一株假单胞菌诱变菌株及其在生产(r)-3-羟基丁酸中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于发酵工程【技术领域】，涉及一株诱变菌株 Psedomonas sp.DS1001a及该菌株所产解聚酶在转化生产(R)-3-羟基丁酸中的应用。该菌株是以从吉林省土壤中筛选出的假单胞菌DS1001为出发菌株，通过紫外诱变选育出的高产聚3-羟基丁酸解聚酶的诱变菌株。该菌株所产聚3-羟基丁酸解聚酶能够在体外高效降解聚3-羟基丁酸，转化生成(R)-3-羟基丁酸单体，8h反应产率可达2.848g/L，生产效率明显高于利用体内生物酶生产3-羟基丁酸的效率；而且本发明提供的菌株发酵碳源及酶转化底物可以为聚3-羟基丁酸废弃物或工业下脚料，有利于实现(R)-3-羟基丁酸的大量廉价生产，并能够实现对聚3-羟基丁酸材料的高值化转化。
CGMCC No.4366
2010.11.25
CGMCC No.8638
2013.12.25
【专利说明】[0001] 一株假单胞菌诱变菌株及其在生产（R)-3-羟基丁酸中的 应用
【技术领域】
[0002] 本发明属于发酵工程【技术领域】，具体涉及一株高产聚3-羟基丁酸解聚酶的诱变 菌株sp. DSlOOla及利用该诱变菌株sp. DSlOOla所产解聚酶降解 聚3-羟基丁酸转化生产（R) -3-羟基丁酸单体。
[0003]
【背景技术】
[0004] (R)-3-羟基丁酸单体是具有手性活性的酮体，其分子式为C4H 803，分子量为 104. lg/mol，溶于水和乙醇等溶剂。（R)-3-羟基丁酸具有抗菌、杀虫和抗病毒活性；其作为 手性模块可以合成精细化学品，如抗生素、维生素、芳香烃和信息素等；由于（R)-3_羟基丁 酸在人体内半衰期短且人体对其具有良好的耐受性，因此可以直接用作口服药物；在缺糖 的条件下，（R)-3_羟基丁酸可以部分保护和稳定神经细胞；也有一些证据表明，（R)-3-羟 基丁酸可作为增强心脏的效率，防止脑损伤，表现出巨大的潜在药用价值。
[0005]目前，手性羟基脂肪酸的主要生产方法为化学法，包括化学方法直接合成 (R)-3-羟基丁酸和化学方法降解聚3-羟基丁酸酯生产（R)-3-羟基丁酸。化学方法直接合 成（R)-3_羟基丁酸需要高温、高压的反应条件以及昂贵的手性金属催化剂等；而化学方法 降解聚3-羟基丁酸生产（R)-3-羟基丁酸，需要耗费大量的有机溶剂，较长的反应时间和高 纯度的聚3-羟基丁酸酯作为起始物，并极易产生消旋化。近年来生物法制备（R)-3-羟基 丁酸的研究备受关注，Lee等人构建了含有异源聚3-羟基丁酸合成和降解途径的基因工程 菌，报道了该菌株以葡萄糖作为碳源，利用体内生物酶首先合成聚羟基脂肪酸酯并进一步 使其降解为（R)-3_羟基丁酸单体，产量可以达到0. 18g/L_h。之后也相继有类似的报道出 现，但该方法目前还处于实验室水平，如果进入工业化大生产仍然存在成本高、产率低等问 题。
[0006] 从上世纪60年代开始，得益于全世界对环境问题的重视，关于聚3-羟基丁酸等生 物可降解高分子材料的研究受到广泛关注，并于近十几年得到快速发展。目前PHB的合成 和改性工艺成熟，其产品已经在工业、农业和医疗等领域得到应用；而在降解方面人们已经 从自然界中分离到了多种对聚3-羟基丁酸具有降解作用的菌株，并对其降解酶和降解机 制进行了深入的研究。在此基础上可以设想如果利用这些菌株产生的聚3-羟基丁酸降解 酶，对聚3-羟基丁酸废弃物或聚3-羟基丁酸工业下脚料进行降解，使其转化为（R)-3-羟 基丁酸单体，则可以大大降低（R)-3_羟基丁酸的生产成本。本实验室吴晓岩等进行了这方 面工作的探索，利用门多萨假单胞菌DSWY0601证实了该方法的可行性，发酵液与聚3-羟基 丁酸粉末完全反应48h后3-羟基丁酸产量可达1. 087g/L。
[0007] 本发明提供的诱变菌株sp.DSlOOla较原始菌株及门多萨假单胞菌 DSWY0601活性更高，其产生的降解酶仅经过8h反应，就可以产生（R) -3-羟基丁酸2. 848g/L，相当于0.356g /L_h，生产效率明显高于前文叙述的利用体内生物酶或体外生物酶生产 (R)-3-羟基丁酸的效率；而且本发明提供的菌株发酵产酶时以聚3-羟基丁酸废弃物或聚 3_羟基丁酸工业下脚料为碳源，无需添加其它碳源或诱导剂，转化底物也可以是聚3-羟基 丁酸工业下脚料，因此相比以葡萄糖为碳源转化生产（R)-3-羟基丁酸的方法即节约了成 本，又能够实现对聚3-羟基丁酸消费品的二次回收利用，更加环保，实现了聚3-羟基丁酸 材料的高值化转化。
[0008]
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的是提供一株具有较强聚3-羟基丁酸降解活性的诱变菌株假单 胞菌DSlOOla，另一个目的是提供利用该菌株所产的聚3-羟基丁酸解聚酶在体外降解聚 3_羟基丁酸以获得（R)-3_羟基丁酸中的应用。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 1.采用紫外诱变技术选育高产聚3-羟基丁酸解聚酶的菌株 在无菌的平皿中倒入5mL处于对数生长期的sp. DS1001菌液，置于磁力 搅拌器上搅拌，在垂直距离为30cm的15W紫外灯(波长为254nm)下分别照射0、30、60、90、 120、150s。将不同照射时间的菌液梯度稀释后，涂布于聚3-羟基丁酸唯一碳源培养基中， 37°C避光培养48h，计算致死率并观察菌落周围透明圈的大小。挑选致死率在75%左右，而 且透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，接种到以聚3-羟基丁酸为唯一碳源的液体培 养基中，每隔24h取样测定聚3-羟基丁酸解聚酶活力，选取活力最高的菌株。
[0011] 2.聚3-羟基丁酸解聚酶的制备方法 将菌株DSlOOla以5%接种量接入到产酶液体培养基中，27. 5°C、130rpm恒温振荡培 养，培养基成分为：聚 3-羟基丁酸 0. 2%，NH4C1 0. 15%,Na2HP04.12H20/KH2P04 1.45/0 . 48%， MgS04 0? 07%,CaCl2.2H20 0? 0005%，培养基初始pH8. 3,装液量 116. 5/500mL三角瓶。
[0012] 发酵达30h后将发酵液置于14000rpm离心机中4°C条件下离心10min，所得上清 液即为粗酶液。
[0013] 3.聚3-羟基丁酸解聚酶粗酶液降解聚3-羟基丁酸产（R)-3-羟基丁酸的条件 在50mL离心管中加入30mL粗酶液及200mg聚3-羟基丁酸粉末，50°C振荡保温8h后， 采用高效液相色谱测定（R)-3-羟基丁酸含量，同时可更换酶液继续转化反应。
[0014] 本发明的优点和有益效果是：提供的诱变菌株sp. DSlOOla聚3-轻 基丁酸解聚酶活性高，经过紫外诱变和发酵条件的优化，活性比原始菌株提高了 7. 9倍。体 外酶解聚3-羟基丁酸产（R)-3-羟基丁酸的能力更强，其产生的降解酶经过8h反应，可产 生（R)-3_羟基丁酸2.848g/L，相当于0.356g /L.h;而且本发明提供的菌株发酵产酶时以 聚3-羟基丁酸废弃物或聚3-羟基丁酸工业下脚料为碳源，无需添加其它碳源或诱导剂，转 化底物也可以是聚3-羟基丁酸工业下脚料，因此可实现（R)-3-羟基丁酸的大量廉价生产。
[0015] 保藏说明： 聚3_轻基丁酸降解菌株sp.DS1001、 一株高产聚3-轻基丁酸解聚酶的诱变菌株假单胞菌sp. )DSlOOla,已 于2013年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京 朝阳区大屯路，保藏号为CGMCC No. 8638。
[0016]
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1诱变菌株与原始菌株的活性比较图。
[0018] 图2诱变菌株的产酶曲线。
[0019]图3菌株产酶培养条件优化。A:温度；B:接种量；C:装液量；D :pH值。
[0020] 图4菌株产酶培养基组成优化。A:碳源；B:氮源；C:磷源；D :Mg2+。
[0021] 图5粗酶液的最适反应温度测定曲线。
[0022] 图6粗酶液的最适反应pH值测定曲线。
[0023] 图7 (R)-3-羟基丁酸的高效液相色谱图。
[0024] 图8反应液中（R)-3_羟基丁酸含量及pH值随时间变化曲线。
[0025] 具体实施例
[0026] 借助下列实施例更详细的说明本发明，但显然，本发明的范围不受限于这些实施 例。
[0027] 实施例1从土壤中筛选出的聚3-轻基丁酸降解菌株sp. DS1001 采用唯一碳源法，从吉林省啤酒厂土壤中筛选出对聚3-羟基丁酸具有降解作用的菌 株-假单胞菌sp. DS1001，其特征在于菌落呈圆形，黄白色，表面光滑无皱 纹，边缘较整齐，表面较湿润，易挑起；菌体呈短杆状，革兰氏阴性，有鞭毛，无芽孢和荚膜； 菌株能够以聚乳酸、聚3-羟基丁酸或聚己内酯等高分子化合物为唯一碳源生长，并对这些 化合物具有高效的降解作用；已于2010年11月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心保藏，地址：北京朝阳区大屯路，保藏号为CGMCC No. 4366。
[0028] 实施例2以sp. DS1001为出发菌株通过紫外诱变筛选出 sp. DSlOOla (1) 选择生长良好的外汉避沿as sp. DS1001斜面菌种接入液体培养基，当菌种生长至 对数生长期后，取5mL菌液加入到无菌平皿中； (2) 将平皿置于磁力搅拌器上搅拌，在垂直距离为30cm的15W紫外灯(波长为254nm) 下分别照射0、30、60、90、120、150s。将不同照射时间的菌液梯度稀释后，涂布于聚3-羟基 丁酸唯一碳源培养基中，37°C避光培养48h; (3) 计算致死率，挑选致死率在75%左右的90s作为诱变时间，在此诱变时间的平板中 挑选透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株； (4) 将挑选的菌株接种到以聚3-羟基丁酸为唯一碳源的液体培养基中，每隔24h 取样测定聚3-羟基丁酸解聚酶活力，与原始菌株比较，选取活力最高的菌株，命名为 sp. DSlOOla。该菌株菌落呈圆形，颜色为白色，表面光滑无皱纹，边缘较整齐， 表面较湿润，易挑起；菌体呈短杆状，革兰氏阴性，有鞭毛，无芽孢和荚膜；诱变菌株在菌落 形态上变化不大，但对聚3-羟基丁酸的降解能力增强，其发酵液的最高聚3-羟基丁酸解聚 酶酶活力比原始菌活力提高了 51%(附图1)。该菌株已于2013年12月25日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京朝阳区大屯路，保藏号为CGMCC No. 8638。
[0029] 实施例3粗酶液的制备及产酶条件的优化 粗酶液制备采用液体摇瓶发酵法，发酵30h后将发酵液置于14000rpm离心机中4°C条 件下离心lOmin，所得上清液即为粗酶液。
[0030] 液体摇瓶发酵的培养条件和培养基组成均以单因素和响应面实验法进行了优化， 具体优化过程如下： (1)产酶时间曲线的测定 菌株在基本培养基(聚 3-羟基丁酸：0. 15% ;Na2HP04 ? 12H20 :1. 194% ;KH2P04 : 0 . 5 54% ; NH4C1 :0? 1% ;MgS04 ? 7H20 :0? 05% ;CaCl2 ? 2H20 :0? 0005%，121 °C高压蒸汽灭菌 20 min)中发 酵，每6 h取发酵液测酶活，绘制发酵时间-酶活曲线（图2)。结果显示培养初期发酵液中 聚3-羟基丁酸解聚酶活性迅速上升，在培养30h时酶活最高，并且随着发酵时间的延长，发 酵液中酶活下降，确定产酶时间为30h。
[0031] (2)菌株培养条件的单因素优化 对菌株的产酶条件进行单因素条件优化，优化了培养温度、接种量、装液量和培养基的 初始pH。实验确定该菌株的最适产酶温度为30 °C，最适产酶接种量为5%，最适产酶装液量 为100 mL/500 mL，最适产酶pH值为8.0 (图3)。接种量对菌株产酶的影响较小，温度及装 液量对酶活性影响较大，菌株在中性和碱性培养条件下发酵液都保持较高的活性，但在酸 性条件下酶活较低。
[0032] (3)培养基的单因素优化 对菌株产酶的培养基条件进行优化，实验确定菌株最适产酶培养基条件为：〇. 15% PHB，0? 2% NH4C1，1. 2/0. 45% Na2HP04 ? 12H20/KH2P04,0 . 07% MgS04 (图 4)，另外培养基中还 加入0. 0005% CaCl2 ? 2H20,但是Ca2+的有无对菌株产酶的影响不大。
[0033] (4)产酶条件的响应面优化 根据单因素条件的优化结果，利用响应面的中心组合实验设计进行进一步的优化。设 计三因素五水平的响应面分析试验，以培养温度、pH值、装液量为自变量，分别设为X2， X3，每个自变量的五个水平如表1进行编码。
[0034] 表1中心组合试验设计中自变量的范围
【权利要求】
1. 一株高产聚3-轻基丁酸解聚酶的诱变菌株假单胞菌(Aet/offioaas sp. )DS1001a， 其特征在于菌落呈圆形，白色，表面光滑无皱纹，边缘较整齐，表面较湿润，易挑起；菌体呈 短杆状，革兰氏阴性，有鞭毛，无芽孢和荚膜；较原始菌株降解聚3-羟基丁酸的能力更强， 该菌株已于2013年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地 址：北京朝阳区大屯路，保藏号为CGMCC No. 8638。
2. 权利要求1所述的假单胞菌在发酵生产聚3-羟基丁酸解聚酶中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵所用的培养基成分为：聚3-羟基丁酸 0? 2%，NH4C1 0? 15% ; Na2HP04.12H20/KH2P0 4 1. 45 /0 . 48%，MgS04 0? 07% ;CaCl2.2H20 0? 0005%。
4. 如权利要求2-3所述的应用，其特征在于，所述发酵条件为：接种量5%，培养温度 27. 5°C、培养基初始pH 8. 3,装液量20%-30%，摇床转速130rpm，培养时间30h。
5. 权利要求1所述的假单胞菌在转化生产（R)-3-羟基丁酸中的应用。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，利用菌株发酵得到的粗酶液在最适反应条 件下降解聚3-羟基丁酸底物转化生成（R)-3-羟基丁酸单体。
7. 如权利要求5-6所述的应用，其特征在于，所述最适反应条件为反应温度50°C、反应 pH 为 8. 0。
【文档编号】C12R1/38GK104328062SQ201410260125
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】李凡, 陈珊, 张春雨 申请人:东北师范大学