StNHX1基因表达盒、应用及耐盐转基因大豆培育法

StNHX1基因表达盒、应用及耐盐转基因大豆培育法
【专利摘要】本发明属于分子生物学与生物【技术领域】，涉及一种Na+/H+逆向转运蛋白基因StNHX1及其在转基因作物育种中的应用，提供该基因表达盒、构建方法及重组植物表达载体、宿主菌及耐盐转基因大豆的培育方法、StNHX1基因相对表达量的测定方法、试剂盒。本发明解决了现有技术中耐盐大豆培育和筛选技术薄弱的问题，通过选择合适的酶切位点，将经过人工PCR扩增的StNHX1基因引入35s启动子和终止子，增加了StNHX1基因在外源基因中的表达调控，构建的重组植物表达载体含有除草剂抗性基因，便于检测也提高了转基因植株对除草剂的抗性。以本发明的培育方法生产出的大豆，具有高盐耐受性。
【专利说明】StNHXI基因表达盒、应用及耐盐转基因大豆培育法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学与生物【技术领域】，涉及一种Na+/H+逆向转运蛋白基因StNHXl及其在转基因作物育种中的应用，具体涉及一种Na+/H+逆向转运蛋白基因StNHXl表达盒、该表达盒的构建，及利用该表达盒进行耐盐转基因大豆的培育方法、在培育过程中所使用的表达载体、宿主菌和应用以及该转运蛋白基因定量检测方法、试剂盒。
技术背景
[0002]土壤盐溃化是影响农业生产及环境的最主要问题之一。随着全球水资源危机以及土壤盐化问题的加剧，盐胁迫已成为影响作物生长与产量的主要限制因素(Apse MP，Aharon G S，Snedden W A, Blumwald E.Salt tolerance conferred by overexpressionof a vacuolar Na./H+antiport in Arabidopsis.Science， 1999，285(5431):1256-1258)o目前，世界盐溃土壤面积约10亿hm2，我国盐碱地已由过去的0.26亿hm2，发展到0.33亿hm2，主要分布在沿海地区(丁海荣，洪立洲，杨智青，王茂文，朱小梅，刘冲.盐碱地及其生物措施改良研究现状.现代农业科技，2010(6):299-300) 0盐碱地中，盐对植物的毒害主要有水分万缺及离子毒害两种类型(Blumwald Ej Aharon G S，Apse M P.Sodiumtransport in plant c ells.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes, 2000，1465(1-2):140-151),主要对光合作用、新陈代谢、离子及水分吸收、细胞质酶的活性等影口向(Takahashi RjLiu S，Takano T.1solation and characterization of plasma membraneNa./H+antiporter genes from salt-sensitive and salt-tolerant reed plants.Journal of Plant Physiology，2009，166 (3): 301-309)，从而导致植物减产甚至死亡。
[0003]植物克服盐胁迫的机制有Na+的外排和液泡区室化(Blumwald Ej Aharon GS and Apse M P，Sodium transport in plant cells.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)_Biomembranes，2000.1465(1-2): 140-151)。Na+/H+逆向转运蛋白(sodium/hydrogen antiporter)在 Na+外排与区室化中占有重要作用(Liu Lj Zeng Y，Pan X，ZhangF.1solation, molecular characterization, and functional analysis of the vacuolarNa./H+antiporter genes from the halophyte Karelinia caspica.Molecular Biologyreports, 2012，39 (6): 1-10)。质膜Na+/H+逆向转运蛋白利用质膜H+-ATPase产生的跨膜质子梯度将Na+排出细胞，减少Na+向叶片中的长距离转运而保护光合组织免受盐的毒害(Shi H, Quintero F Jj Pardo J M and Zhu J K，The putative plasma membraneNa+/H+antiporter SOSlcontrols long-distance Na+transport in plants.The PlantCell Online, 2002.14(2):465-477);而液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白则利用液泡膜质子泵(H+-ATPase和H+-PPase)产生的跨膜质子梯度将Na+区室化进入液泡(Vasekina AV,Yershovp P V, Reshetova O S，Tikhonova T V, Lunin V Gj Troofimova M S，BabakovA V.Vacuolar Na+/H+antiporter from barley:1dentification and response to saltstress.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes,2005，70 (I):123-132)。Na+的外排及区室化不仅减轻了过多Na+在细胞中过量累积对细胞质的毒害，而且可以利用NaCl作为溶质维持渗透势以驱动水分进入细胞(Wu G Q，Xi J J, Wang Q, Bao A K, MaQ, Zhang J L, Wang S M.The ZxNHX gene encoding tonoplast Na./H+antiporter from thexerophyte Zygophyllum xanthoxylum plays important roles in response to salt anddrought.Journal of Plant Physiology, 2011, 168(8):758-767)。
[0004]提高作物耐盐性是解决土壤盐害的有效方式，然而传统育种方法由于其遗传异质性、周期长及其他因素等，在提高作物耐盐性方面收之甚微(Shannon M C.Adaptation ofplants to salinity.Advances in Agronomy, 1997，60:75-120)。植物基因工程的应用为人们提高作物耐盐性提高了一种全新的方法。随着现代生物技术的发展，人们逐渐采用耐盐相关基因遗传转化技术来改良作物的耐盐性(Ashraf M.Biotechnological approachof improving plant salt tolerance using antioxidants as markers.BiotechnologyAdvances, 2009, 27:84-93)。将耐盐相关基因遗传转化植物，可显著提高植物的耐盐性(Ashraf M, Akram N A.1mproving salinity tolerance of plants through conventionalbreeding and genetic engineering:An analytical comparison.BiotechnologyAdvances, 2009, 27(6):744-752)。
[0005]近年来，研究者已从多种植物中克隆Na+/H+逆向转运蛋白基因并利用植物基因工程应用到作物的遗传改良上(Ashraf M, Akram N A.1mproving salinity toleranceof plants through conventional breeding and genetic engineering:An analyticalcomparison.Biotechnology Advances, 2009, 27 (6): 744-752)。研究结果显不，通过超表达Na+/H+逆向转运蛋白基因，多种植物耐盐性均得到显著提高，如油菜、水稻、荞麦、牵牛花等(Ashraf M, Akram N A.1mproving salinity tolerance of plants through conventionalbreeding and genetic engineering:An analytical comparison.BiotechnologyAdvances, 2009, 27(6):744-752)。 [0006]大豆[Glycine max(L.)Merrill]是当今重要的农作物之一,其富含的蛋白质作为工业及农业的重要原料。但随着土壤盐溃化和次生盐溃化的不断加重，露地及保护地栽培的大豆产量和品质受到了严重影响。在盐胁迫下，大豆出苗率显著下降，生长期叶片失绿、黄化坏死，生物量、株高、叶面积等均显著下降；不仅如此，大豆根瘤的数量及干重也显著下降，进而影响大豆单株荚数、粒数、百粒重，最终导致减产绝收(姜静涵，关荣霞，郭勇，常汝镇，邱丽娟.大豆苗期耐盐性的简便鉴定方法.作物学报，2013，39 (7): 1248-1256)。此外，我国栽培和野生种质资源丰富，但在种质资源研究上较国际上的大豆主要生产国存在明显差距，大豆耐盐品种的筛选及培育也相对较薄弱。

【发明内容】

[0007]本发明目的是解决现有技术中耐盐大豆培育和筛选技术薄弱，Na+/H+逆向转运蛋白基因在耐盐转基因大豆应用领域空白的问题。
[0008]本发明通过以下技术实现上述目的
[0009]本发明提供一种Na+/H+逆向转运蛋白StNHXl基因表达盒，该表达盒序列如SEQ IDN0.2所示，具有EcoRI和HindIII双酶切位点。
[0010]本发明还提供上述的逆向转运蛋白StNHXl基因表达盒的构建方法，包括如下步骤:[0011]I)设计引物，扩增序列为SEQ ID N0.1所示的StNHXl基因片段；其中，上游引物Pl:如SEQ ID N0.3所示；下游引物P2:如SEQ ID N0.4所示；
[0012]2)将StNHXl基因连接到pMD19_T质粒载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性重组质粒，进行BamHI和SacI双酶切，回收StNHXl基因片段；
[0013]3)进行植物表达载体pBI121BamHI和SacI双酶切，回收pBI121大片段；
[0014]4)以连接酶连接上述回收的StNHXl基因片段和pBI121大片段，形成连接产物，以连接产物转化T0P10感受态细胞，37°C过夜培养，挑取单克隆扩大培养，筛选转化子；
[0015]5)提取步骤4)中转化子的重组阳性质粒进行EcoRI及HindIII双酶切，回收小片段，即得到StNHXl基因表达盒； [0016]其中，步骤2)、3)和步骤5)中双酶切体系为:50 μ L反应体系，IOXBufferl5 μ L，BSA0.5 μ L，DNA15 μ L, BamHIl.0 μ L，Sacll.0 μ L，ddH20 补至 50 μ L ;37°C反应 2h，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析进行回收；
[0017]步骤4)中连接反应体系为:10XT4ligase Buffer2.5 μ L，pBI121 大片段 2 μ L，StNHXl 基因片段 8 μ L，T4DNA 连接酶 I μ L, ddH20 补至 25 μ L。
[0018]本发明提供StNHXl基因在耐盐转基因植物培育中的应用，优选地，在耐盐转基因大豆培育中的应用。
[0019]本发明还提供一种耐盐转基因大豆的培育方法，将野生茄子Na+/H+逆向转运蛋白基因StNHXl构建至植物表达载体pCAMBIA3301中获得重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl，通过农杆菌介导的方法将重组表达载体导入大豆；具体包括如下步骤:
[0020]I)重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl的构建
[0021]将野生茄子StNHXl基因表达盒构建至植物表达载体PCAMBIA3301中，形成重组植物表达载体 PCAMBIA3301-StNHXl ；
[0022]2) StNHXl转基因大豆转化体的获得
[0023]农杆菌介导大豆子叶节方法，将重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl导入大豆基因组中，通过除草剂(Bialaphos)筛选获得Ttl代转化体；
[0024]3)转StNHXl基因大豆T3代阳性植株的获得
[0025]T0代植株通过自花授粉获得T1代种子，T1代种子萌发后通过PCR及GUS染色鉴定出阳性植株，阳性植株自花授粉获得T2代种子；τ2代阳性植株自花授粉获得T3代种子；τ3代种子萌发后通过同样的方法鉴定出阳性植株。
[0026]本发明还提供一种重组植物表达载体pCAMBIA3301_StNHXl，含有上述的Na+/H+逆向转运蛋白StNHXl基因表达盒和除草剂抗性基因bar基因，Na+/H+逆向转运蛋白StNHXl基因表达盒位于载体PCAMBIA3301的EcoR I和HindIII位点之间。
[0027]本发明还提供上述重组植物表达载体pCAMBIA3301_StNHXl，在耐盐转基因大豆培育中的应用。
[0028]本发明还提供一种宿主菌，含有上述的重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl。
[0029]本发明提供上述宿主菌在耐盐转基因植物培育中的应用，优选地，在耐盐转基因大豆培育中的应用。
[0030]本发明提供一种耐盐转基因大豆StNHXl基因相对表达量的测定方法，以大豆伸长因子EF-laX56856基因TefSl作为内参基因，通过半定量RT-PCR测定StNHXl基因在耐盐转基因大豆中的表达量；
[0031] 其中，使用629-bp StNHXl基因探针的制备引物，上游引物F:如SEQ ID N0.9 PJf示，下游引物R:如SEQ ID N0.10所示；
[0032]检测TefSl基因的上游引物FT:如SEQ ID N0.11所示；下游引物RT:如SEQ IDN0.12所示。
[0033]本发明提供一种耐盐转基因大豆StNHXl基因相对表达量测定的试剂盒，该试剂盒包括如下序列:
[0034]629-bp StNHXl基因探针的制备引物，上游引物P:如SEQ ID N0.9所示，下游引物P:如 SEQ ID N0.10 所示；
[0035]TefSl基因的检测引物，上游引物FT JBSEQ ID N0.11所示;下游引物RT:如SEQID N0.12 所示。
[0036]本发明有益效果:
[0037]1.本发明通过选择合适的酶切位点，将经过人工PCR扩增的StNHXl基因引入35s启动子和终止子，增加了 StNHXl基因在外源基因中的表达调控，提高了 StNHXl基因的表达水平；同时，通过引入EcoRI及Hindi 11双酶切位点，形成的Na+/H+逆向转运蛋白StNHXl基因表达盒可以应用于多种耐盐转基因植株的培育，尤其是耐盐转基因大豆的培育，填补了现有技术中的空白。
[0038]2.采用本发明提供的耐盐转基因大豆的培育方法生产出的含有StNHXl基因的大豆，具有高盐耐受性的特点，通过试验鉴定，通过本发明提供的培育方法生产出的转基因大豆，IOOmM NaCl胁迫下正常生长。
[0039]3.本发明构建的含有Na+/H+逆向转运蛋白StNHXl基因的重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl，含有除草剂抗性基因bar基因，使得携带有Na+/H+逆向转运蛋白StNHXl基因的植物表达载体在宿主细胞中表达更容易检测，额外增加的除草剂抗性基因bar基因提高了转基因植株对除草剂的抗性，增加了品质。
[0040]4.本发明通过选择合适的看家基因即大豆伸长因子EF_laX56856基因(TefSl)作为内参基因，以此作为基准，使用集成凝胶显像系统，凝胶图像分析StNHXl基因相对于TefSl基因的表达量，通过该方法可以定量测定StNHXl基因转化率，从而选择出合适表达的转基因大豆，为转基因育种提供方便。
【专利附图】

【附图说明】
[0041]图1StNHXl基因表达盒
[0042]图2 植物表达载体 pCAMBIA3301-StNHXl 的 T-DNA 区
[0043]图3农杆菌介导大豆子叶节遗传转化过程
[0044]A:无菌苗5天苗龄；B:子叶节共培养；C =Bialaphos筛选2个月的外植体；D:抗性芽伸长至3-4cm ；E:GUS阳性芽生根；F:转基因阳性植株。
[0045]图4转基因大豆植株PCR及Southern杂交鉴定
[0046]A:PCR 鉴定 T。代植株:a — gus 基因；b—bar 基因；c—StNHXl 基因；M—DNAMarker:大小分别为 2KbUKb,0.75Kb,0.5Kb,0.25Kb,0.1Kb ;P—质粒 DNA 阳性对照；WT—野生型植株阴性对照；1~3—分别为Ttl代转基因植株12N-1~12N-3。
[0047]B =Southern杂交分析:P—质粒DNA阳性对照；WT—野生型植株阴性对照；I~3—分别为Ttl代转基因植株12N-1~12N-3。
[0048]图5转基因大豆⑶S染色鉴定
[0049]A-C:分别为Ttl代植株的根、叶、花；D:T0代植株的丑荚；Ε:1\代种子萌发24h后⑶S染色；F =T2代种子萌发3天后⑶S染色；G =T3代10天苗龄侧根⑶S染色；WT—野生型植株；1~3—分别为Ttl代基因植株12N-1~12N-3。
[0050]图6转StNHXl基因植株Basta抗性分析
[0051]A:黑色箭头表示转基因植株具有Basta抗性；B:白色箭头表示阴性植株不具有Basta抗性。
[0052]图7半定量RT-PCT检测StNHXl基因在T3代植株中的表达
[0053]A:半定量RT-PCT检测StNHXl基因表达电泳结果；B:光密度分析StNHXl基因相
对表达量。
[0054]WT—野生型植株阴性对照；I~3—分别为T3转基因植株12N-1~12N_3 ;TefSl—
看豕基因。
[0055]图8IOOmM NaCl胁迫下植株生长情况
[0056]A =T3转基因植株在IOOmM NaCl处理前植株形态；B:野生型对照植株在IOOmMNaCl处理前植株形态；C:100mM NaCl处理15天后T3代转基因植株和野生型对照植株叶片形态；D:100mM NaCl处理15天后T3转基因植株和野生型对照植株根部形态。StNHXlT3+T3转基因植株；WT—野生型对照。竖线表示图比例(Bar)，Bar = 15cm。
[0057]图9叶片及根中Na+、K+含量分析
[0058]A:叶片Na.含量；B:叶片K.含量；C:叶片K+/Na+比；D:根Na.含量；E:根K.含量；
[0059]F:根K+/Na+比。不同字母表示Duncan’ s多重比较在P〈0.05水平上差异显著。
[0060]图10叶盘对盐害敏感性检测⑷及相对叶绿素含量(B)
[0061]1-3:分别为转StNHXl基因T3代株系12N-1~12N2-3 ；WT:野生型植株。
【具体实施方式】
[0062]下述实施例中所用方法若无特殊说明均为本领域惯用的技术手段，所用的试剂、材料，如无特殊说明均可通过商业途径得到。
[0063]一、植物重组表达载体pCAMBIA3301-StNHXl的构建
[0064]1.Na+/H+逆向转运蛋白StNHXl基因的克隆:
[0065]以野生爺子‘Torvum Vigor’叶片作为材料,参照TaKaRa公司总RNA提取试剂盒(目录号:D9108A)说明书方法，提取叶片总RNA并反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照野生茄子Na+/H+逆向转运蛋白基因序列信息(NCBI登录号JN606860.1)，设计引物扩增StNHXl基因；其中，StNHXl基因序列如SEQ ID N0.1所示的；扩增引物序列，上游引物Pl:如SEQ ID N0.3所示，下游引物P2:如SEQ ID N0.4所示。
[0066]以上述反转录成cDNA为模板，进行PCR反应；
[0067]PCR 反应体系:10 XPCR Buffer5.0yL, dNTP mix4.0 μ L (2.5mmol.L-1)，引物 Pl和 P2 各 1.0 μ L(20 μ mo I.L-1)，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.4 μ L，cDNA 模板 I μ L,ddH20 补至 50 μ L ;
[0068]PCR 反应程序:94°C，5min ；95°C，2min, 55°C，lmin, 72°C，lmin, 30 个循环；72°C，总延伸IOmin ；
[0069]PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，目录号:AP-GX_50)回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa,目录号:D2011A)连接到pMD19_T载体(TaKaRa,目录号:D102A)，转化T0P10感受态细胞，获得阳性重组质粒，进行序列测定。
[0070]2.StNHXl基因表达盒的构建
[0071]提取上述重组阳性质粒进行BamHI和SacI双酶切，回收StNHXl基因片段；
[0072]同时进行植物表达载体pBI121BamHI和SacI双酶切，回收pBI121大片段；
[0073]双酶切体系(50μ L): 10 X Buffer I 5 μ L，BSA0.5 μ L，DNA15 μ L，BamHIL O μ L，Sacll.0 μ L，ddH20补至50 μ L ;37°C反应2h ;双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的片段；
[0074]上述回收的p BI121大片段和StNHXl基因片段，按照1:4的比例，用T4DNA连接酶连接，连接反应体系=IOXT4Iigase Buffer2.5 μ L, ρΒΙ121大片段2 μ L，StNHXl基因片段8μ L, T4DNA连接酶I μ L，ddH20补至25 μ L ; 16°C反应过夜，取10 μ L连接产物转化T0P10感受态细胞。37°C过夜培养，挑取单克隆扩大培养，筛选转化子；
[0075]提取转化子的阳性重组质粒，依据上述酶切体系进行EcoRI及HindIII双酶切，回收小片段，即得到StNHXl基因表达盒，序列如SEQ ID N0.2所示。
[0076]3.植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl的构建
[0077]植物表达载体pCAMBIA3301依据上述双酶切体系进行EcoRI及HindIII双酶切，回收大片段
[0078]上述回收的pCAMBIA3301大片段和StNHXl基因表达盒，按照1:4的比例，用T4DNA连接酶连接，连接反应体系:10XT4ligase Buffer2.5 μ L, pCAMBIA3301大片段2μ L，StNHXl基因表达盒8 μ L，T4DNA连接酶I μ L，ddH20补至25 μ L ; 16°C反应过夜，取10 μ L连接产物转化Τ0Ρ10感受态细胞。37°C过夜培养，挑取单克隆扩大培养，获得转化子，提取质粒，进行双酶切验证，植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl构建成功。
[0079]二、重组表达载体pCAMBIA3301-StNHXl转染农杆菌EHA105
[0080](I)提取10 μ L 即2 μ g纯化的重组表达pCAMBIA3301_StNHXl，加入200 μ L农杆菌ΕΗΑ105感受态，混匀；
[0081](2)冰浴5min,转入液氮冷冻Imin ；
[0082](3)加入 8OO μ L YEB 液体培养基，250rpm, 28°C，4-5h ；
[0083](4)用移液器将菌液移至YEB固体选择培养基(培养基中含有50mg.L-1卡那霉素)均匀涂布；
[0084](5)281:培养1-2(1，挑取单菌落，提取质粒，酶切检测获得转化的农杆菌工程菌。三、农杆菌介导StNHXl基因表达载体转化大豆
[0085]1.大豆子叶节外植体的制备及侵染
[0086]取成熟饱满的大豆‘新辽鲜’种子，表面消毒后接种于萌发培养基[B5+3% (w/v)鹿糖+0.8% (w/v)琼脂，pH5.8]，25°C条件下,光照(16h昼/8h夜,光照强度90 μ mol mH培养5-6天获得无菌苗(如图3-A所示)。保留子叶下方2-3cm的下胚轴，垂直沿下轴胚将子叶分开，水平划5-7次腋芽原基区，得到子叶节外植体。
[0087]将含pCAMBIA3301-StNHXl的农杆菌EHA105划线于平板，28°C培养24h，挑取单克隆液体培养24h，然后取2mL菌液加入200mL YEP液体培养基中，扩大培养至OD65tl为
0.6-0.8，菌液离心后，用液体共培养培养基[添加有1/10B5+1.67mg.L、-苄基氨基嘌呤 +0.25mg.I71 赤霉素 +200 μ mol.I71 乙酰丁香酮 +3% (w/v)鹿糖和 0.7% (w/v)琼脂，ρΗ5.4]重悬，调节OD650值为I。
[0088]外植体放入到50mL重悬菌液中，侵染30min。侵染结束后，吸干多余菌液，将外植体近轴面向下接种于铺有一层滤纸的共培养基(3mM L-半胱氨酸+ImM硫代硫酸钠+ImM 二硫苏糖醇)，25°C暗培养4天(如图3-B所示)。
[0089]2.转基因植株的再生
[0090]共培养结束后的外植体，用液体芽诱导培养基[B5培养基+1.67mg.L^6-苄基氨基嘌呤+500mg.L-1羧苄青霉素+3% (w/v)蔗糖+3mmol.T1MES, ρΗ5.6]摇动洗涤4-5次除去表面多余菌体，将外植体近轴面向上接种于固体芽诱导培养基[液体芽诱导培养基+0.8% (w/v)琼脂琼脂，]。25°C光照(1611昼/811夜，光照强度9(^11101 n^s—1)培养10天。10天后，外植体接种于芽诱导筛选培养基(芽诱导培养基+4mg.L—1双丙氨磷)，筛选培养4周，每2周继代一次。
[0091]培养4周后，将有丛生芽分化的外植体(如图3-C所示)，接种到芽伸长培养基[MS+lmg.I71玉米素+0.5mg.I71赤霉素+0.1mg.L-1 口引哚乙酸+IOOmg.I71焦谷氨酸+50mg.L^1L-天冬酰胺+300mg.L—1羧节青霉素+2mg.L—1双丙氨磷+3% (w/v)鹿糖，3mmol.L^MES+0.8% (w/v)琼脂，ρΗ5.6]上进行培养，每隔两周继代I次，培养约6-8周。
[0092]待芽伸长至3-4cm时(如图3_D所示)，用手术刀从基部切下，转入生根培养基[1/2B5+0.5mg *L_1IBA+3% (w/v)鹿糖+0.8% (w/v)琼脂，ρΗ5.6],根长至 l_2cm 长时(如图3-E所示)，驯化移入温室，常规管理，直至成熟收获(如图3-F所示)。通过除草剂(Bialaphos)筛选获得Ttl代转化体；
[0093]3.转StNHXl基因大豆T3代阳性植株的获得
[0094]T0代植株通过自花授粉获得T1代种子，T1代种子萌发后通过PCR及GUS染色鉴定出阳性植株，阳性植株自花授粉获得T2代种子；τ2代阳性植株自花授粉获得T3代种子；τ3代种子萌发后通过同样的方法鉴定出阳性植株
[0095]四、转基因大豆的鉴定
[0096]1.转基因大豆植株PCR鉴定
[0097]取Ttl代转基因大豆叶片，SDS法提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别对gus、bar和StNHXl基因进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳检测(如图4-A所示)。通过对转化植株中外源基因gus、bar和StNHXl的PCR检测，初步证实植株的StNHXl基因成功转化植株
并获得重组。
[0098]其中，StNHXl的PCR检测引物，上游引物Pl:如SEQ ID N0.3所示，下游引物P2:如 SEQ ID N0.4 所示；
[0099]gus基因的PCR检测引物，上游引物⑶S1:如SEQ ID N0.5所示，下游引物⑶S2:如 SEQ ID N0.6 所示；
[0100]bar基因的PCR检测引物，上游引物barl:如SEQ ID N0.7所示，下游引物bar2:如 SEQ ID N0.8 所示。
[0101]gus 因的 PCR 扩增程序:94°C，5min，94t:，45sec，55t:，lmin，72°C，lmin，30 个循环后，72 °C 总延伸 IOmin ；bar 基因的 PCR 扩增程序:MV, 5min, 94 V，45sec，58 V，lmin,72°C，lmin, 30 个循环后，72°C总延伸 IOmin ；StNHXl 基因的 PCR扩增程序 94°C，5min ；95°C，2min, 55°C，lmin, 72°C，lmin, 30 个循环；72°C,总延伸 IOmin0
[0102]2.转基因大豆植株Southern blot鉴定
[0103]采用SDS法，大量提取Ttl代植株叶片基因组DNA。30 μ g基因组DNA被EcoRI酶切消化后用于Southern blot分析；629_bp StNHXl探针的标记及杂交方法依据RoachDIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 说明书进行(Roach,产品号:11745832910)。如图4_B所示，转基因植株各含有I个拷贝。 [0104]629-bp StNHXl片段通过PCR扩增获得:
[0105]PCR扩增引物，上游引物P如SEQ ID N0.9所示，下游引物P:如SEQ ID N0.10所
/Jn ο
[0106]PCR 反应程序:95°C,4min ；95°C,2min, 55°C 30s ；72°C,30s ；72°C, IOmin0
[0107]3.转基因大豆花和种子的⑶S鉴定
[0108]取Ttl代转基因大豆和野生型大豆叶片、花和种子，分别置于⑶S染色液[SOmmoI.L-1 憐酸钠缓冲液(pH7.0), I % (v/v) Triton X100, 20% (v/v)甲醇，50mmol.L-1六氰合亚铁酸钾，50mmol L-1六氰合铁酸钾，ImM X-gluc (G0LDB10，货号:G1281C) ]，37°C染色12h。70%乙醇脱色后，拍照观察(如图5所示)。由图5所示，转基因植株花与种子均检测有gus基因表达，且外源基因可遗传给后代。
[0109]以上培养基或染色液中成分的浓度、质量体积百分比均相对于对应培养基或染色液体积而言。
[0110]4.转基因大豆Basta涂抹鉴定
[0111]选取健康生长的Ttl代转基因大豆和野生型大豆叶片，用棉棒蘸取0.05 % Basta涂抹于半张叶片，5天之后观察叶片表现，拍照记录(如图6所示)。图6所示，非转基因植株涂抹Basta的叶片表现出失绿，而转基因植株的叶片正常，表明转基因植株具有除草剂抗性，进一步证明植株含有bar基因、gus基因及StNHXl基因这三个外源基因。
[0112]5.转基因大豆T3代植株中StNHXl基因相对表达量的测定
[0113]半定量反转录PCR (RT-PCR)测定StNHXl基因在上述转StNHXl基因植株T3代植株中的表达量，大豆伸长因子EF-laX56856基因(TefSl)作为内参基因。使用集成凝胶显像系统(GenoSenslSSO，上海勤翔科技有限公司，中国)进行溴化乙锭染色后的凝胶图像获取及分析。设定看家基因TefSl基因的光密度为I,StNHXl基因的光密度与其比值为StNHXl基因的相对表达量。
[0114]其中，反转录PCR扩增StNHXl引物，上游引物P:如SEQ ID N0.9所示，下游引物P:如 SEQ ID N0.10 所示。
[0115]反转录PCR扩增TefSl引物，上游引物TefSl JBSEQ ID N0.11所示，下游引物TefSl:如 SEQ ID N0.12 所示。
[0116]为检测大豆T3代植株中StNHXl基因的表达情况，取T3代转基因植株(分别标记为12Ν-1、12Ν-2、12Ν-3)及野生型对照植株的叶片及根，分别提取总RNA(参照TaKaRaTrizol Reagent说明书)，按照反转录试剂盒(TaKaRa，货号:DRR047A)的方法将RNA反转录为cDNA，进行半定量PCR反应。20μ L反应体系包括:10XPCR Buffer2.0 μ L，dNTP mixl.6 μ L(2.5mmol.L-1)，上游引物和下游引物(TefSl和StNHXl基因)各1.0 μ L(20 μ mol.L-1)，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.2 μ L, cDNA 模板 I μ L, ddH20 补至 20μ L。反应程序:95°C，4min ；95°C,2min, 55°C,30s ；72°C,30s ；30 个循环后 72°C延伸IOmin0对叶片及根进行TefSl基因表达量和StNHXl基因相对表达量的测定(如图7所示)。由图7可观察到，StNHXl基因在T3代转基因植株叶片及根部中均为超表达。
[0117]6.转基因大豆耐盐性鉴定
[0118]上述3个超表达转StNHXl基因T3代株系用于耐盐性试验。将3个转StNHXl基因大豆T3代株系(12Ν-1，12Ν-2及12N-3)的阳性植株与野生型对照植株(WT)用于耐盐性试验。10天苗龄的植株定植于含有l/2Hoagland溶液(EC = 1.34dS.m-1)的18L水桶中(上围直径为30cm)，每桶含有3棵不同株系的T3代植株及I棵野生型植株(四棵植株呈正方形排列，对角线距离为26cm)，对营养液进行连续通氧，并每3天更换(用HCl或NaOH调节pH值至6.5)。每个株系重复5次。温室环境采用人工控制，昼夜温度:28°C/20°C，光周期:12h 昼 /12h 夜(HPS 灯，PPFD:光强度 600 μ mol.m-2.s’，相对湿度:70 - 80%, CO2浓度:400 μ M0营养液培养20天后，用含有IOOmM NaCl的l/2Hoagland营养液栽培(EC =
7.35dS.m-1)，为避免盐冲击效应，先用含有50mM NaCl的营养液栽培，2天后NaCl增加至100mM。盐处理15天后进行下列各项生理生化指标检测。对照试验为以不加NaCl溶液进行栽培。
[0119]耐盐前后观察各植株症状(如图8所示)。在盐处理前，30天苗龄的转基因及野生型植株在形态上没有差别(如图8A，8B所示)。而IOOmM NaCl处理15天后，野生型植株与转基因植株在形态上有显著的差别(如图8C，8D所示)，转基因植株株高、根长、茎粗、叶数、叶面积及生物量均显著高于野生型对照(如表1所示)，且野生型植株的生长明显受到抑制，叶片失绿且枯萎(如图8C所示)。野生型植株盐害指数也显著比转基因植株高(如表1所示)。
[0120]NaCl处理前及处理15天后取根、叶进行Na+、K+含量测定(如图9所示)。由图9所示，在NaCl处理前，植株Na+、K+含量及K+/Na+比值没有显著差别；IOOmM NaCl处理15天后，转基因植株叶片中Na+含量显著比野生型低而K+含量显著比野生型对照高，转基因植株KVNa+比值及根部Na+、K+含量均显著高于野生型对照。
[0121]NaCl处理前后测定植株叶片丙二醛(MDA)、相对水含量(RWC)及脯氨酸含量(如表2所示)。IOOmM NaCl处理前转基因植株与野生型植株叶片的MDA、RWC及脯氨酸含量无显著差别，而NaCl处理15天后，转基因植株的RWC及脯氨酸含量显著高于野生型对照，MDA含量则显著低于野生型对照(如表2所示)，表明转基因植株具有较强的耐盐性。
[0122] 取无盐胁迫下转基因及野生型植株的叶片进行叶盘敏感性检测(如图10A所示)。将叶片分成大小相同的叶盘置于不同浓度NaCl浓度下光照培养，3天后观察叶盘的颜色，结果如图9A所示，随着NaCl浓度的升高，叶盘的绿色越淡，但同一浓度下，转基因植株叶盘的颜色远比野生型植株的深。测定盐胁迫条件下转基因及野生型植株叶片相对叶绿素的含量(如图9B所示)。由图9B所示，转基因植株相对叶绿素含量显著高于野生型植株，表明转基因植株耐盐性强于野生型对照植株。[0123]表1营养液栽培植株生长指标比较
【权利要求】
1.一种Na+/H+逆向转运蛋白StNHXl基因表达盒，其特征在于:该表达盒序列如SEQ IDN0.2所示。
2.权利要求1所述的逆向转运蛋白StNHXl基因表达盒的构建方法，其特征在于包括如下步骤: 1)设计引物，扩增序列为SEQID N0.1所示的StNHXl基因片段；其中，上游引物Pl:如SEQ ID N0.3所示；下游引物P2:如SEQ ID N0.4所示； 2)将StNHXl基因连接到pMD19-T质粒载体，转化TOPlO感受态细胞，提取阳性重组质粒，进行BamHI和SacI双酶切，回收StNHXl基因片段； 3)进行植物表达载体pBI121BamHI和SacI双酶切，回收pBI121大片段； 4)以连接酶连接上述回收的StNHXl基因片段和pBI121大片段，形成连接产物，以连接产物转化T0P10感受态细胞，3 7°C过夜培养，挑取单克隆扩大培养，筛选转化子； 5)提取步骤4)中转化子的重组阳性质粒进行EcoRI及HindIII双酶切，回收小片段，即得到StNHXl基因表达盒； 其中，步骤2)、3)和步骤5)中双酶切体系为:50 μ L反应体系，IOXBufferl 5 μ L，BSA0.5μ L，DNA15y L，BamHIl.Ομ L，SacIl.Ομ L，ddH20 补至 50 μ L ;37°C反应 2h，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析进行回收； 步骤 4)中连接反应体系为:10XT4ligase Buffer2.5 μ L，pBI121 大片段 2 μ L，StNHXl基因片段8 μ L，T4DNA连接酶I μ L，ddH20补至25 μ L。
3.StNHXl基因在耐盐转基因植物培育中的应用，优选地，在耐盐转基因大豆培育中的应用。
4.一种耐盐转基因大豆的培育方法，其特征在于将野生茄子Na+/H+逆向转运蛋白基因StNHXl构建至植物表达载体pCAMBIA3301中，获得重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl，通过农杆菌介导的方法将重组表达载体导入大豆；具体包括如下步骤: 1)重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl的构建 将野生茄子StNHXl基因表达盒构建至植物表达载体pCAMBIA3301中，形成重组植物表达载体 PCAMBIA3301-StNHXl ； 2)StNHXl转基因大豆转化体的获得 农杆菌介导大豆子叶节方法，将重组植物表达载体PCAMBIA3301-StNHXl导入大豆基因组中，通过除草剂Bialaphos筛选获得Ttl代转化体； 3)StNHXl转基因大豆T3代阳性植株的获得 T0代植株通过自花授粉获得T1代种子，T1代种子萌发后通过PCR及⑶S染色鉴定出阳性植株，阳性植株自花授粉获得T2代种子；T2代阳性植株自花授粉获得T3代种子；Τ3代种子萌发后通过同样的方法鉴定出阳性植株。
5.一种重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl，其特征在于含有权利要求1所述的Na+/H+逆向转运蛋白基因StNHXl表达盒和除草剂抗性基因bar基因，Na+/H+逆向转运蛋白StNHXl基因表达盒位于载体pCAMBIA3301的EcoR I和HindIII位点之间。
6.权利要求5所述的重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl，在耐盐转基因大豆培育中的应用。
7.—种宿主菌，其特征在于含有权利要求5所述的重组植物表达载体PCAMBIA3301-StNHXl ο
8.权利要求7所述的宿主菌在耐盐转基因植物培育中的应用，优选地，在耐盐转基因大豆培育中的应用。
9.一种耐盐转基因大豆StNHXl基因相对表达量的测定方法，其特征在于:以大豆伸长因子EF-laX56856基因TefSl作为内参基因，通过半定量RT-PCR测定StNHXl基因在耐盐转基因大豆中的表达量； 其中，使用629-bp StNHXl基因探针的制备引物，上游引物P:如SEQ ID N0.9所示，下游引物P:如SEQ ID N0.10所示； 检测TefSl基因的上游引物TefSl JnSEQ ID N0.11所示；下游引物TefSl JnSEQ IDN0.12所示。
10.一种耐盐转基因大豆StNHXl基因相对表达量测定的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括如下序列: 629-bp StNHXl基因探针的制备引物，上游引物F:如SEQ ID N0.9所示，下游引物R:如 SEQ ID N0.10 所示； TefSl基因的检测引物，上游引物FT:如SEQ ID N0.11所示；下游引物RT:如SEQ IDN0.12所示。
【文档编号】C12N15/82GK103981179SQ201410229771
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】朱月林, 盖钧镒, 陈国户, 杨立飞 申请人:南京农业大学