一种用于提高恩拉霉素产量的发酵培养基及发酵方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于提高恩拉霉素产量的发酵培养基，所述发酵培养基中有机碳源的含量为40-80g/L；所述发酵培养基中有机氮源的含量为10-60g/L。本发明还提供了一种发酵生产恩拉霉素的方法，将杀真菌素链霉菌的种子液接种于上述发酵培养基中进行液体发酵，发酵培养192-240小时后，从发酵液中提取恩拉霉素。本发明所述发酵培养基和发酵方法大幅度提高了恩拉霉素的发酵单位，适用于恩拉霉素的规模化生产。
【专利说明】一种用于提高恩拉霉素产量的发酵培养基及发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种用于提高恩拉霉素产量的发酵培养基及发酵方法。
【背景技术】
[0002]恩拉霉素(Enramycin)是由土壤中分离出来的放线菌Streptomycesfungicid1us N0.B5477发酵产生的一种由不饱和脂肪酸和十几种氨基酸结合成的多肽类抗生素。该药于1966年由日本武田药品工业株式会社研发，1974年在日本正式注册，其后在许多国家被注册和广泛使用。1993年，我国农业部批准该药在我国注册。2005年，国内生产企业与美国先灵德雅动物保健品有限公司(Schering Plough Animal Health Corp.)开始合作生产恩拉霉素预混剂。恩拉霉素是由包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成的有机碱。其中氨基酸分子构成环状多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端。据其末端脂肪酸种类不同，分为恩拉霉素A(Cltl7H138Cl2N26O31)和恩拉霉素B(Cltl8H14tlCl2N26O31)，恩拉霉素则是由这两种成分组成的混合物。恩拉霉素的盐酸盐为白色结晶性粉末，分子量约为2500,融点为238~245°C,易溶于二甲亚砜,可溶于甲醇、含水乙醇,难溶于丙酮,不溶于苯、氯仿。它对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，长期使用后不易产生抗药性。它能改变肠道内的细菌群落分布，有利于饲料营养成份的消化吸收，促进动物增重和提高饲料利用率，因此被世界上许多国家推荐作为抗生素促生长剂。
[0003]目前，恩拉霉素生产成本较高，发酵结果不理想、易染菌。要使发酵水平有所提高必须改变培养基以及发酵方法。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于提高恩拉霉素产量的发酵培养基及发酵方法。
[0005]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于提高恩拉霉素产量的发酵培养基，所述发酵培养基中有机碳源的含量为40-80g/L ;所述发酵培养基中有机氮源的含量为10-60g/L。所述含量以发酵罐实际装液量来计。
[0006]作为优选，所述发酵培养基中有机碳源的含量为65g/L ;所述发酵培养基中有机氮源的含量为52g/L。
[0007]进一步地，所述发酵培养基的pH为6.8-7.2，优选为6.9-7.0。
[0008]其中，所述有机碳源为葡萄糖、玉米淀粉和麦芽糊精中的一种或多种；葡萄糖较优的范围35-45g/L，玉米淀粉10-25g/L，麦芽糊精较优的范围35_45g/L。
[0009]所述有机氮源为豆柏粉、棉籽饼粉、玉米浆水解液和酵母浸膏/粉中的一种或多种。
[0010]作为优选，所述有机碳源为玉米淀粉和麦芽糊精两者中的至少一种和葡萄糖，所述有机氮源为豆柏粉、棉籽饼粉、玉米浆水解液三者中的至少一种和酵母浸膏/粉。
[0011]作为优选，所述酵母浸膏/粉的含量l-6g/L。
[0012]进一步地，所述豆柏粉和棉籽饼粉为过80目筛孔后的豆柏粉和棉籽饼粉。
[0013]进一步地，所述发酵培养基还包含常规发酵培养基中所使用无机氮源、无机盐和消泡剂。所述无机氮源用量较佳范围为5-10g/L，优选为NH4Cl ;所述无机盐用量较佳范围为10-20g/L，优选为NaCl ;苏搜狐消泡剂为聚醚类消泡剂，用量为常规用量。
[0014]在本发明的一个较佳实施例中，所述发酵培养基包含:葡萄糖40g/L、麦芽糊精15g/L、玉米淀粉15g/L、豆柏粉21g/L、棉籽饼粉10g/L、玉米浆水解液20g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉 6g/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敌 0.6g/L。
[0015]在本发明的另一较佳的实施例中，所述发酵培养基包含:葡萄糖40g/L ;玉米淀粉25g/L、豆柏粉21g/L、棉籽饼粉10g/L、玉米浆水解液20g/L、酵母浸粉lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敌 0.6g/L。
[0016]本发明还提供了一种发酵生产恩拉霉素的方法，将杀真菌素链霉菌的种子液接种于前述发酵培养基中进行液体发酵，发酵培养192-240小时后，从发酵液中提取恩拉霉素。从发酵液中提取恩拉霉素的方法是常规方法，一般是将停止发酵后的恩拉霉素发酵液添加预处理剂经过热处理，过滤，收集菌体，再将菌体与预混剂(稻糠或玉米芯粉、二氧化硅等)混匀，通过气流干燥机烘干，得到含有8 %恩拉霉素的饲料预混剂。
[0017]其中，所述链霉菌为突变菌株FYFJ03，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4113，保藏日期为2010年8月25日。
[0018]作为优选，所述发酵培养温度为28_32°C，发酵培养过程中pH为6.8-7.0。
[0019]本发明的有益效果在于:
[0020]本发明解决了恩拉霉素生产成本较高，发酵水平不理想的不足，提供了一种有利于杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)高效发酵生产恩拉霉素(enramycin)的发酵培养基以及相应的发酵方法。通过优选发酵培养基的碳氮成分及配比，优化培养温度、PH等发酵参数，从而大幅度提高了恩拉霉素的发酵单位，适用于恩拉霉素的规模化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为本发明对比例I中不同发酵温度下恩拉霉素的效价。
[0022]图2为本发明对比例2中不同发酵培养pH条件下恩拉霉素的效价。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0024]以下实施例中培养基配方中的各组分均为市售商品。
[0025]实验菌种为杀真菌素链霉菌突变菌株FYFJ03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101)，保藏日期为2010年8月25日，保藏编号为CGMCCN0.4113。
[0026]实施例1
[0027]将实验菌种在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，28°C恒温培养7天；将杀真菌素链霉菌在种子培养基中培养而得到种子液，种子液以8%-10% (v/v)接种量接种于装液量为35L发酵培养基的50L发酵罐中进行发酵，发酵温度28°C，发酵周期8天。发酵结束后取样(HPLC)测定，恩拉霉素效价能达到9133μ g/mL。
[0028]其中，所述固体斜面培养基的组成为:葡萄糖10g/L，胰蛋白胨lg/L，琼脂22g/L，酵母粉lg/L。
[0029]所述种子培养基的组成为:玉米粉40g/L、玉米浆28g/L、棉籽饼粉5g/L、玉米蛋白粉5g/L、硫酸铵3g/L、硫酸亚铁0.36g/L、磷酸二氢钾1.25g/L、碳酸钙22g/L、泡敌0.6g/L，水余量，培养基PH7.0-7.5。
[0030]所述发酵培养基的组成为:葡萄糖40g/L、玉米淀粉25g/L、豆柏粉21g/L、棉籽饼粉 10g/L、玉米浆水解液 20g/L、酵母浸粉 lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敌
0.6g/L，用20%液碱调pH6.9，最后投入碳酸钙。
[0031]实施例2
[0032]将实验菌种在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，28°C恒温培养7天；种子液以8%-10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28°C，发酵周期10天。发酵结束后取样(HPLC)测定，恩拉霉素效价能达到8517μ g/mL。
[0033]所述固体斜面培养基和种子培养基同实施例1 ;
[0034]所述发酵培养基的组成:葡萄糖40g/L、玉米淀粉15g/L、豆柏粉21g/L、棉籽饼粉10g/L、玉米浆水解液 25g/L、酵母浸粉 lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敌 0.6g/L，用20%液喊调ρΗ7.I，最后投入碳酸钙。
[0035]实施例3
[0036]将实验菌种在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，28°C恒温培养7天；种子液以8% -10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28°C，发酵周期9天。发酵结束后取样(HPLC)测定，恩拉霉素效价能达到9048μ g/mL。
[0037]所述固体斜面培养基和种子培养基同实施例1 ;
[0038]所述发酵培养基的组成:葡萄糖40g/L、玉米淀粉25g/L、豆柏粉21g/L、棉籽饼粉10g/L、玉米浆水解液 20g/L、酵母浸粉 lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敌 0.6g/L，用20%液喊调ρΗ7.0，最后投入碳酸钙。
[0039]实施例4
[0040]将实验菌种在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，28°C恒温培养7天；种子液以8% -10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28°C，发酵周期8天。发酵结束后取样(HPLC)测定，恩拉霉素效价能达到9113μ g/mL。
[0041]所述固体斜面培养基和种子培养基同实施例1 ;
[0042]所述发酵培养基的组成:40g/L葡萄糖、15g/L麦芽糊精、15g/L玉米淀粉、20g/L豆柏粉、10g/L棉籽饼粉、20g/L玉米浆水解液、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉5g/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、20g/L CaCO3、泡敌0.6g/L，用20%液碱调pH6.85，最后投入碳酸钙。
[0043]实施例5
[0044]将实验菌种在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，28°C恒温培养7天；种子液以8% -10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28°C，发酵周期9天。发酵结束后取样(HPLC)测定，恩拉霉素效价能达到8500μ g/mL。
[0045]所述固体斜面培养基和种子培养基同实施例1 ;
[0046]所述发酵培养基的组成:葡萄糖30g/L、玉米淀粉10g/L、豆柏粉21g/L、棉籽饼粉10g/L、玉米浆水解液 15g/L、酵母浸粉 5g/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敌 0.6g/L，用20%液喊调ρΗ7.0，最后投入碳酸钙。
[0047]实施例6
[0048]将实验菌种在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，28°C恒温培养7天；种子液以8% -10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28°C，发酵周期9天。发酵结束后取样(HPLC)测定，恩拉霉素效价能达到8753μ g/mL。
[0049]所述固体斜面培养基和种子培养基同实施例1 ;
[0050]所述发酵培养基的组成:葡萄糖40g/L、玉米淀粉20g/L、麦芽糊精20g/L，豆柏粉20g/L、棉籽饼粉10g/L、玉米浆水解液20g/L、胰蛋白胨3g/L，酵母浸粉2g/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敌0.6g/L，用20%液碱调ρΗ7.0，最后投入碳酸钙。
[0051]实施例7
[0052]将实验菌种在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，28°C恒温培养7天；种子液以8% -10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28°C，发酵周期9天。发酵结束后取样(HPLC)测定，恩拉霉素效价能达到8324μ g/mL。
[0053]所述固体斜面培养基和种子培养基同实施例1 ;
[0054]所述发酵培养基的组成:葡萄糖40g/L、玉米淀粉25g/L、豆柏粉5g/L、棉籽饼粉2g/L、玉米浆水解液 2g/L、酵母浸粉 lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敌 0.6g/L，用20%液喊调pH6.8,最后投入碳酸钙。
[0055]实施例8
[0056]将实验菌种在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，28°C恒温培养7天；种子液以8% -10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28°C，发酵周期9天。发酵结束后取样(HPLC)测定，恩拉霉素效价能达到9012μ g/mL。
[0057]所述固体斜面培养基和种子培养基同实施例1 ;
[0058]所述发酵培养基的组成:葡萄糖30g/L、玉米淀粉15g/L、麦芽糊精20g/L、豆柏粉25g/L、棉籽饼粉15g/L、玉米浆水解液15g/L、酵母浸粉5g/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敌0.6g/L，用20%液碱调pH7.0，最后投入碳酸钙。
[0059]对比例I发酵温度的优化
[0060]将实验菌种在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，28°C恒温培养7天；将杀真菌素链霉菌在种子培养基中培养而得到种子液，种子液以8%-10% (v/v)接种量接种于装液量为35L发酵培养基的50L发酵罐中进行发酵，发酵温度分别为26°C、28°C、30°C、32°C、34°C，发酵周期8天。发酵结束后取样(HPLC)测定，恩拉霉素效价如图1所示。由图1可知，发酵温度在28°C~32°C培养时，恩拉霉素效价较高，其最适温度为28°C。
[0061]其中，所述固体斜面培养基的组成为:葡萄糖10g/L，胰蛋白胨lg/L，琼脂22g/L，酵母粉lg/L。
[0062]所述种子培养基的组成为:玉米粉40g/L、玉米浆28g/L、棉籽饼粉5g/L、玉米蛋白粉5g/L、硫酸铵3g/L、硫酸亚铁0.36g/L、磷酸二氢钾1.25g/L、碳酸钙22g/L、泡敌0.6g/L，水余量，培养基PH7.0-7.5。
[0063]所述发酵培养基的组成为:葡萄糖40g/L、玉米淀粉25g/L、豆柏粉21g/L、棉籽饼粉 10g/L、玉米浆水解液 20g/L、酵母浸粉 lg/L、NaCl 15g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敌
0.6g/L，用20%液碱调pH6.9，最后投入碳酸钙。
[0064]对比例2pH的优化
[0065]将实验菌种在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，28°C恒温培养7天；将杀真菌素链霉菌在种子培养基中培养而得到种子液，种子液以8%-10% (v/v)接种量接种于装液量为35L发酵培养基的50L发酵罐中进行发酵，发酵培养基pH分别为6.6、6.8、6.9、7.0、7.2。发酵培养温度28°C，发酵周期8天。发酵结束后取样(HPLC)测定，恩拉霉素效价如图2所示。由图2可知，在pH在6.8~7.2时，恩拉霉素效价较高，其最佳pH为6.9~7.0。
[0066]其中，所述固体斜面培养基的组成为:葡萄糖10g/L，胰蛋白胨lg/L，琼脂22g/L，酵母粉lg/L。
[0067]所述种子培养基的组成为:玉米粉40g/L、玉米浆28g/L、棉籽饼粉5g/L、玉米蛋白粉5g/L、硫酸铵3g/L、硫酸亚铁0.36g/L、磷酸二氢钾1.25g/L、碳酸钙22g/L、泡敌0.6g/L，水余量，培养基PH7.0-7.5。
[0068]所述发酵培养基的组成为:葡萄糖40g/L、玉米淀粉25g/L、豆柏粉21g/L、棉籽饼粉 10g/L、玉米浆水解液 20g/L、酵母浸粉 lg/L、NaC115g/L、NH4C15g/L、CaC0320g/L、泡敌
0.6g/L，用20%液碱调至所需的pH，最后投入碳酸钙。
[0069] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种用于提高恩拉霉素产量的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中有机碳源的含量为40-80g/L ;所述发酵培养基中有机氮源的含量为10-60g/L。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中有机碳源的含量为65g/L ;所述发酵培养基中有机氮源的含量为52g/L。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的pH为6.8-7.2。
4.根据权利要求1-3任一项所述的发酵培养基，其特征在于，所述有机碳源为葡萄糖、玉米淀粉和麦芽糊精中的一种或多种；所述有机氮源为豆柏粉、棉籽饼粉、玉米浆水解液和酵母浸膏/粉中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，所述有机碳源为玉米淀粉和麦芽糊精两者中的至少一种和葡萄糖，所述有机氮源为豆柏粉、棉籽饼粉、玉米浆水解液三者中的至少一种和酵母浸膏/粉。
6.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，所述豆柏粉和棉籽饼粉为过80目筛孔后的豆柏粉和棉籽饼粉。
7.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，所述酵母浸膏/粉的含量l_6g/L。
8.一种发酵生产恩拉霉素的方法，其特征在于，将杀真菌素链霉菌的种子液接种于权利要求1-7任一项所述的发酵培养基中进行液体发酵，发酵培养192-240小时后,从发酵液中提取恩拉霉素。
9.根据权利要求8 所述的方法，其特征在于，所述杀真菌素链霉菌为突变菌株FYFJ03，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4113。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养温度为28-32°C，发酵培养过程中pH为6.8-7.0。
【文档编号】C12P21/04GK104131054SQ201410269954
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】李荣杰, 张雪锋, 尚海涛, 徐斌, 杨为华, 邓远德, 张印 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司