体(1)组成的反应室；所述盒体(1) 一端设置有截流装置(3)，与盒体(1)构成静压槽(7)，另一端设置有溢流插板(8)，与盒体(1)构成泄流槽(9)，静压槽(7)和泄流槽(9)之间设置有与截流装置(3)和溢流插板(8)均不接触的筛网架(20);所述反应室上设置有与静压槽(7)连通并能将液体直接注入静压槽(7)的进液孔(18 )，在盒体(1)的壁上设置有与泄流槽(9 )连通并能将液体直接排出泄流槽(9 )的出液孔(19);所述截流装置(3)的高度等于或低于盒体(1)的深度，筛网架(20)的高度低于截流装置(3)的高度，溢流插板(8)的高度高于或等于筛网架(20)上筛网(21)的高度；所述反应室的出液孔(19 )、进液孔(18 )、储液罐(28 )与蠕动泵(29 )通过输液管(27 )依次连接；其特征在于:所述静压槽(7)的侧壁上设置有能够调节静压槽(7)内液面高度以形成稳定静压的溢流口(13)，在盒体(1)的侧壁上设置有能将静压槽(7)经溢流口(13)溢出的多余液体通过进流口(17)排入泄流槽(9)的引流槽(16);所述截流装置(3)沿纵向截面同一水平上开设有若干均匀排列的能将静压槽(7)内的液体匀速均匀引入反应区域的透水孔(6);调节进液孔(18)中液体的流速与溢流口(13)的高度与大小以在静压槽(7)、反应区域和泄流槽(9)中形成阶梯状的差位液面。
2.根据权利要求1所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述筛网架(20)固定在盒体(1)的两侧壁上；所述截流装置(3)、溢流插板(8)与盒体(I)接触的面上以及筛网架(20)与盒体(1)侧壁接触的面上设有卡子(23)，盒体(1)的侧壁与底壁上设置有与卡子(23)相卡合的卡合凹槽(24)。
3.根据权利要求1所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述溢流口(13)包括U型槽以及在静压槽内U型槽旁设置的能通过定位轴(14)转动盖合U型槽并能通过调节U型槽下缘高度来调节静压槽(7)内液面高度的挡片(15)。
4.根据权利要求 1所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述透水孔(6)为相同的条形孔、圆形孔、半圆形孔或其他异形孔。
5.根据权利要求1所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述溢流插板(8)的高度高于筛网架(20)上的筛网(21)的高度为O~4mm。
6.根据权利要求1所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述截流装置(3)为长方体的闸门(4)，透水孔(6)位于闸门(4)的中下部。
7.根据权利要求1所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述截流装置(3)为包括上坝体(10)与下坝体(11)的堰流坝(5)，堰流坝(5)在静压槽(7)—侧为长方体，下坝体(11)与筛网架(20)相邻一侧为与堰流坝(5)底面齐平的泄流斜面(12);所述泄流斜面(12)与盒体(1)底面呈15°~25°夹角，泄流斜面(12)的高度为堰流坝(5)高度的1/3~1/2 ;所述透水孔(6)位于上坝体(10)上。
8.根据权利要求1所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述筛网(21)上设置有细胞附着的规格模具(22)，规格模具(22)为方形、圆形、三角形或异形结构。
9.根据权利要求1至8任一项所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:多个盒体(1)通过反向层叠对接固定构成层叠盒体(30)，盖体(2)盖合在顶部的盒体(1)上并与顶部盒体(1)构成顶部反应室，层叠盒体(30)的相邻盒体(1)的出液孔(19)与进液孔(18)相连，储液罐(28)和蠕动泵(29)通过输液管(27)连接在层叠盒体(30 )底部盒体(1)的出液孔(19 )和顶部反应室的进液孔(18 )之间。
10.根据权利要求9任一项所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述层叠盒体中盒体的数量为2到20个。
11.根据权利要求9所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述盒体(1)的侧壁上表面的外侧设有台阶状的凸缘(25)，盒体(1)底壁上开设有能与凸缘(25)相嵌合的嵌合凹槽(26),多个盒体(1)反向并通过凸缘(25)与嵌合凹槽(26)的对接构成层叠盒体(30 )。
12.根据权利要求9所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述层叠盒体(30)中底部盒体(1)的出液孔(19)位于盒体(1)的侧壁上，其他盒体(1)的出液孔(19)位于盒体(1)的底壁上并能将泄流槽(9)中的液体直接输入下部盒体(1)静压槽(7)内。
13.根据权利要求9所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述层叠盒体(30)的外部设有由箱体(31)和箱盖(32)组成的反应箱，反应箱上开设有能使输液管(27)通过的孔道(34)，储液罐(28)和蠕动泵(29)位于反应箱外。
14.根据权利要求13所述的一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，其特征在于:所述反应箱外围设有循环水套(33)，储液罐(28)和蠕动泵(29)位于循环水套(33)外。
【文档编号】C12M3/00GK103966095SQ201410218150
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】伍津津 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院