一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法，利用的是实时荧光定量PCR技术，利用该方法可以简单、快速、准确的检测转基因烟草中外源基因拷贝数。本发明公开了一对引物，由如下(1)和(2)所示的DNA分子组成：(1)SEQ?ID?No.3所示的DNA分子；(2)SEQ?ID?No.4所示的DNA分子。本发明选择烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因，通过SYBR?GreenⅠ实时荧光定量PCR技术检测转基因烟草中外源基因的拷贝数。本发明公开的方法可以为今后转基因烟草的拷贝数分析提供一种新的思路，满足基因工程中对优良转化植株的筛选需求。
【专利说明】一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法；特别涉及一种利用实时荧光定量PCR技术检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]近年来，植物转基因技术被广泛的应用于生产药用蛋白、改善作物品质、提高作物产量等领域的研究。目前植物转基因所采用的方法主要是根瘤农杆菌介导法，但是农杆菌所携带的含有目的基因的T-DNA区域是随机的插入受体植物基因组中的，因而得到的转基因植株往往含有一到多个拷贝的外源基因。转基因植物中外源基因的拷贝数是影响该基因的表达量的关键因素，多拷贝的外源基因会直接导致基因沉默或者不能稳定表达。烟草(Nicotiana tabacum)是一种双子叶的爺科的植物，目前广泛的作为基因工程研究的模式植物，而转基因烟草中外源基因的拷贝数是直接影响目的基因的表达水平和稳定遗传的关键因 素，因此，鉴定出转基因烟草中外源基因的拷贝数是进行后续研究的基础。
[0003]目前，在植物的遗传转化后期的研究中，确定外源基因是否整合到转化植株基因组上，以及确定转化植株的拷贝数对于后期的研究是非常重要的，传统的方法主要是使用Southern杂交，该方法的准确性已经得到了普遍的认可，但是该方法费时费力、每个泳道需要10-30yg的DNA样品等缺点，而且如果外源基因在插入转化植物基因组时发生重组，造成限制性酶切位点的丢失，就不能用Southern杂交进行拷贝数的检测，该方法需要昂贵的试剂，花费的时间较多，需要的DNA材料也较多，而植物组培分化形成的抗性苗往往较弱不适于大量取样，也存在鉴定出的多拷贝插入点不准确等缺点。实时荧光定量PCR方法是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料或者特异性的荧光探针，实时监测反应体系中荧光量的变化，获得达到一定荧光量(阈值)所需的循环数Ct。通过已知浓度的标准品及其对应的Ct值制作标准曲线，就可以准确的对未知样品进行定量。相比于Southern杂交，该方法方便、快捷、需要的DNA量较少、且不需要使用放射性物质，由于该方法的特异性强，因而得到的实验结果更加准确真实。实时荧光定量PCR不仅可以对特定的T-DNA序列进行扩增，也可以对转基因品系中基因重组进行检测。由于植物的生长周期较长，实时荧光定量方法使用较少的材料就可以进行检测，因此在植物培养的早期就可以进行检测筛选，避免了大量组培的工作。因而，实时荧光定量PCR技术是一种可行的转基因植株拷贝数分析的方法。
[0004]在以往的研究中发现，实时荧光定量PCR检测和Southern杂交所得的拷贝数结果十分接近，但是有部分结果显示实时荧光定量PCR所得的拷贝数稍高于Southern杂交。Ingham等在检测转基因玉米中外源基因的拷贝数时发现，实时荧光定量PCR所得的拷贝数结果高于Southern杂交。这种情况可能是由于多重因素造成的，比如在Southern杂交中酶切消化不完全、基因重排、显影本底的高低等因素都可能造成这种错误的结果。因而，实时荧光定量PCR得到的拷贝数结果更加接近于客观事实。
[0005]开发一种能检测鉴定出转基因烟草中外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法对进行后续研究具有重要影响。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法，利用的是实时荧光定量PCR技术，利用本发明提供的方法可以简单、快速、准确的检测转基因烟草中外源基因拷贝数。
[0007]本发明提供一对引物，由如下⑴和(2)所示的DNA分子组成:
[0008](I) SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子；
[0009](2) SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子。
[0010]一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述的引物。
[0011]所述试剂盒还包含使用说明书，说明书中记载内容如下:以梯度稀释的非转基因烟草的基因组DNA为模板，以SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子分别为上游引物和下游引物，进行实时荧光定量PCR扩增；将稀释度最小的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度记作1，计算得到其他稀释度的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度与稀释度最小的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度的比值，将I和计算得到的各个比值记作拷贝数浓度值；以拷贝数浓度值的Ig值为纵坐标，对应的Ct值为横坐标，绘制内参基因标准曲线，得到内参基因标准曲线公式1，同时以待检测转基因烟草的基因组DNA为模板进行上述实验，得到Ct值X1 ;将以值X1带入内参基因标准曲线公式1，得到待检测转基因烟草中的内参基因的拷贝数浓度值的Ig值，即Y1;
[0012]以梯度稀释的含有外源基因的质粒为模板，以外源基因的上游引物和下游引物为引物，进行实时荧光定量PCR扩增；将稀释度最小的含有外源基因的质粒模板的浓度记作1，计算得到其他稀释度的含有外源基因的质粒模板的浓度与稀释度最小的含有外源基因的质粒模板的浓度的比值，将I和计算得到的各个比值记作拷贝数浓度值；以拷贝数浓度值的Ig值为纵坐标，对应的Ct值为横坐标绘制外源基因标准曲线，得到外源基因标准曲线公式2，同时以待检测转基因烟草的基因组DNA为模板进行上述实验，得到Ct值X2 ;将Ct值X2带入外源基因标准曲线公式2，得到待检测转基因烟草中的外源基因的拷贝数浓度值的Ig值，即Y2 ；
[0013]Y2ZY1即为待检测转基因烟草中的外源基因的拷贝数，当Y2A1小数点后第一位大于5时，整数部分加1，小于等于5时，整数部分不变，整数部分即为转基因烟草中的外源基因拷贝数；
[0014]所述稀释度最小是指稀释倍数最小；
[0015]所述模板的浓度单位相同；
[0016]所述内参基因为核糖核酸还原酶(Ribonucleotide reductase) RNR2 ;
[0017]所述梯度稀释的非转基因烟草的基因组DNA的浓度分别为0.0406 μ g/yL、0.00812 μ g/μ L、0.001624 μ g/μ L、0.0003248 μ g/μ L、0.00006496 μ g/μ L ；
[0018]所述非转基因烟草具体为非转基因烟草品种Κ346 ；
[0019]所述实时荧光定量PCR的反应体系为:模板2 μ LUOymol.L-1的上游引物、下游引物各 0.3 μ L、SYBRfi Premix Ex Taq?II10 μ L,加入 ddH20 补足体系至 20 μ L ；[0020]所述SYBR? Premix Ex Taq?II具体购自宝生物工程(大连)有限公司；
[0021]所述实时荧光定量PCR的反应体系为:95°C 30s ；95°C 5s，60°C 30s, 40个循环。
[0022]一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法也属于本发明的保护范围，以梯度稀释的非转基因烟草的基因组DNA为模板，以SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ IDN0.4所示的DNA分子分别为上游引物和下游引物，进行实时荧光定量PCR扩增；将稀释度最小的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度记作1，计算得到其他稀释度的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度与稀释度最小的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度的比值，将I和计算得到的各个比值记作拷贝数浓度值；以拷贝数浓度值的Ig值为纵坐标，对应的Ct值为横坐标，绘制内参基因标准曲线，得到内参基因标准曲线公式1，同时以待检测转基因烟草的基因组DNA为模板进行上述实验，得到Ct值X1 ;将Ct值X1带入内参基因标准曲线公式1，得到待检测转基因烟草中的内参基因的拷贝数浓度值的Ig值，即Y1 ;
[0023]以梯度稀释的含有外源基因的质粒为模板，以外源基因的上游引物和下游引物为引物，进行实时荧光定量PCR扩增；将稀释度最小的含有外源基因的质粒模板的浓度记作1，计算得到其他稀释度的含有外源基因的质粒模板的浓度与稀释度最小的含有外源基因的质粒模板的浓度的比值，将I和计算得到的各个比值记作拷贝数浓度值；以拷贝数浓度值的Ig值为纵坐标，对应的Ct值为横坐标绘制外源基因标准曲线，得到外源基因标准曲线公式2，同时以待检测转基因烟草的基因组DNA为模板进行上述实验，得到Ct值X2 ;将Ct值X2带入外源基因标准曲线公式2，得到待检测转基因烟草中的外源基因的拷贝数浓度值的Ig值，即Y2 ；
[0024]Y2ZY1即为待检测转基因烟草中的外源基因的拷贝数，当Y2A1小数点后第一位大于5时，整数部分加1，小于等于5时，整数部分不变，整数部分即为转基因烟草中的外源基因拷贝数；
[0025]所述模板的浓度单位相同；
[0026]所述内参基因为核糖核酸还原酶基因RNR2 ；
[0027]所述外源基因为转基因烟草中转入的基因。
[0028]上述方法中，所述梯度稀释的非转基因烟草的基因组DNA的浓度分别为
0.0406 μ g/μ L、0.00812 μ g/μ L、0.001624 μ g/μ L、0.0003248 μ g/μ L、0.00006496 μ g/μ L0
[0029]上述任一所述的方法中，所述实时突光定量PCR的反应体系为:模板2μ L、
10μ mo I.I71 的上游引物、下游引物各 0.3 μ L、SYBR? Premix Ex Taq?II10 μ L，加入 ddH20补足体系至20 u L ；
[0030]SYBR? Premix Ex Taq?II具体购自宝生物工程(大连)有限公司；
[0031]所述实时荧光定量PCR的反应体系为:95°C 30s ；95°C 5s，60°C 30s, 40个循环。
[0032]所述内参基因标准曲线公式I具体为Y1 = -0.2858X1+5.6695。
[0033]上述任一所述的方法中，所述非转基因烟草为非转基因烟草品种K346。
[0034]所述转基因烟草的外源基因具体为GFP基因；
[0035]所述转基因烟草具体是通过在非转基因烟草通过农杆菌介导的叶盘法方法导入PBI121-GFP质粒得到的；
[0036]所述非转基因烟草具体为非转基因烟草品种K346 ；[0037]所述梯度稀释的含有外源基因的质粒的浓度具体分别为0.0356 μ g/yL、
0.00712 μ g/μ L、0.001424 μ g/μ L、0.0002848 μ g/μ L、0.00005696 μ g/μ L ；
[0038]所述外源基因的上游引物和下游引物分别具体为SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子；
[0039]所述外源基因标准曲线公式2具体为Y2 = -0.2826Χ3+2.1048。
[0040]上述引物、上述试剂盒在检测转基因烟草中外源基因拷贝数中的应用也属于本发明的保护范围。
[0041]所述转基因烟草的外源基因具体为GFP基因； [0042]所述转基因烟草具体是通过在非转基因烟草通过农杆菌介导的叶盘法方法导入PBI121-GFP质粒得到的；
[0043]所述非转基因烟草具体为非转基因烟草品种Κ346。
[0044]本发明选择烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因，通过实时荧光定量PCR技术检测转基因烟草中外源基因的拷贝数。本发明提供的方法可以为今后转基因烟草的拷贝数分析提供一种新的思路，满足基因工程中对优良转化植株的筛选需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1为转GFP基因烟草的PCR检测。
[0046]图2为内参基因RNR2标准曲线。
[0047]图3为外源基因GFP标准曲线。
[0048]图4为内参基因RNR2熔解曲线。
[0049]图5为外源基因GFP熔解曲线。
[0050]图6为内参基因RNR2引物的可靠性分析。
[0051]图7为外源基因GFP引物的可靠性分析。
【具体实施方式】
[0052]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0053]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0054]非转基因烟草品种Κ346 (Nicotiana tabacum cv.346)在文献“罗聪.芒果遗传多样性及逆境和重要开花时间相关基因研究[博士学位论文].南宁:广西大学，2012”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0055]pBI121-GFP质粒在文献“罗聪.芒果遗传多样性及逆境和重要开花时间相关基因研究[博士学位论文].南宁:广西大学，2012”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0056]下述实施例中转GFP基因烟草的构建过程如下:将含有外源基因GFP的植物表达载体PBI121-GFP通过农杆菌介导的叶盘法转入非转基因烟草品种K346，通过以下PCR筛选获得阳性转GFP基因的烟草。
[0057]1、取农杆菌介导的叶盘法筛选得到的转化烟草植株的幼嫩叶片，用改良的CTAB法提取烟草基因组DNA(方法参照文献“罗聪.芒果遗传多样性及逆境和重要开花时间相关基因研究[博士学位论文].南宁:广西大学，2012”)。2、根据植物表达载体pBI121-GFP上GFP基因序列设计特异引物，引物序列为GFP1:5’ -ATGGGTAAAGGAGAAGAACT-3，(SEQ IDN0.1)，GFP2:5，-TTATTTGTATAGTTCATCCA-3’ (SEQ ID N0.2)(参照文献“罗聪.芒果遗传多样性及逆境和重要开花时间相关基因研究[博士学位论文].南宁:广西大学，2012”)，目的条带为718bp。3、以步骤I得到的基因组DNA为模板，以GFPl和GFP2为引物进行PCR扩增，并以PBI121-GFP为模板作为阳性对照，非转基因烟草K346的基因组DNA为模板为阴性对照，进行上述PCR检测，得到各PCR扩增产物，各产物的琼脂糖凝胶电泳如图1所示。图1中，I为阳性对照；2为阴性对照；3-12为转基因植株；M为DL2000Marker。筛选获得具有718bp目的条带的阳性转GFP基因的烟草作为下述实施例中的实时荧光定量PCR检测拷贝数的材料。
[0058]SYBR? Premix Ex Taq?II购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0059]实施例1、实时荧光定量PCR技术检测转基因烟草中外源基因拷贝数
[0060]一、引物设计
[0061]选用烟草内源的单拷贝基因一核糖核酸还原酶(Ribonucleotidereductase)RNR2 (该基因的拷贝数在文献 “Chaboute M E, Combettes B, Clement B, et al.Molecularcharacterizat1n of tobacco ribonucleotide reductase RNRI and RNR2cDNAs andcell cycle regulated express1n in synchronized plant cells.Plant MolecularB1logy, 1998，38:797-806”中公开过)作为内参基因。设计内参基因RNR2和外源基因GFP的引物如下:
[0062]上游引物RNR2U :5’ -TACCCGTCACTGGGAAAC-3，(SEQ ID N0.3)
[0063]下游引物RNR2D:5’ -GGAAGCCGTAGAAAGCAC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0064]以RNR2U和RNR2D为引物扩增烟草中的内参基因RNR2，目的片段长度为158bp ；
[0065]上游引物GFPTU:5’ -AACTACTACTCCCACAACG-3’ (SEQ ID N0.5)
[0066]下游引物GFPTD:5’ -ATGGTCTGCTGGTGAACG-3’ (SEQ ID N0.6)
[0067]以GFPTU和GFPTD为引物扩增烟草中的外源基因GFP，目的片段长度为112bp。
[0068]二、实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数
[0069](一)实时突光定量PCR反应体系以及程序
[0070]实时荧光定量PCR反应体系:模板2 μ LUOymol.l-1的上、下游引物各0.3 μ L、SYBR? Premix Ex Taq?II10 μ L,加入 ddH20 补足至 20 μ L。
[0071]实时荧光定量PCR反应程序:95°C 30s ；95°C 5s,60°C 30s，40个循环。反应完成后进行熔解曲线分析。
[0072]实时荧光定量PCR反应在罗氏Light cycler2.0荧光定量PCR仪上进行。
[0073](二)内参基因标准曲线的制作
[0074]1、提取非转基因烟草品种K346的基因组DNA作为内参基因RNR2的标准品，紫外分光光度法测得基因组DNA浓度为0.0406 μ g/μ L，进行5倍梯度稀释，稀释倍数分别为5°，5—1，5_2，5_3，5_4，得到5个浓度稀释的内参基因标准品。将稀释度最小的非转基因烟草的基因组DNA的浓度记作1，计算得到其他稀释度的非转基因烟草的基因组DNA的浓度与稀释度最小的非转基因烟草的基因组DNA的浓度的比值，将I和计算得到的各个比值记作拷贝数浓度值，求得的拷贝数浓度分别为5°拷贝/ μ L，5—1拷贝/ μ L，5_2拷贝/ μ L，5_3拷贝/ μ L，5_4拷贝/ μ L。提取5株转GFP基因烟草的基因组DNA，作为5个转GFP基因烟草检测样品。
[0075]2、分别以5个浓度稀释的内参基因标准品、5个转GFP基因烟草检测样品、水(空白对照)作为模板，以内参基因RNR2引物(RNR2U和RNR2D)为引物，进行步骤(一)的实时荧光定量PCR扩增，每个样品设置三个重复。
[0076]以5个浓度稀释的内参基因标准品的初始模板拷贝数浓度的Ig值为纵坐标，对应的Ct值为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线公式，结果如图2所示。
[0077](三)外源基因标准曲线的制作
[0078]1、以pBI121-GFP作为外源基因GFP的标准品，浓度为0.0356 μ g/μ L，进行5倍梯度稀释，稀释倍数分别为5^515-2,5-3,5'得到5个浓度稀释的外源基因标准品。将稀释度最小的含有外源基因的质粒的浓度记作1，计算得到其他稀释度的含有外源基因的质粒的浓度与稀释度最小的含有外源基因的质粒的浓度的比值，将I和计算得到的各个比值记作拷贝数浓度值；求得的拷贝数浓度分别为5°拷贝/ μ L，5-1拷贝/ μ L，5_2拷贝/ μ L，5_3拷贝/ μ L，5_4拷贝/ μ L。
[0079]2、分别以5个浓度稀释的外源基因标准品、5个转GFP基因烟草检测样品(同二中所提取的5个检测样品)、非转基因烟草品种Κ346的基因组DNAdK (空白对照)作为模板，以外源基因GFP引物(GFPTU和GFPTD)为引物，进行步骤(一)的实时荧光定量PCR扩 增，每个样品设置三个重复。
[0080]以5个浓度稀释的外源基因标准品的初始模板拷贝数浓度的Ig值为纵坐标，对应的Ct值为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线公式，结果如图3所示。
[0081]图2表明，内参基因RNR2的标准曲线公式为Y1 = -0.2858Χ1+5.6695，R2 = 0.9994。
[0082]图3表明，外源基因GFP的标准曲线公式为Y2 = -0.2826Χ3+2.1048,R2 = 0.9989。
[0083]两个标准线公式的相关系数均接近于1，因此可以准确的对样品进行定量。
[0084](四)引物特异性
[0085]RNR2基因的熔解曲线如图4所示。
[0086]GFP基因的熔解曲线如图5所示。
[0087]从图4和图5中可以看出，RNR2基因和GFP基因的熔解曲线都为单峰，说明各自的引物特异性较好，在反应中无非特异性扩增，无引物二聚体，说明得到的实时荧光定量数据是可靠的。
[0088](五)转基因烟草中外源基因的定量检测
[0089]步骤(二)中以5个浓度稀释的内参基因标准品、5个转GFP基因烟草检测样品、水(空白对照)作为模板，以内参基因RNR2引物(RNR2U和RNR2D)为引物，进行步骤(一)的实时荧光定量PCR扩增结果如图6所示，扩增结果显示所有的烟草植株均有扩增，而空白对照水没有扩增。
[0090]步骤(三)中分别以5个浓度稀释的外源基因标准品、5个转GFP基因烟草检测样品、非转基因烟草品种Κ346的基因组DNAdK (空白对照)作为模板，以外源基因GFP引物(GFPTU和GFPTD)为引物，进行步骤(一)的实时荧光定量PCR扩增结果如图7所示，扩增结果显示转GFP基因烟草植株的样品有扩增，而非转基因烟草品种Κ346样品及空白对照没有扩增，说明样品没有污染，结果可信。
[0091](六)由步骤(二)得到的5株转GFP基因烟草中内参基因RNR2和步骤(三)得到的这些烟草中外源基因GFP的Ct值和Tm值如表1所示。
[0092]表1检测样品中RNR2和GFP基因的Ct值和Tm值
【权利要求】
1.一对引物，由如下(I)和⑵所示的DNA分子组成:
(1)SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子；
(2)SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子。
2.一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物。
3.—种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法，包括如下步骤:以梯度稀释的非转基因烟草的基因组DNA为模板，以SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子分别为上游引物和下游引物，进行实时荧光定量PCR扩增；将稀释度最小的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度记作1，计算得到其他稀释度的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度与稀释度最小的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度的比值，将I和计算得到的各个比值记作拷贝数浓度值；以拷贝数浓度值的Ig值为纵坐标，对应的Ct值为横坐标，绘制内参基因标准曲线，得到内参基因标准曲线公式1，同时以待检测转基因烟草的基因组DNA为模板进行上述实验，得到Ct值X1 ;将Ct值X1带入内参基因标准曲线公式1，得到待检测转基因烟草中的内参基因的拷贝数浓度值的Ig值，即Y1 ; 以梯度稀释的含有外源基因的质粒为模板，以外源基因的上游引物和下游引物为引物，进行实时荧光定量PCR扩增；将稀释度最小的含有外源基因的质粒模板的浓度记作1，计算得到其他稀释度的含有外源基因的质粒模板的浓度与稀释度最小的含有外源基因的质粒模板的浓度的比值，将I和计算得到的各个比值记作拷贝数浓度值；以拷贝数浓度值的Ig值为纵坐标，对应的Ct值为横坐标绘制外源基因标准曲线，得到外源基因标准曲线公式2，同时以待检测转 曲线公式2，得到待检测转基因烟草中的外源基因的拷贝数浓度值的Ig值，即Y2 ; Y2A1即为待检测转基因烟草中的外源基因的拷贝数，当Y2A1小数点后第一位大于5时，整数部分加1，小于或等于5时，整数部分不变，整数部分即为转基因烟草中的外源基因拷贝数； 所述模板的浓度单位相同； 所述内参基因为核糖核酸还原酶基因RNR2 ； 所述外源基因为转基因烟草中转入的基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述梯度稀释的非转基因烟草的基因组 DNA 的浓度分别为 0.0406 μ g/μ L,0.00812 μ g/μ L、0.001624 μ g/μ L、0.0003248 μ g/μ L、0.00006496 μ g/μ L。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述实时荧光定量PCR的反应体系为:模板2 μ L、10 μ mo I.I71的上游引物、下游引物各0.3 μ L、SYBRf^ Premix ExTaq?II10y L，加入ddH20补足体系至20 μ L ； SYBR? Premix Ex Taq?II具体购自宝生物工程(大连)有限公司； 所述实时荧光定量PCR的反应体系为:95°C 30s ；95°C 5s, 60°C 30s, 40个循环。
6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于:所述非转基因烟草为非转基因烟草品种K346。
7.权利要求1所述的引物、权利要求2所述的试剂盒在检测转基因烟草中外源基因拷贝数中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104032007SQ201410260160
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2014年6月12日
【发明者】谢芝勋, 王盛, 谢丽基, 谢志勤, 黄莉, 邓显文, 罗思思, 黄娇玲, 刘加波 申请人:广西壮族自治区兽医研究所