枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为保藏编号CGMCC No.3665菌株或其直接传代物，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的菌株能够有效的分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶，能够防治梨黑斑病，是有效的生物防治剂，应用前景十分广阔。
CGMCC No3665
20100312
【专利说明】枯草芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物和化肥化工领域，具体的涉及一种能够分泌β-1，3-1，4-葡聚 糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 我国是世界第一梨果生产大国，鲜梨产量约占世界总产量的2/3。许多品种如雪 花梨、库尔勒香梨、鸭梨等以其优质而在国际享有盛誉。由半知菌亚门交链孢属链格孢霉 [Alternaria alternate (Fr. )Keissler]引起的黑斑病是梨采后储藏期的主要病害之一， 影响梨果的储藏时间以及品质，造成严重的经济损失。
[0003] 对于梨采后病害的防治，目前仍以低温贮藏和化学保鲜剂为主，但不当的低温容 易造成梨果冷害的发生，长期使用化学保鲜剂会促使某些病原真菌的抗性增加，且农药残 留问题也对公众的健康和环境造成威胁。因此，安全、无污染、环境友好型生物保鲜技术越 来越受到人们的重视.因此，如何得到能够防治梨黑斑病的生物保鲜剂是本领域技术人员 亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，优选的，所述的枯 草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)为保藏编号CGMCC No. 3665菌株或其直接传代物，保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0005] 本发明另一方面还涉及一种含有枯草芽孢杆菌（Bacillus substilis)的菌剂。
[0006] 本发明另一方面还涉及上述菌剂在防治梨黑斑病中的应用。
[0007] 在本发明的另一方面，还涉及所述枯草芽孢杆菌（Bacillus substilis)在产 β -1，3-1，4-葡聚糖酶中的应用，优选的，所述的β -1，3-1，4-葡聚糖酶的氨基酸序列为 SEQ ID NO. 2。
[0008] 本发明的菌株能够有效的分泌β-1，3_1，4-葡聚糖酶，能够防治梨黑斑病，是有 效的生物防治剂，应用前景十分广阔。
[0009] 微生物信息
[0010] 本发明所筛选的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) J18已经保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 3665,保藏地址为：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2010年03月12日。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1 :重组蛋白的Western Blot检测
[0012] 图2 :SDS_PAGE分析纯化后的重组蛋白
[0013] M :蛋白质分子量标准；1，2 :亲和纯化后的重组蛋白
[0014] 图3 :重组酶对梨链格孢霉菌丝的抑制作用
[0015] 图4 :重组酶在PDA平板上对梨链格孢霉的抑制
[0016] 图5 :重组酶对梨黑斑病的防治
[0017] 左：重组酶；右：对照（无菌水）
[0018] 图6 :重组酶对梨黑斑病的防治效果
[0019] 左：对照（只喷施病原菌）；右：重组酶处理
[0020]
[0021]
【具体实施方式】 [0022]
[0023] 实施例1
[0024] 1.菌株的分离
[0025] 从四川成都梨果园土样中筛选到一株枯草芽孢杆菌（Bacillus substilis) J18， 该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国微生物菌种保藏中心 登记编号 CGMCC No. 8343。
[0026] 2.试验方法
[0027] 2. 1引物的设计与合成
[0028] 通过在GenBank文库中进行序列查找与同源性比对，根据已登录的β-1，3-1， 4-葡聚糖酶的基因序列及表达载体pET28a(+)的多克隆位点设计引物，在正反向引物5'端 分别引入BamH I和Xho I酶切位点，并加入相应的保护性碱基，由上海生物工程公司合成。
[0029] 引物序列如下：
[0030] 上游引物 Gl :5 ' -CGGGATCCATGCAAACAGGTGGATCG-3 '
[0031] 下游引物 G2 :5 ' -CCGCTCGAGGCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3 '
[0032] 2. 2 β _1，3-1，4_匍聚糖酶基因的克隆
[0033] 2. 2. 1枯草芽孢杆菌（Β. substilis) J18基因组DNA的提取
[0034] 对枯草芽孢杆菌J18基因组DNA进行提取，按照试剂盒说明书进行。具体步骤如 下：
[0035] (1)将枯草芽孢杆菌J18以1 % (V/V)的接种量接种于LB培养基，在37°C条件下、 200r/min振荡过夜培养。吸取IOmL菌液5000r/min离心IOmin,保留菌体。
[0036] (2)用 STE(lmM EDTA，pH8. 0 ;10mM Tris-HCl，pH8. 0 ;0· IM NaCl)洗涤一次， 5000r/min 离心 lOmin，弃上清。
[0037] (3)力卩 4mL TE(lmmol/L EDTA，pH8. 0 ;10mmol/L Tris-HCl，pH8. 0)悬浮沉淀，并加 8 μ L 溶菌酶溶液（50mg/mL)，37°C 静置 20min。
[0038] (4)力卩 10 μ LRnase (10mg/mL)，再加入 0· 5mL 的 10% SDS 溶液，37°C静置 30min。
[0039] (5)加 1(^1^蛋白酶1((2〇11^/1^)，371：静置6〇1^11。
[0040] (6)加入相同体积的Tris-饱和酚溶液，混勻，8000r/min离心5min，吸取上清转移 至新的I. 5mLEP管中。
[0041] (7)向上清液中加入相同体积的酚：氯仿，混勻，8000r/min离心5min，吸取上清 转移至新的1.5mLEP管中。
[0042] (8)向上清液中加入1/5体积、浓度为lOmol/L的醋酸铵和2倍体积无水乙醇，颠 倒混合，静置l〇min，离心沉淀DNA。用70%乙醇洗涤，吸干，加500 μ L TE溶解DNA，-20°C 保存。
[0043] 2· 2· 2 β -I，3-1，4-葡聚糖酶基因 PCR扩增
[0044] 以提取的枯草芽孢杆菌（Β. subtilis) J18的基因组DNA为模板，Gl和G2为引物 进行PCR扩增，在0. 2mL的PCR小管中加入以下成分。
[0045] PCR反应体系（20 μ L)如下：
[0046]
【权利要求】
1. 一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，优选的，所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)为保藏编号CGMCC No. 3665菌株或其直接传代物，保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心。
2. -种含有上述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)的菌剂。
3. 上述菌剂在防治梨黑斑病中的应用。
4. 上述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)在产￠-1,3-1,4-葡聚糖酶中的应用，优 选的，所述的￠-1,3-1,4-葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
【文档编号】C12N9/24GK104371947SQ201410246944
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】宋水山, 黄亚丽, 李惠荣, 贾振华, 宋聪, 马宏, 黄媛媛 申请人:河北省科学院生物研究所