OsPT2磷高效利用转基因大豆培育方法

OsPT2磷高效利用转基因大豆培育方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学与生物【技术领域】，涉及一种磷转运蛋白基因OsPT2及该基因在转基因作物育种中的应用，提供含该基因的表达盒及构建、重组植物表达载体及含该载体的宿主菌、磷高效利用转基因大豆的培育方法和OsPT2基因相对表达量的测定方法、试剂盒。本发明解决现有技术中磷转运蛋白基因OsPT2在大豆育种中的空白，通过选择合适的酶切位点，在OsPT2基因引入35s启动子和终止子，增加了OsPT2基因在外源基因中的表达调控，构建的重组植物表达载体含有除草剂抗性基因bar基因，既方便检测又增加转基因植株对除草剂的抗性，以本发明培育方法生产出的大豆，能高效利用磷。
【专利说明】0sPT2磷高效利用转基因大豆培育方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学与生物【技术领域】，涉及一种磷转运蛋白基因0sPT2及该基因在转基因作物育种中的应用，具体涉及一种磷转运蛋白基因0sPT2表达盒、该表达盒的构建，及利用该表达盒进行磷高效利用转基因大豆的培育方法、在培育过程中所使用的表达载体和宿主菌及应用以及该种转基因大豆的检测试剂盒和定量检测方法。
技术背景
[0002]磷(P)是植物生长发育所需的大量元素之一，几乎参与所有生命的重要代谢活动，在植物体内的能量传递、信号传导、光合作用及呼吸作用等过程中起到关键作用；此外，磷还是细胞核及磷脂的重要组成成分(Raghothama K G, Phosphate transport andsignaling.Current Opinion in Plant Biology, 2000.3 (3): 182—187)。植物从土壤中获取磷仅以磷酸盐(Pi)形式获取。尽管土壤中总磷含量比较高，但由于磷酸盐浓度较低(0.1 - 10 μ M)而成为限制植物生长限制因子之一(Raghothama K G and Karthikeyan AS，Phosphate acquisition.Plant and Soil, 2005.274:37-49)。我国农田约有 2/3 严重缺磷，其中红壤作为我国南方主要的耕作土壤，其独特的理化性质，使其中的磷素更容易被固定，从而表现出严重缺磷现象(李杰，石元亮，陈智文，我国南方红壤磷素研究概况.土壤通报，2011.42 (3): 763-768)。为了获得较高产量，全球每年约3千万吨磷肥施用于耕地土壤，其中高达 80 % 被浪费掉(L0pez_Bucio J, de la Vega 0M, Guevara-Garcia A andHerrera-Estrella L.Enhanced phosphorus uptake in transgenic tobacco plants thatoverproduce citrate.Nature Biotechnology, 2000.18:450-453)。大量憐肥的施用加速土壤退化及环境污染，并造成磷资源浪费，据估算磷矿资源将在本世纪末消耗殆尽(HataS，Kobae Y and Banba M, Interactions between plants and arbuscular mycorrhizal fung1.1nternational Review of Cell and Molecular Biology, 2010.281:1-48)。
[0003]大豆是需磷量较多的作物，也是世界普遍种植的作物之一，是人类最主要的植物油及蛋白来源(Herridge D F，Peoples M B and Boddey R M, Global inputs of biologicalnitrogen fixation in agricultural systems.Plant and Soil,2008.311:1-18)。 土壤低憐限制着大豆的产量(Vance C P, Symbiotic nitrogen fixation and phosphorusacquisition.Plant nutrition in a world of declining renewable resources.PlantPhysiology, 2001.127:390-397)。而近年来包括中国在内的世界各国对大豆的消费迅速增长，使大豆生产的供需矛盾越来越突出，特别是在我国，直接关系到国家经济发展和粮食安全(程凤娴，涂攀峰，严小龙，王秀荣，廖红，酸性红壤中磷高效大豆新种质的磷营养特性.植物营养与肥料学报，2010.16(1):71-81)。
[0004]近年来，将高亲和磷转运蛋白基因转入到合适的经济及农作物中，获得磷高效的转基因材料是培育磷高效作物新品种的一种有效途径，如大豆中超表达GmPT5基因，转基因植株的磷含量在低磷及高磷条件下均比对照的磷含量显著增加(Qin L, Zhao J, TianJ, Chen L Y, Sun Z A, Guo Y X, Lu X, Gu M, Xu G H, Liao H.The high-affinity phosphatetransporter GmPT5regulates phosphate transport to nodules and nodulation insoybean.Plant Physiology, 2012, 159:1634-1643)。水稻中分别超表达 OsPTl、0sPT2 及OsPTS,在低磷条件下可增加磷从地下部到地上部的运输，从而提高植株耐低磷能力(JiaH F，Ren H Y, Gu M, Zhao J N, Sun S B, Zhang X, Chen J Y, Wu P and Xu G H, The phosphatetransporter gene OsPhtl ；8is involved in phosphate homeostasis in rice.PlantPhysiology, 2011.156:1164-1175 ；ffu P, Shou H X, Xu G H and Lian X M, Improvement ofphosphorus efficiency in rice on the basis of understanding phosphate signaling andhomeostasis.Current Opinion in Plant Biology, 2013.16:1-8)。烟草(Nicotiana tabacumL.)NtPTl在水稻中超表达，在低磷及高磷条件下均能够显著增加转基因植株的磷含量(Park M R, Baek S H, Reyes B G and Yun S J, Overexpression of a high-affinity phosphatetransporter gene from tobacco (NtPTl) enhances phosphate uptake and accumulation intransgenic rice plants.Plant and Soil, 2007.292:259-269)。由此可见，植物中超表达憐转运蛋白基因在低磷条件下可增加磷的吸收及提高耐低磷能力。 [0005]水稻(Oryza sativa L.)Phtl家族基因之一的磷转运蛋白基因0sPT2主要在根中柱、叶韧皮部、木质部中表达，是磷饥饿信号的应答基因，负责植物对磷的吸收及磷在体内的转运过程(Wu P, Shou H X, Xu G H and Lian X M, Improvement of phosphorus efficiencyin rice on the basis of understanding phosphate signaling and homeostasis.CurrentOpinion in Plant Biology, 2013.16:1-8)。利用 RNA 沉默技术敲除 0sPT2 显著增加磷的吸收及从根部到地上部分长距离运输，并且超表达0sPT2能够引起水稻地上部过量磷的积累，从而引起磷中毒。由于其特殊的表达模式，0sPT2被认为在植物磷转运过程中起到重要的作用(Ai P H, Sun S B, Zhao J N, Fan X R, Xin W J, Guo Q, Yu L, Shen Q R, WuP, Miller A J and Xu G H, Two rice phosphate transporters, OsPhtl ；2and OsPhtl ；6, havedifferent functions and kinetic properties in uptake and translocation.The PlantJournal, 2009.57(5):798-809)。利用生物工程手段将此基因导入作物中，可改善作物磷吸收及利用效率，有效降低磷肥的施用量。但到目前为止，尚未发现有此基因在大豆中表达的报道，利用生物工程提高大豆磷高效利用也鲜有报道。

【发明内容】

[0006]本发明目的是解决现有技术中磷转运蛋白基因0sPT2基因在大豆育种中的空白，实现大豆磷高效转运、减少磷肥的过度使用，从而降低土壤退化速度。
[0007]为实现上述目的，本发明提供下述技术:
[0008]本发明提供一种磷转运蛋白0sPT2基因表达盒，其序列为SEQ ID N0.2，具有EcoRI和HindIII双酶切位点。
[0009]本发明还提供上述磷转运蛋白0sPT2基因表达盒的构建方法，包括如下步骤:
[0010]I)设计引物，扩增序列为SEQ IDN0.1所示的0sPT2基因片段；其中，上游引物Pl:如SEQ ID N0.3所示;下游引物P2:如SEQ ID N0.4所示；
[0011]2)将0sPT2基因连接到PMD19-T质粒载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性重组质粒，进行SacI和XbaI双酶切，回收0sPT2基因片段；
[0012]3)进行植物表达载体pBI121SacI和XbaI双酶切，回收pBI121大片段；[0013]4)以连接酶连接上述回收的0sPT2基因片段和pBI121大片段，形成连接产物，以连接产物转化T0P10感受态细胞，37°C过夜培养，挑取单克隆扩大培养，筛选出转化子；
[0014]5)提取步骤4)中转化子的阳性重组质粒进行EcoRI及HindIII双酶切，回收小片段，即得到0sPT2基因表达盒；
[0015]其中，步骤2)、3)和步骤5)中双酶切体系为:50μ L体系中10XBufferl5y L，BSA0.5 μ L，DNA15 μ L, Sacll.0 μ L，XbaI1.0 μ L，ddH20 补至 50 μ L ;37°C反应 2h ;双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的片段；
[0016]步骤4)中连接反应体系为:10XT4ligase Buffer2.5μ L，pBI121 大片段 2μ L，0sPT2 基因片段 8 μ L，T4DNA 连接酶 I μ L, ddH20 补至 25 μ L。
[0017]本发明提供0sPT2基因在磷高效利用转基因植物中的应用，优选地，在磷高效利用转基因大豆中的应用。
[0018]本发明还提供一种磷高效利用转基因大豆的培育方法，将水稻磷转运蛋白基因0sPT2构建至植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2中，通过农杆菌介导的方法导入大豆；具体包括如下步骤:
[0019]I)重组植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2的构建:将水稻磷转运蛋白0sPT2基因表达盒构建至植物表 达载体PCAMBIA3301中，形成重组植物表达载体pCAMBIA3301_0sPT2 ；
[0020]2) 0sPT2转基因大豆转化体的获得:以大豆子叶节为外植体，通过农杆菌介导法，将植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2导入大豆基因组中，通过除草剂Bialaphos筛选获得T0代转化体；
[0021]3)转0sPT2基因大豆T2代阳性植株的获得=Ttl代植株通过自花授粉获得T1代种子，T1代种子萌发后通过PCR及GUS染色鉴定出阳性植株，阳性植株自花授粉获得T2代种子；T2代种子萌发后通过同样的方法鉴定出阳性植株，获得磷高效利用转基因大豆。
[0022]本发明还提供一种重组植物表达载体pCAMBIA3301_0sPT2，含有上述的磷转运蛋白0sPT2基因表达盒和除草剂抗性基因bar基因，水稻磷转运蛋白0sPT2基因表达盒位于植物表达载体PCAMBIA3301的EcoRI及HindIII酶切位点之间。
[0023]上述的植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2，在磷高效利用转基因植物培育中的应用，优选地，在磷高效利用转基因大豆培育中的应用。
[0024]本发明还提供一种宿主菌，含有上述植物表达载体pCAMBIA3301_0sPT2。
[0025]本发明提供的宿主菌在磷高效利用转基因植物培育中的应用，优选地，在磷高效利用转基因大豆培育中的应用
[0026]本发明还提供一种磷高效利用转基因大豆0sPT2基因相对表达量的测定方法，以大豆伸长因子EF-laX56856基因TefSl作为内参基因，通过半定量RT-PCR测定0sPT2基因在磷高效利用转基因大豆中的表达量；
[0027]其中，使用444-bp 0sPT2基因探针的制备引物，上游引物F:如SEQ ID N0.9所示，下游引物R:如SEQ ID N0.10所示；
[0028]检测TefSl基因的上游引物FT:如SEQ ID N0.11所示;下游引物RT:如SEQ IDN0.12所示。
[0029]本发明还提供一种磷高效利用转基因大豆0sPT2基因相对表达量测定的试剂盒，该试剂盒包括如下序列:[0030]444-bp 0sPT2基因探针的制备引物，上游引物F -M SEQ ID N0.9所示，下游引物R:如 SEQ ID N0.10 所示；
[0031]TefSl基因的检测引物，上游引物FT:如SEQ ID N0.11所示；下游引物RT:如SEQID N0.12 所示。
[0032]本发明有益效果:
[0033]1.本发明通过选择合适的酶切位点，将经过人工PCR扩增的0sPT2基因引入35s启动子和终止子，增加了 0sPT2基因在外源基因中的表达调控，提高了 0sPT2基因的表达水平；同时，通过引入EcoRI及HindIII双酶切位点，形成的磷转运蛋白0sPT2基因表达盒可以应用于多种磷高效利用转基因植株的培育，尤其是磷高效利用转基因大豆的培育，填补了现有技术中的空白。
[0034]2.采用本发明提供的磷高效利用转基因大豆的培育方法生产出的含有0sPT2基因的大豆，具有磷高效利用的特点，可在低磷环境下生存，通过试验鉴定，通过本发明提供的培育方法生产出的转基因大豆，即使在75天低磷生长环境下，生长状况仍然良好，产量未发生显著性减少。
[0035]3.本发明构建的水稻磷转运蛋白基因0sPT2的重组植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2，含有除草剂抗性基因bar基因，使得携带有磷转运蛋白基因0sPT2的植物表达载体在宿主细胞中表达更容易检测，额外增加的除草剂抗性基因bar基因提高了转基因植株对除草剂的抗性，增加了品质。
[0036]4.本发明通过选择合适的看家基因即大豆伸长因子EF_laX56856基因(TefSl)作为内参基因，以此作为基准，使用集成凝胶显像系统，凝胶图像分析0sPT2基因相对于TefSl基因的表达量，通过该方法可以定量测定0sPT2基因转化率，从而选择出合适表达的转基因大豆，为转基因育种提供方便。
【专利附图】

【附图说明】
[0037]图10sPT2基因表达盒
[0038]图2 植物表达载体 pCAMBIA3301-0sPT2 的 T-DNA 区
[0039]图3农杆菌介导大豆子叶节遗传转化过程
[0040]A:无菌苗5天苗龄；B:子叶节共培养；C =Bialaphos筛选2个月的外植体；D:抗性芽伸长至3-4cm ；E:GUS阳性芽生根；F:转基因阳性植株。
[0041]图4转基因大豆植株PCR及Southern杂交鉴定
[0042]A:PCR 鉴定 T。代植株:a — gus 基因；b—bar 基因；c—0sPT2 基因；M—DNA Marker:大小分别为2Kb、lKb、0.75Kb,0.5Kb,0.25Kb,0.1Kb ;P—质粒DNA阳性对照；WT—野生型植株阴性对照；1~10—分别为Ttl代转基因植株12PT2-1~12PT2-10 ；
[0043]B =Southern 杂交分析:M — DNA Marker:大小分别为 15Kb、7.5Kb,0.75Kb,0.5Kb、
0.25Kb,0.1Kb ;P—质粒DNA阳性对照；WT—野生型植株阴性对照；1~10—分别为Ttl代转基因植株 12PT2-1 ~12PT2-10。
[0044]图5转基因大豆⑶S染色鉴定
[0045] A =T0代植株叶片；B =T0代植株花；C:萌发3天的T1代种子；D:萌发24小时的T2代种子:1-3—分别为12PT2-1，12PT2-2，12PT2-4，WT—野生型植株阴性对照。[0046]图6转0sPT2基因植株Basta抗性分析
[0047]A:黑色箭头表示转基因植株具有Basta抗性；B:白色箭头表示阴性植株不具有Basta抗性。
[0048]图7半定量RT-PCR检测0sPT2在T2代植株中的表达
[0049]A:半定量RT-PCR检测0sPT2基因表达电泳结果。B:光密度分析0sPT2基因相对表达量。WT—野生型植株阴性对照；1，2，3—分别为转基因植株12PT2-1，12PT2-2，12PT2-4 ；TefSl—看家基因
[0050]图8低磷条件下营养液栽培植株生长情况
[0051]A-C:低磷处理10天后；D-F:低磷处理45天后；G:低磷处理75天后；0sPT2T2—T2转基因植株;WT—野生型植株阴性对照，其中，各竖线长度代表比例尺度(Bar):A、D、G短线长度代表实际Bar = 15cm ；B, C，E与F长线长度代表实际Bar = Icm
[0052]图9低磷及正常磷条件下营养液栽培植株不同器官磷积累情况
[0053]A:营养液栽培30天后植株根、茎、叶有效磷含量；B:营养液栽培30天后植株根、茎、叶总磷含量；C:落叶中总磷含量；D:种子中 总磷含量；每个株系共选用5棵植株用于分析，不同字母表示LSD比较在P〈0.05水平上差异显著。
【具体实施方式】
[0054]下述实施例中所用方法若无特殊说明均为本领域惯用的技术手段，所用的试剂、材料，如无特殊说明均可通过商业途径得到。
[0055]一、植物表达载体pCAMBIA3301_0sPT2的构建
[0056]1.水稻憐转运蛋白基因0sPT2基因的克隆:
[0057]以水稻叶片为材料，参照TaKaRa公司总RNA提取试剂盒(目录号:D9108A)说明书方法，提取叶片总RNA并反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照水稻磷转运蛋白基因基因序列信息(NCBI登录号:AF536962)，设计引物进行PCR反应，扩增出水稻磷转运蛋白基因0sPT2 ;其中，基因0sPT2的序列如SEQ ID N0.1 ;引物序列:上游引物Pl序列如SEQ IDN0.3所示，下游引物P2序列如SEQ ID N0.4所示。
[0058]以上述反转录成的cDNA为模板，进行PCR反应；
[0059]PCR 反应体系:10XPCR Buffer5.0 μ L，dNTP mix4.0 μ L(2.5mmol.171)，引物 Pl 和P2 各 1.0 μ L (20 μ mo I.L-1)，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.4 μ L，cDNA 模板 I μ L, ddH20补至50 μ L ；
[0060]两步法PCR 反应程序:94°C，5min, 65°C，2min, 72°C，45s，30 个循环后，72°C 总延伸IOmin ；
[0061 ] PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，目录号:AP-GX_50)回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa,目录号:D2011A)连接到pMD19_T载体(TaKaRa,目录号:D102A)，转化T0P10感受态细胞，获得阳性重组质粒，进行序列测定；
[0062]2.磷转运蛋白0sPT2基因表达盒的构建
[0063]提取上述阳性重组质粒进行SacI和XbaI双酶切，回收0sPT2基因片段；
[0064]同时对植物表达载体pBI121进行SacI和XbaI双酶切，回收pBI121大片段；
[0065]双酶切体系(50μL):10XBufferl5y L，BSA0.5μ L，DNA15y L，SacIl.0μ L，XbaI1.0 μ L，ddH20补至50 μ L ;37°C反应2h ;双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的片段；
[0066]上述回收的pBI121大片段和0sPT2基因片段，按照1:4的比例，用T4DNA连接酶连接，连接反应体系:10XT4ligase Buffer2.5 μ L，pBI121 大片段2 μ L，0sPT2基因片段8 μ L，T4DNA连接酶I μ L，ddH20补至25 μ L ; 16°C反应过夜，取10 μ L连接产物转化Τ0Ρ10感受态细胞。37°C过夜培养，挑取单克隆扩大培养，筛选转化子；
[0067]提取转化子的阳性重组质粒，依据上述酶切体系进行EcoRI及HindIII双酶切，回收小片段，即得到0sPT2基因表达盒，序列如SEQ ID N0.2所示；
[0068]3.重组植物表达载体pCAMBIA3301_0sPT2的构建
[0069]对植物表达载体pCAMBIA3301依据上述酶切体系进行EcoRI及HindIII双酶切，回收大片段。
[0070]双酶切后回收的PCAMBIA3301大片段和0sPT2基因表达盒，按照1:4的比例，用T4DNA 连接酶连接，连 接反应体系:10 X T4Iigase Buffer2.5 μ L, pCAMBIA3301 大片段 2 μ L，0sPT2基因表达盒8yL，T4DNA连接酶I μ L，ddH20补至25 μ L ;16°C反应过夜，取10 μ L连接产物转化Τ0Ρ10感受态细胞。37°C过夜培养，挑取单克隆扩大培养，提取质粒，进行双酶切验证，重组植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2构建成功。
[0071]二、重组植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2转染农杆菌EHA105
[0072]1.提取10 μ L，即2 μ g纯化的重组植物表达载体pCAMBIA3301_0sPT2，加入200 μ L农杆菌ΕΗΑ105感受态，混匀；
[0073]2.冰浴5min,转入液氮冷冻Imin ；
[0074]3.加入 800 μ L YEB 液体培养基，250rpm, 28°C，4_5h ；
[0075]4.用移液器将菌液移至YEB固体选择培养基，其中含50mg.L-1卡那霉素，均匀涂布；
[0076]5.28°C培养l-2d，挑取单菌落，提取质粒，酶切鉴定获得转化的农杆菌工程菌。
[0077]三、农杆菌介导0sPT2基因表达载体转化大丑
[0078]1.大豆子叶节外植体的制备及侵染
[0079]取成熟饱满的大豆‘新辽鲜’种子，表面消毒后接种于萌发培养基[B5培养基+3%(w/v) +0.8 % (w/v)琼脂，ρΗ5.8],25°C 条件下，光照(时间 16h 昼/8h 夜，强度 90 μ molHT2iT1)培养5-6天获得无菌苗(如图3-A所示)。保留子叶下方2-3cm的下胚轴，垂直沿下轴胚将子叶分开，水平划5-7次腋芽原基区，得到子叶节外植体。
[0080]将含重组植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2农杆菌EHA105划线于平板，28°C培养24h，挑取单克隆液体培养24h，然后取2mL菌液加入200mL YEP液体培养基中，扩大培养至OD650为0.6-0.8，菌液离心后，用液体共培养基[1/10B5培养基+1.67mg ^1^6-苄基氨基嘌呤 +0.25mg.L-1 赤霉素 +200 μ mol.I71 乙酰丁香酮 +3% (w/v)鹿糖 +0.7% (w/v)琼脂，ρΗ5.4]重悬，调节OD650值为I。
[0081]外植体放入到50mL重悬菌液中，侵染30min。侵染结束后，吸干多余菌液，将外植体近轴面向下接种于铺有一层滤纸的共培养基(添加3mmol.L^1L-半胱氨酸+Immol.L—1硫代硫酸钠和二硫苏糖醇)，25°C暗培养4天(如图3-B所示)。
[0082]2.转基因植株的再生[0083]共培养结束后的外植体，用液体芽诱导培养基[B5培养基+1.67mg.L^6-苄基氨基嘌呤+500mg.L-1羧苄青霉素+3% (w/v)蔗糖+3mmol.T1MES, ρΗ5.6]摇动洗涤4-5次除去表面多余菌体，将外植体近轴面向上接种于固体芽诱导培养基(液体芽诱导培养基+0.8% (w/v)琼脂)。25°C光照(16h光照/8h黑暗，光照强度为90 μ mol 培养10天。10天后，外植体接种于芽诱导筛选培养基(芽诱导培养基+4mg.L—1的双丙氨磷)，筛选培养4周，每2周继代一次。
[0084]培养4周后，将有丛生芽分化的外植体(如图3-C所示)，接种到芽伸长培养基[MS培养基+Img.I/1玉米素+0.5mg.L-1赤霉素+0.1mg.L-1 口引哚乙酸+IOOmg.L-1焦谷氨酸+50mg.L^1L-天冬酰胺+300mg.L-1羧节青霉素+2mg.L-1双丙氨磷+3% (w/v)鹿糖+3mmol.L^MES+0.8% (w/v)琼脂，pH5.6]上进行培养，每隔两周继代I次，培养约6_8周。
[0085]待芽伸长至3-4cm时(如图3_D所示)，用手术刀从基部切下，转入生根培养基[1/2B5 培养基+0.5mg.L-1IBA+3 % (w/v)鹿糖+0.8% (w/v)琼脂，ρΗ5.6],根长至 l_2cm长时(如图3-E所示)，驯化移入温室，常规管理，直至成熟收获。通过除草剂(Bialaphos)筛选获得Ttl代转化体；
[0086]3.转0sPT2基因大豆1~2代阳性植株的获得
[0087]T0代植株通过自花授粉获得T1代种子，T1代种子萌发后通过PCR及GUS染色鉴定出阳性植株，阳性植株自花授粉获得T2代种子；τ2代种子萌发后通过同样的方法鉴定出阳性植株。
[0088]四、转基因大豆的鉴定
[0089]1.转基因 大豆植株PCR鉴定
[0090]取Ttl代转基因大豆叶片，SDS法提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别对gus、bar和0sPT2基因进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳检测(如图4-A所示)。通过对转化植株中外源基因gus、bar和0sPT2的PCR检测，初步证实0sPT2基因成功转化植株并获得重组。
[0091]0sPT2基因PCR检测引物序列，上游引物Pl:如SEQ ID N0.3所示；下游引物P2:如 SEQ ID N0.4 所示；
[0092]gus基因PCR检测引物序列，上游引物⑶S1:如SEQ ID N0.5所示；下游引物⑶S2:如 SEQ ID N0.6 所示；
[0093]bar基因PCR检测引物序列，上游引物bar 1:如SEQ ID N0.7所示；下游引物bar2:如 SEQ IDN0.8 所示。
[0094]gus 基因的 PCR 扩增程序:94°C，5min，94t:，45sec，55t:，lmin，72°C，lmin，30 个循环后，72°C总延伸 IOmin ；bar 基因的 PCR 扩增程序:MV，5min, 94°C，45sec，58°C，lmin，72°C，lmin, 30 个循环后，72°C 总延伸 IOmin ；0sPT2 基因的 PCR 扩增程序 94°C，5min, 65°C，2min，72°C，45s，30 个循环后，72°C总延伸 IOmin0
[0095]2.转基因大?植株Southern blot鉴定
[0096]采用SDS法，大量提取Ttl代转基因大豆叶片基因组DNA。30 μ g基因组DNA经EcoRI酶切消化后用于Southern blot分析；444_bp 0sPT2探针的标记及杂交方法依据RoachDIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 说明书进行(Roach,产品号:11745832910)。图4_B所示，转基因植株含有1_3个拷贝。
[0097]444-bp 0sPT2探针通过PCR扩增反应获得:[0098]PCR反应上游引物F:如SEQ ID N0.9所示，下游引物R:如SEQ ID N0.10所示。PCR反应程序:95V，4min ；95°C，2min, 55°C，30s ；72°C, 30s ；72°C, IOmin0
[0099]3.转基因植株花和种子的⑶S染色鉴定
[0100]取Ttl代转基因大豆和野生型大豆叶片、花和种子，分别置于⑶S染色液[50mmol.L-1 憐酸钠缓冲液(ρΗ7.0), I % (v/v) Triton X100, 20% (v/v)甲醇，50mmol.L-1六氰合亚铁酸钾，50mmol.L-1六氰合铁酸钾，ImM X-gluc (G0LDB10，产品号:G1281C) ]，37°C染色12h。70%乙醇脱色后，拍照观察(如图5所示)。图5所示，Ttl代转基因植株花与种子均检测有gus基因表达，T1及T2代转基因种子萌发后也检测出gus基因的表达，说明外源基因可遗传给后代。
[0101]以上培养基或染色液中成分的浓度、质量体积百分比均相对于对应培养基或染色液体积而言。
[0102]4.转基因大豆Basta涂抹鉴定
[0103]选取健康生长的Ttl代转基因大豆和野生型大豆叶片，用棉棒蘸取0.05 % Basta涂抹于半张叶片，5天之后观察叶片并拍照记录(如图6所示)。图6所示，非转基因植株涂抹Basta的叶片表现出失绿，而转基因植株的叶片正常，表明转基因植株具有除草剂抗性，进一步证明植株的转基因特性。
[0104]5.转基因大豆T2代植株中0sPT2基因相对表达量的测定
[0105]半定量RT-PCR (反转录PCR)测定0sPT2基因在上述转0sPT2基因植株T2代植株中的表达量，以大豆看家基因:大豆伸长因子EF-laX56856基因(TefSl)作为内参基因。使用集成凝胶显像系统(GenoSenslSSO，上海勤翔科技有限公司，中国)进行溴化乙锭染色后的凝胶图像获取及分析。设定看家基因TefSl基因的光密度为l，0sPT2基因的光密度与看家基因TefSl基因的光密度比值为0sPT2基因的相对表达量。
[0106]其中，反转录PCR反应中，检测0sPT2基因的引物采用制备444-bp 0sPT2探针引物，上游引物F:如SEQ ID N0.9所示；下游引物R:如SEQ ID N0.10所示；
[0107]检测看家基因TefSl基因，上游引物FT -M SEQ IDN0.11所示；下游引物RT -M SEQIDN0.12 所示。
[0108]为检测大豆T2代植株中0sPT2基因的表达情况，取3个单拷贝转基因植株(12PT2-1，12PT2-2与12PT2-4)及野生型对照植株的叶片及根，分别提取总RNA (参照TaKaRaTrizol Reagent说明书)，按照反转录试剂盒(TaKaRa，货号:DRR047A)的方法将RNA反转录为cDNA，进行半定量RT-PCR反应。20 μ L反应体系包括:10XPCR Buffer2.0 μ L，dNTP miXI.6 μ L (2.5mmoI.L-1)，Tef SI上游引物F、下游引物R和0sPT2基因的上游引物FT和下游引物 RT 各 1.0 μ L(20 μ mol.L-1)，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.2 μ L, cDNA 模板 I μ L，ddH20 补至 20 μ L0 反应程序:95°C,4min ；95°C,2min, 55。。，30s ；72°C,30s ；30 个循环后72°C延伸lOmin。对叶片及根进行TefSl基因表达量和0sPT2基因相对表达量的测定(如图7所示)。由图7可观察到，0sPT2基因在T2代转基因植株叶片及根部中均为超表达。
[0109]6.转基因大豆耐低磷鉴定
[0110] 以上述3个超表达转0sPT2基因大豆T2代株系用于耐低磷试验。三个超表达转0sPT2基因大豆T2代株系(12PT2-1，12PT2-2及12PT2-4) 10天苗龄的阳性植株与对照(WT) 10天苗龄植株定植于含有改良的Hoagland溶液(用NH4Cl替代部分NH4H2PO4使溶液中最终P浓度为20 μ M ;其他离子浓度不变；EC = 2.61dS.m-1)的18-L水桶中(上围直径为30cm)，每桶含有三棵不同株系的T2代植株及一棵对照植株(四棵植株呈正方形排列，对角线距离为26cm)，对营养液进行连续通氧，并每三天更换(用HCl或NaOH调节pH值至
6.5)。每个T2代株系重复10次。温室环境采用人工控制，昼夜温度:28°C昼/20°C夜，光周期:12h 昼/12h 夜(HPS 灯，PPFD:600 μ mol.m_2.s—1)，相对湿度:70 - 80%，CO2 浓度:400 μ M。以标准Hoagland营养液为对照。
[0111]低磷处理期间观察各植株症状(如图8所示)。营养液栽培植株低磷处理10天后，野生型对照叶片边缘开始出现枯斑(如图8A，8C所示)；低磷处理30天后，野生型对照植株叶片边缘枯斑增多，且叶脉也出现枯斑(如图8D，8F所示)；而转基因植株叶片始终未出现枯斑(如图8B，8E所示)。低磷处理75天后，野生型对照植株叶片已全部脱落(如图8G所示)，而转基因植株叶片大部分仍在植株上(如图8G所示)，表明转0sPT2基因植株在低磷条件下生长状态显著优于野生型对照。
[0112]低磷处理30天后测量植株的株闻、根长、生物量及磷含量(如表1及图9A,9B所示)。由表1可知，在低磷胁迫下，转基因植株的株高、根长及生物量均显著高于野生型对照。由图9可观察到，低磷胁迫下转基因植株根、茎、叶中有效磷及全磷含量均显著高于野生型对照。植株成熟后，测定落叶及种子中磷含量(如图9C，9D所示)。由图9C，9D所示，转基因植株落叶及种子中磷含量显著高于野生型对照，表明转基因植株具有较高的磷利用效率。
[0113]低磷处理下，植株进入生殖生长期，对花数、荚数进行测定；种子收获后测定单株种子数及种子重量(如表2所示)。由表2可知，低磷条件下，转基因植株花数、荚数及产量均显著高于野生对照；正常条件下，0sPT2转基因植株花数、荚数及产量与野生型植株和转基因植株无显著差异，表明0sPT2转基因植株在低磷条件的耐受性好，在低磷条件下可显
著增加产量。
[0114]表1.营养液栽培条件下植株营养生长指标的比较
[0115]
【权利要求】
1.一种磷转运蛋白OsPT2基因表达盒，其特征在于:该表达盒序列如SEQ ID N0.2所示。
2.权利要求1所述的磷转运蛋白OsPT2基因表达盒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)设计引物，扩增序列为SEQID N0.1所示的OsPT2基因片段；其中，上游引物Pl:如SEQ ID N0.3所示;下游引物P2:如SEQ ID N0.4所示； 2)将OsPT2基因连接到pMD19-T质粒载体，转化TOPlO感受态细胞，提取阳性重组质粒，进行SacI和XbaI双酶切，回收0sPT2基因片段； 3)进行植物表达载体pBI121SacI和XbaI双酶切，回收pBI121大片段； 4)以连接酶连接上述回收的0sPT2基因片段和pBI121大片段，形成连接产物，以连接产物转化T0P10感受态细胞，37°C过夜培养，挑取单克隆扩大培养，筛选出转化子； 5)提取步骤4)中转化子的阳性重组质粒进行EcoRI及HindIII双酶切，回收小片段，即得到0sPT2基因表达盒； 其中，步骤2)、3)和步骤5)中双酶切体系为:50 μ L体系中10XBufferl5y L，BSA0.5 μ L，DNA15 μ L, Sacll.0 μ L，XbaI1.0 μ L，ddH20 补至 50 μ L ;37°C反应 2h ;双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的片段；
步骤 4)中连接反应体系为=IOXT4Iigase Buffer2.5 μ L, ρΒΙ121 大片段 2 μ L，0sPT2基因片段8 μ L，T4DNA连接酶I μ L，ddH20补至25 μ L。
3.0sPT2基因在磷高效利用转基因植物中的应用，优选地，在磷高效利用转基因大豆中的应用。
4.一种磷高效利用转基因大豆的培育方法，其特征在于将水稻磷转运蛋白基因0sPT2构建至植物表达载体PCAMBIA3301中，获得重组植物表达载体pCAMBIA3301_0sPT2中，通过农杆菌介导的方法导入大豆；具体包括如下步骤: 1)重组植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2的构建:将水稻磷转运蛋白0sPT2基因表达盒构建至植物表达载体PCAMBIA3301中，形成重组植物表达载体pCAMBIA3301_0sPT2 ； 2)0sPT2转基因大豆转化体的获得:以大豆子叶节为外植体，通过农杆菌介导法，将植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2导入大豆基因组中，通过除草剂Bialaphos筛选获得Ttl代转化体； 3)0sPT2转基因大豆T2代阳性植株的获得=Ttl代植株通过自花授粉获得T1代种子，T1代种子萌发后通过PCR及⑶S染色鉴定出阳性植株，阳性植株自花授粉获得T2代种子；T2代种子萌发后通过同样的方法鉴定出阳性植株，获得磷高效利用转基因大豆。
5.一种重组植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2，其特征在于含有权利要求1所述的磷转运蛋白0sPT2基因表达盒和除草剂抗性基因bar基因，水稻磷转运蛋白0sPT2基因表达盒位于到植物表达载体PCAMBIA3301的EcoRI及HindIII酶切位点之间。
6.权利要求5所述的植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2，在磷高效利用转基因植物培育中的应用，优选地，在磷高效利用转基因大豆培育中的应用。
7.—种宿主菌，其特征在于含有权利要求4所述的重组植物表达载体pCAMBIA3301-0sPT2。
8.权利要求7所述的宿主菌在磷高效利用转基因植物培育中的应用，优选地，在磷高效利用转基因大豆培育中的应用。
9.一种磷高效利用转基因大豆OsPT2基因相对表达量的测定方法，其特征在于:以大豆伸长因子EF-laX56856基因TefSl作为内参基因，通过半定量RT-PCR测定OsPT2基因在磷高效利用转基因大豆中的表达量； 其中，使用444-bp OsPT2基因探针的制备引物，上游引物F:如SEQ ID N0.9所示，下游引物R:如SEQ IDN0.10所示； 检测TefSl基因的上游引物FT:如SEQ ID N0.11所示；下游引物RT:如SEQ ID N0.12所示。
10.一种磷高效利用转基因大豆0SPT2基因相对表达量测定的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括如下序列:
444-bp 0sPT2基因探针的制备引物，上游引物F:如SEQ ID N0.9所示，下游引物R:如SEQ ID N0.10 所示； TefSl基因的检测引物，上游引物FT:如SEQ ID N0.11所示;下游引物RT:如SEQ IDN0.12所示。
【文档编号】C12N1/21GK104004755SQ201410232281
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】朱月林, 盖钧镒, 陈国户, 杨立飞 申请人:南京农业大学