定点突变获得的恶臭假单胞菌腈水解酶突变株及其构建方法
【专利摘要】本发明提供了一种高酶活腈水解酶突变株及其制备方法，属于基因工程领域。本发明以恶臭假单胞菌（PseudomonasputidaCGMCC3830）腈水解酶作为模板，再用分子生物学手段对恶臭假单胞菌腈水解酶序列进行饱和定点突变，获得两株酶活提高的阳性转化子Asn40Gly和Phe50Trp，在此基础上进行组合突变，获得组合突变和株Asn40Gly-Phe50Trp。在改造条件下，发现酶活均有所提高，并且热稳定性也有所改善。利用此策略可以大大提高腈水解酶的转化能力，使其应用于医药中间体、食品添加剂以及环境治理方面具有广阔的应用前景。
【专利说明】定点突变获得的恶臭假单胞菌腈水解酶突变株及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及酶活提高的恶臭假单胞菌腈水解酶突变株及其构建方法。
【背景技术】
[0002]腈水解酶是一类能将腈化合物一步水解生成羧酸和氨的催化剂，其立体选择性和区域选择性可用于解决化学工艺中手性催化和区域催化效率低的问题。腈水解酶来源广泛、反应条件温和、特异性高、选择性强，在有机合成领域具有潜在的应用价值。然而，腈水解酶在应用中仍然存在诸多局限，如，比酶活偏低、稳定性较差、底物谱较窄等。因此，获得一株酶活提高的腈水解酶具有重要的工业应用价值。
[0003]在本研究中，我们首先通过生物信息学手段对高酶活的腈水解酶基因进行序列比对，找出活性中心附近的一些潜在的关键位点，再对这些位点进行饱和突变，构建突变文库，选择合适的载体和宿主进行表达，高通量筛选出酶活较高的突变株。再以此突变株为模板，进行下一步的组合突变，直至达到预期的要求。
[0004]在前期工作中，发明人已成功将恶臭假单胞菌腈水解酶在大肠杆菌中高效表达。本发明以大肠杆菌作为宿主菌株、利用半理性设计改造的方法，以期获得酶活力得到显著提高的恶臭假单胞菌腈水解酶突变株。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于，通过基因工程手段对恶臭假单胞菌腈水解酶基因进行饱和突变改造，使改造后的腈水解酶的酶活性有所提高，最终能达到工业化生产的要求。
[0006]本发明提供恶臭假单胞菌putida CGMCC3830)腈水解酶一种定点饱和突变改造的腈水解酶突变株，所述的腈水解酶突变株具有更好的催化活力。该菌株于2010年5月11日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.3830，分类命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
[0007]本发明提供了一种定点饱和突变改造的恶臭假单胞菌腈水解酶突变体，由恶臭假单胞菌putida CGMCC3830)腈水解酶基因出发，通过定点饱和突变、构建突变体库而筛选获得；所述的腈水解酶的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0.2;对应的腈水解酶基因序列SEQ ID N0.1 ;所述的腈水解酶突变体的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5均由370个氨基酸组成。
[0008]本发明所述的腈水解酶突变株，是在恶臭假单胞菌基因上进行饱和突变得到，主要是突变位点在第40位的天冬酰胺和第50位的苯丙氨酸。
[0009]能表达生产所述腈水解酶突变体的细胞系或基因工程菌也为本专利要求保护的范围。
[0010]本发明提供了一种腈水解酶突变体的制备方法，以SEQ ID N0.1所示的序列出发，将确定突变的氨基酸即第40位的天冬酰胺和第50位的苯丙氨酸所对应的核苷酸以NNN代替原有密码子，设计简并引物，进行全质粒PCR反应，构建定点饱和突变PCR产物，反应结束后，用Dpn I消化原始模板,割胶回收,纯化PCR产物,热击倒入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)感受态中，涂布于含有卡娜霉素和氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，得到饱和突变库，筛选出酶活力提高的突变体，所述的腈水解酶突变体为Asn40Gly和Phe50Trp。
[0011]以Asn40Gly作为突变模板，以Phe50Trp突变体的引物作为引物，组合突变，得到酶活力提高的腈水解酶组合突变体ASn40Gly-Phe50Trp。
[0012]本发明提供的腈水解酶突变体酶活力高，应用于医药中间体、食品添加剂以及环境治理方面具有广阔的应用前景。
[0013]
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1腈水解酶突变体酶活力检测图2腈水解酶突变体最适宜pH检测。
[0015]图3腈水解酶突变体的热稳定。
[0016]本发明的优点和有益效果
通过定点饱和突变，对恶臭假单胞菌(AeWOrOfflmas putida CGMCC3830)腈水解酶活性中心周边的第40位的天冬酰胺和第50位的苯丙氨酸进行改造，获得的腈水解酶突变株，在酶活和热稳定性上有所提闻，这样提闻了生广效率。本发明所获得的突变株分别是Asn40Gly, Phe50Trp 和 Asn40Gly_Phe50Trp，酶活均有所提高，其中 Asn40Gly_Phe50Trp 酶活提高50%，在50°C下热稳定性提高31%。改造后腈水解酶突变株在医药中间体、食品添加剂以及环境治理方面具有广阔的应用前景。
[0017]
【具体实施方式】
[0018]上述酶活提高的腈水解酶突变株的构建方法，包括以下步骤:
I)恶臭假单胞菌putida CGMCC3830)腈水解酶工程菌的构建对恶臭假单胞菌腈水解酶基因通过上游引物和下游引物扩增目的基因:
上游引物:5’ -CCGGAATTCATGGTTACGTACACGAATAAGTTCA-3’，带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点；
下游引物:5’ -CCCAAGCTTGACCGGGGACTTCCAAGCTATACGTT-3’，带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点；
以恶臭假单胞菌基因组作为模板，在上下游引物参与进行PCR反应，PCR条件为94°C预变性4 min;94°C变性30 s，58°C退火30 s，72°C延伸90 S，30个循环；72°C终延伸10 min。获得目的片段，割胶回收目的片段。与质粒PMD-19T进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，将转化细胞涂布到含有100 ug/ml氨苄LB平板上，筛选出阳性克隆，提取质粒，用限制性内切酶进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET-28a进行连接，将转化产物转化到大肠杆菌Rosetta-gami (DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有50ug/ml卡娜霉素和25 ug/ml氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒。
[0019]2)恶臭假单胞菌腈水解酶氨基酸序列的分析及饱和突变位点的确定
对恶臭假单胞菌腈水解酶氨基酸序列与其它的腈水解酶序列进行比对分析，腈水解酶的催化活性位点分别是第48位的谷氨酸、第131位的赖氨酸和第165位的半胱氨酸，找出活性位点周边差异性比较大的位点:第40位的天冬酰胺和第50位的苯丙氨酸。
[0020]3)根据选取的位点进行饱和突变库的建立及突变体的筛选
以连有目的片段的重组质粒作为模板，分别对第40位的天冬酰胺和50位的苯丙氨酸进行饱和突变，即对40位和50位氨基酸对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子，设计简并引物，进行全质粒PCR反应。
[0021]饱和突变引物序列如下:
【权利要求】
1.具有更高催化活力的一株腈水解酶突变株的氨基酸序列，其特征在于如SEQID N0.3所示恶臭假单胞菌腈水解酶氨基酸序列中活性中心周边的40位的天冬酰胺突变为甘氨酸: 1METValThrTyrThrAsnLysPheLysAlaAlaThrValGlnAlaGluProValTrpPhe 21AspAlaAlaAlaThrValGluLysThrIIeGlyLeuIIeLysGluAlaAlaAspAsnGly 41AlaGlnIIeIleAlaPheProGluValPhelIeProGlyTyrProTyrHisiIeTrpLeu 61AspSerProPheAlaGlyMETGlyLysPheAlaThrArgTyrHisGluGlnSerLeuSer 81IIeAspSerProLeuIIeThrArgIIeGlnGluAlaAlaGluSerAsnAsnIIeCysVal 101VallleGlyPheSerGluArgAspGlyGlySerLeuTyrMETSerGlnLeuIlelleAsp 121GluLysGlyLysIIeValAlaHisArgArgLysLeuLysProThrHisValGluArgThr 141ValTyrGlyGluGlyAspGlySerAspIIeAlaValHisAspMETProIIeGlyArgVal 161GlyAlaLeuAsnCysTrpGluHisPheGlnThrProThrLysTyrAlaMETTyrAlaMET 181HisGluGlnValHisileAlaAlaTrpProGlyMETSerLeuTyrGlnProGluValPhe 201AlaPheSerSerGluAlaGlnLeuValAlaThrGlnMETTyrAlaMETGluGlyGlnThr 221PheValLeuCysSerThrGlnValValGlyLysAlaAlaLeuGluPhePheCysGluAsn 241GluMETHisLysLysLeuIIeGlyTyrGlyGlyGlyPheAlaGlnIIePheGlyProAsp 261GlyArgProLeuAlaGluArgLeuProAlaAspGlyGluGlyIIeLeuTyrAlaGluIIe 281AspLeuAlaGlnIIeThrMETAlaLysGlnAlaAlaAspProValGlyHisTyrSerArg 301ProAspValPheSerLeuGlnPheAsnAsnGlnAlaGlnSerProValLysArgLeuLys 321AspMETGlyLysHisileGluSerGluGluValPheSerSerIIeSerGlnGlyThrVal 341ProGlyLeuThrTyrSerLeuGluValProGlyProPheLeuGlnLysSerLeuAlaGln 361PheGluProValLysValHisGluGluSer。
2.具有更高催化活力的一株腈水解酶突变株的氨基酸序列，其特征在于如SEQID N0.4所示恶臭假单胞菌腈水解酶氨基酸序列中活性中心周边的50位的苯丙氨酸突变为色氨酸: 1METValThrTyrThrAsnLysPheLysAlaAlaThrValGlnAlaGluProValTrpPhe 21AspAlaAlaAlaThrValGluLysThrIIeGlyLeuIIeLysGluAlaAlaAspAsnAsn 41AlaGlnIIeIleAlaPheProGluValTrpIIeProGlyTyrProTyrHisiIeTrpLeu 61AspSerProPheAlaGlyMETGlyLysPheAlaThrArgTyrHisGluGlnSerLeuSer 81IIeAspSerProLeuIIeThrArgIIeGlnGluAlaAlaGluSerAsnAsnIIeCysVal 101VallleGlyPheSerGluArgAspGlyGlySerLeuTyrMETSerGlnLeuIlelleAsp 121GluLysGlyLysIIeValAlaHisArgArgLysLeuLysProThrHisValGluArgThr 141ValTyrGlyGluGlyAspGlySerAspIIeAlaValHisAspMETProIIeGlyArgVal 161GlyAlaLeuAsnCysTrpGluHisPheGlnThrProThrLysTyrAlaMETTyrAlaMET 181HisGluGlnValHisileAlaAlaTrpProGlyMETSerLeuTyrGlnProGluValPhe 201AlaPheSerSerGluAlaGlnLeuValAlaThrGlnMETTyrAlaMETGluGlyGlnThr 221PheValLeuCysSerThrGlnValValGlyLysAlaAlaLeuGluPhePheCysGluAsn 241GluMETHisLysLysLeuIIeGlyTyrGlyGlyGlyPheAlaGlnIIePheGlyProAsp 261GlyArgProLeuAlaGluArgLeuProAlaAspGlyGluGlyIIeLeuTyrAlaGluIIe281AspLeuAlaGlnIIeThrMETAlaLysGlnAlaAlaAspProValGlyHisTyrSerArg 301ProAspValPheSerLeuGlnPheAsnAsnGlnAlaGlnSerProValLysArgLeuLys 321AspMETGlyLysHisileGluSerGluGluValPheSerSerIIeSerGlnGlyThrVal 341ProGlyLeuThrTyrSerLeuGluValProGlyProPheLeuGlnLysSerLeuAlaGln 361PheGluProValLysValHisGluGluSer。
3.具有更高催化活力的一株腈水解酶突变株的氨基酸序列，其特征在于如SEQ ID N0.5所示恶臭假单胞菌腈水解酶氨基酸序列中活性中心周边的40位的天冬酰胺突变为甘氨酸和50位的苯丙酰胺突变为色氨酸: IMETValThrTyrThrAsnLysPheLysAlaAlaThrValGlnAlaGluProValTrpPhe 21AspAlaAlaAlaThrValGluLysThrIIeGlyLeuIIeLysGluAlaAlaAspAsnGly 41AlaGlnIIeIleAlaPheProGluValTrpIIeProGlyTyrProTyrHisiIeTrpLeu 61AspSerProPheAlaGlyMETGlyLysPheAlaThrArgTyrHisGluGlnSerLeuSer 81IIeAspSerProLeuIIeThrArgIIeGlnGluAlaAlaGluSerAsnAsnIIeCysVal 101VallleGlyPheSerGluArgAspGlyGlySerLeuTyrMETSerGlnLeuIlelleAsp 121GluLysGlyLysIIeValAlaHisArgArgLysLeuLysProThrHisValGluArgThr 141ValTyrGlyGluGlyAspGlySerAspIIeAlaValHisAspMETProIIeGlyArgVal 161GlyAlaLeuAsnCysTrpGluHisPheGlnThrProThrLysTyrAlaMETTyrAlaMET 181HisGluGlnValHisileAlaAlaTrpProGlyMETSerLeuTyrGlnProGluValPhe 201AlaPheSerSerGluAlaGlnLeuValAlaThrGlnMETTyrAlaMETGluGlyGlnThr 221PheValLeuCysSerThrGlnValValGlyLysAlaAlaLeuGluPhePheCysGluAsn 241GluMETHisLysLysLeuIIeGlyTyrGlyGlyGlyPheAlaGlnIIePheGlyProAsp 261GlyArgProLeuAlaGluArgLeuProAlaAspGlyGluGlyIIeLeuTyrAlaGluIIe 281AspLeuAlaGlnIIeThrMETAlaLysGlnAlaAlaAspProValGlyHisTyrSerArg 301ProAspValPheSerLeuGlnPheAsnAsnGlnAlaGlnSerProValLysArgLeuLys 321AspMETGlyLysHisileGluSerGluGluValPheSerSerIIeSerGlnGlyThrVal 341ProGlyLeuThrTyrSerLeuGluValProGlyProPheLeuGlnLysSerLeuAlaGln 361PheGluProValLysValHisGluGluSer。
【文档编号】C12N15/60GK104130998SQ201410244226
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】龚劲松, 熊雷, 许正宏, 李恒, 史劲松, 孙文敬, 周强 申请人:江南大学, 江西省德兴市百勤异Vc钠有限公司