一种梨果皮光滑度主效qtl位点的snp分子标记引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与梨果皮光滑度主效QTL位点的SNP标记引物及其应用。梨果皮光滑度主效QTL位点的紧密连锁SNP标记Pybd02_010，正向引物序列如SEQ?ID?NO.1所示，反向引物序列如SEQ?ID?NO.2所示。利用该特异引物基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果皮光滑度的SNP标记，可对果皮光滑度进行良好分型，即检测QTL位点qSmooth上的多态性表达果皮光滑度的差异。本发明提供的梨果皮光滑度主效QTL分子标记可用于梨果皮光滑度性状的分子标记辅助选择育种，对于加快梨品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。
【专利说明】一种梨果皮光滑度主效QTL位点的SNP分子标记引物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子遗传育种领域，提供了一种梨果皮光滑度主效QTL位点的SNP分子标记引物及其应用。
【背景技术】
[0002]我国是世界梨属(Pyrus L.)植物最主要的起源地之一，遗传多样性丰富。梨的栽培种分布广泛，除了海南省和台湾省，都有栽培。梨果实的营养价值高，香甜多汁，而深受消费者喜爱。果实的外观质量是衡量果实等级的重要因素之一，而果皮光滑度是对果实外观质量评价的第一直观要素。随着人们生活水平的提高，人们对果品质量的要求也越来越高，果面粗糙、皲皮，有果锈和小黑点的果实逐渐被淘汰出优等果实之外。果皮光滑度亦是梨果采后分级的重要标准，无果锈是商品果实的首选指标。在生产上，人们常通过套袋等栽培技术改善果皮的光滑度。另外，选育果皮光滑的品种可以大大降低套袋劳动成本，节约生产资料。因此选育果皮光滑整洁的品种是梨育种的重要目标之一。
[0003]由于绝大多数梨品种是自交不亲和的，梨的遗传组成表现高度杂合性；同时，由于多年生果树的农艺性状多数表现为数量性状遗传特征，有关梨的重要性状遗传规律研究相对滞后，也难以开展目标性状的遗传改良。近年来，随着分子标记技术的迅速发展、高密度的分子遗传图谱的出现，以及数量性状作图方法的不断完善，使得数量性状基因座(QTL)定位变成了现实，也为提高目标数量性状优良基因型选择的可能性、准确性及预见性奠定了基础。利用分子标记定位数量性状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁关系，即利用已 知座位的分子标记来定位未知座位的QTL，通过计算分子标记与QTL之间的交换率，来确定QTL的具体位置。基于获得的标记基因型分离与数量性状表型之间的关系，可直接确定控制数量性状位点，开发可应用于分子标记辅助选择育种的技术，这已在许多重要农作物上取得了成功应用。
[0004]目前有关梨数量性状的QTL定位研究仍属起步阶段，已有的研究主要是针对一些病害或生长性状，对梨果皮光滑度性状的QTL定位及检测QTL位点上的多态性表达果皮光滑度差异的SNP分子标记的开发应用研究尚未有报道。因此，开展梨果皮光滑度性状的QTL定位，基于相应序列信息开发SNP分子标记，并建立杂交后代早期辅助选择技术体系，对于提高梨果实品质，提高育种效率，节约生产成本显得尤为重要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是定位梨果皮光滑度主效QTL，根据贡献位点序列信息开发基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果皮光滑度的SNP特异标记Pybd02_010，检测QTL位点qSmooth上的多态性表达果皮光滑度的差异。通过该分子标记可以预测梨果皮光滑度的大小，为实现果皮光滑度性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。
[0006]本发明的目的可通过如下技术方案实现:[0007]一种与梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth紧密连锁的SNP标记引物对，其中，
[0008]正向引物SMOOTH-F:5’ - GTGGAGGAAGTGCTCGAACT - 3’ (SEQ ID N0.1)，
[0009]反向引物SMOOTH-R:5’ - ACACTGCAAGTAATCATAGCTCT - 3’ (SEQ ID N0.2)。
[0010]本发明所述的SNP标记引物对在梨分子育种中的应用，利用所述的引物对SM00TH-F/SM00TH-R基于高分辨率溶解曲线鉴定检测登录号为AJSU00000000梨基因组序列Scaffold283.0的第416246个碱基处是否存在一个与梨果实果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth，同时检测QTL位点上的多态性表达果皮光滑度的差异，预测梨果皮光滑度，以实现梨果皮光滑度性状的早期鉴定和筛选。
[0011]本发明所述的SNP标记引物对在检测梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth及其SNP多态性中的应用。
[0012]本发明所述的引物用于检测梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth的SNP标记方法，其特征在于:利用本发明所述的SNP标记引物对梨基因组DNA进行HRM反应，如果扩增产物序列大小在249bp，表明存在一个与梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth ；PCR循环结束后进行熔解，最后，在LightCyclerB 480II的Gene Scanning软件中1.5vers1n自动生成扩增产物的不同颜色和线型的熔解曲线，分别以已知梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth上表达果皮光滑的品种和表达果皮粗糙的品种为对照，检测QTL位点qSmooth上的多态性表达果皮光滑度的 差异，如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth上的多态性表达的果皮光滑度和对照相似。
[0013]其中，所述的已知具有与梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth上表达果皮粗糙的品种优选为‘砀山酥梨’，表达果皮光滑的品种优选为‘八月红’。
[0014]所述的HRM 反应的反应体系按照 LightCycler* 480High Resolut1n Melting
Master试剂盒中的说明书进行，HRM分析是在LightCyclers 480II荧光定量PCR仪上进行；10 μ L 反应体系:含有 2ng.μ L-1 梨基因组 DNA 模板、I XMaster Mix,2.0mmol.L-1MgCl2'
0.2mmol -L-1权利要求1所述的引物对；扩增程序采用降落式PCR:95°C预变性lOmin，然后95°C变性10s、60~55°C，每循环下降0.5°C，退火15s、72°C延伸12s的程序进行45个循环；
[0015]PCR循环结束后进行熔解的程序为:95°C lmin,40°C lmin，65°C ls，再从65°C连续升温至95°C，每升高0.04°C，收集荧光I次，最后降温至40°C。
[0016]一种与梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth紧密连锁的SNP标记，该分子标记由引物对:正向引物SM00TH-F:SEQ ID N0.1和反向引物SM00TH-R:SEQ ID N0.2扩增梨基因组DNA得到。
[0017]本发明所述的SNP标记在梨分子育种中的应用，该分子标记位于梨的第2连锁群的76.3cM处，Kruskal-Wallis统计测验值为15.118，在α = 0.001显著水平下显著，利用区间作图法的LOD值为2.72，解释14.1 %的遗传变异。
[0018]本发明所述的SNP标记在检测梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth及其SNP多态性中的应用。
[0019]本发明所述的SNP标记用于检测梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth的SNP标记方法，利用本发明所述的SNP标记引物对梨基因组DNA进行HRM反应，如果扩增产物序列大小在249bp，表明存在一个与梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth ；PCR循环结束后进行熔解，最后，在LightCycler* 480II的Gene Scanning软件中1.5vers1n自动生成扩增产物的不同颜色和线型的熔解曲线，分别以已知梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth上表达果皮光滑的品种和表达果皮粗糙的品种为对照，检测QTL位点qSmooth上的多态性表达果皮光滑度的差异，如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth上的多态性表达的果皮光滑度和对照相似；其中所述的已知具有与梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth上表达果皮粗糙的品种为‘砀山酥梨’，表达果皮光滑的品种为‘八月红’。
[0020]有益效果
[0021](I)本发明首次对决定‘八月红’和‘砀山酥梨’果皮光滑度的数量性状位点进行了 QTL定位，定位的QTL位点对该数量性状的存在显著关联关系(α = 0.001)，且贡献率较高，位点的贡献率为14.1%。这为实现分子辅助育种多基因控制性状遗传改良奠定了重要的基础和必要的前提。
[0022](2)目前普遍认为可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需(5cM，本发明中果皮光滑度主效QTL定位直接定位到SNP标记上，且Kruskal-Wallis测验值为15.118，在α =0.001显著水平下显著，区间作图检测到LOD值为2.72，连锁性和可靠性高，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。
[0023](3)本发明根据定位的梨果皮光滑度性状主效QTL位点qSmooth开发检测梨果皮光滑度的SNP标记Pybd02_010引物，用于预测QTL位点qSmooth上多态性表达果皮光滑度差异，为梨果皮光滑度的预先选择提供了可靠的分子标记来源。 [0024](4)利用开发的SNP标记引物，对‘八月红’和‘砀山酥梨’ 36株杂交群体进行QTL位点qSmooth上多态性表达果皮光滑度差异基因型检测，可将杂交群体分为两组，与果实实际观察的果皮光滑和果皮粗糙相符。群体试验表明，开发的SNP标记特异引物可以对后代果皮光滑度进行良好分型(图2)，因此，具有良好的应用价值，可实现对梨果皮光滑度性状的预先选择和辅助育种。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为梨果皮光滑度主效QTL区间及SNP标记位点Pybd02_010在第2连锁群上的位置。LG2代表的是‘八月红’和‘砀山酥梨’合并遗传连锁图谱的第2连锁群。SNP标记名称起始为‘Pyb’的代表来自‘八月红’的SNP标记，起始名称为‘Pyd’的代表来自‘砀山酥梨’的SNP标记，起始名称为‘Pybd’的代表同时来自‘八月红’和‘砀山酥梨’的SNP标记。
[0026]连锁群左侧的数字是标记之间的遗传距离，单位为CM。连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间。右边的曲线图为QTL的LOD分布图。果皮光滑度QTL位点对应连锁群上的Pybd02_010标记，其位于第2连锁群76.3cM处，LOD值为2.72。
[0027]图2为依据Pybd02_010开发的HRM特异标记引物，在‘八月红’和‘砀山酥梨’后代36个个体中检测的溶解曲线，可良好分型。熔解曲线:线型I一红色曲线，25株个体，其中22株果皮光滑；线型2—蓝色曲线，11株个体，其中9株果皮粗糙。两组的符合率分别为88%和 82%0
【具体实施方式】
[0028]实施例1:
[0029]梨果皮光滑度主效QTL连锁的分子标记，是通过以下方法获得的:
[0030]a)利用‘八月红’和‘砀山酥梨’(品种为公知公用，见文献:张瑞萍等，梨AFLP标记遗传图谱构建及果实相关性状的QTL定位，园艺学报，2011，38 (10):1991 - 1998)杂交获得其102株F1后代单株。
[0031]b)利用RADseq方法高通量测序，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及后代进行分析，并统计分析多态性位点在后代群体中的遗传类型，利用X 2测验分析各标记分离是否符合3:1或1:1的孟德尔遗传分离比例。
[0032]c)用Joinmap4.0分析软件构建‘八月红’和‘砀山酥梨’的分子遗传连锁图谱。将第b)步骤中得到的多态性标记位点按Joinmap4.0分析软件中适于CP群体构图的格式导入Joinmap4.0，排除缺失数据过多的位点和显著偏分离的位点，卡方检测的P值为0.05，选择Kosambi作图函数构建遗传连锁图。
[0033]d)对‘八月红’和‘砀山酥梨’及其F1群体单株的果皮光滑度进行评价，按照《国家梨种质资源描述规范和数据标准》，评价方法是通过对果皮的触摸手感进行评分，3分及以下为粗糙，7分及以上为平滑。 [0034]e)将果皮光滑度的表型值和标记信息的相关文件导入MapQTL5.0软件,选择区间作图法，以LOD值> 3.0为标准，对梨的果皮光滑度进行QTL分析和定位。结果表明，在‘八月红’和‘砀山酥梨’的第2连锁群上检测到果皮光滑度的主效QTL位点qSmooth(图1)，对该性状的贡献率为14.1%，其对应的SNP标记Pybd02_010在连锁群上的遗传距离为76.3cM, LOD 值为 2.72。
[0035]f)利用SNP标记位点Pybd02_010开发HRM特异引物。
[0036]通过梨全基因组数据库(http://peargenome.njau.edu.cn/),从登录号为AJSU00000000的梨基因组序列scaffold283.0中搜索出第2连锁群上SNP标记Pybd02_010的DNA序列，选取的该位点前后300bp的序列，依据引物设计原则，开发设计SNP标记引物。正向引物序列 SMOOTH-F 为 ‘5-GTGGAGGAAGTGCTCGAACT-3’ ；反向引物 SMOOTH-R 为
5‘-ACACTGCAAGTAATCATAGCTCT-3’。扩增产物序列大小249bp，利用设计的SNP标记引物在‘八月红’和‘砀山酥梨’的基因组DNA上进行PCR扩增，引物均扩增正常，PCR产物符合预测大小。因此，该引物可作为梨果皮光滑度性状的检测标记。
[0037]g)利用HRM技术对梨果皮光滑度进行分型。
[0038]HRM 反应体系按照LightCycler* 480High Resolut1n Melting Master 试剂盒中的
说明书进行，HRM分析是在LightCycler1 480II荧光定量PCR仪上进行。
[0039]10 μ L反应体系:含有2ng.μ l-1梨基因组DNA模板，I XMaster Mix,
2.0mmol.L^1MgCl270.2mmol.L—1权利要求1所述的引物；扩增程序采用降落式PCR(touchdown PCR):95 °C 预变性 lOmin，然后 95°C 变性 10s、60 ~55 °C (每循环下降
0.50C )退火15s、72°C延伸12s的程序进行45个循环。[0040]PCR循环结束后进行熔解，其程序为:95°C Imiη, 40°C lmin，65°C ls，再从65°C连续升温至95°C，每升高0.04°C，收集荧光I次，最后降温至40°C。
[0041]最后，在LightCycler?480II 的 Gene Scanning 软件中 1.5vers1n 自动生成扩增产物的熔解曲线
[0042]利用g)步骤中得到的SNP标记引物对‘八月红’ X ‘砀山酥梨’的36个杂交后代群体进行HRM分析(图2)。
[0043]线型I一红色曲线，25个体线型相似，其中22个体为果皮光滑；
[0044]线型2—蓝色曲线，11个体线型相似，其中9个体为果皮粗糙。
[0045]统计分析表明，36个个体分型为两种基因型，分离比例为25:11。根据QTL位点qSmooth上多态性表达果皮光滑度差异基因分型结果将36个个体的果皮光滑度表型数据进行卡方检验(P = 0.00004)，测验结果显示果皮光滑度与基因型有关，且两组的符合率分别为88%和82%。因此，通过对果皮光滑度性状的表型测定结果与HRM分型结果的比较分析，证明该特异SNP标记可检测QTL位点qSmooth上的多态性表达果皮光滑度的差异，对梨果皮光滑 度良好分型。
【权利要求】
1.一种与梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth紧密连锁的SNP标记Pybd02_010引物对，其特征在于:正向引物SMOOTH-F:SEQ ID N0.1，反向引物SMOOTH-R:SEQ ID N0.2。
2.权利要求1所述的SNP标记引物对在梨分子育种中的应用，其特征在于利用所述的引物对基于高分辨率溶解曲线鉴定检测登录号为AJSU00000000的梨基因组序列scaffold283.0的第416246个碱基处是否存在一个与梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth,同时检测QTL位点qSmooth上的多态性表达果皮光滑度的差异,预测梨果皮光滑度，以实现梨果皮光滑度性状的早期鉴定和筛选。
3.权利要求1所述的SNP标记引物对在检测梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth及其SNP多态性中的应用。
4.权利要求1所述的引物用于检测梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth的SNP标记方法，其特征在于:利用权利要求1所述的SNP标记引物对梨基因组DNA进行HRM反应，如果扩增产物序列大小在249bp，表明存在一个与梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth ；PCR循环结束后进行熔解，最后，在LightCyclere 480II的Gene Scanning软件中1.5vers1n自动生成扩增产物的不同颜色和线型的熔解曲线，分别以已知梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth上表达果皮光滑的品种和表达果皮粗糙的品种为对照，检测QTL位点qSmooth上的多态性表达果皮光滑度的差异，如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth上的多态性表达的果皮光滑度和对照相似。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的已知梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth上表达果皮粗糙的品种为‘杨山酥梨’,已知梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth上表达果皮光滑的品 种为‘八月红’。
6.根据权利要求5所述的SNP标记方法，其特征在于所述的HRM反应的反应体系按照LightCycler1 480High Resolut1n Melting Master 试剂盒中的说明书进行，HRM 分析是在LightCycler8 480II荧光定量PCR仪上进行；10 μ L反应体系:含有2ng.μ L—1梨基因组DNA 模板、I XMaster Mix、2.0mmol.L^1MgCI2>0.2mmo1.I71 权利要求1 所述的引物对;扩增程序采用降落式PCR:95°C预变性1min，然后95°C变性1s、60~55°C，每循环下降0.5°C，退火15s、72°C延伸12s的程序进行45个循环； PCR循环结束后进行熔解的程序为:95°C lmin,40°C lmin，65°C ls，再从65°C连续升温至95°C，每升高0.04°C，收集荧光I次，最后降温至40°C。
7.一种与梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth紧密连锁的SNP标记Pybd02_010，其特征在于该分子标记由引物对:正向引物SM00TH-F:SEQ ID N0.1和反向引物SM00TH-R =SEQID N0.2扩增梨基因组DNA得到。
8.权利要求7所述的SNP标记Pybd02_010在梨分子育种中的应用，其特征在于该分子标记位于梨的第2连锁群的76.3cM处，Kruskal-Wallis统计测验值为15.118，在α =0.001显著水平下显著，利用区间作图法的LOD值为2.72，解释14.1%的遗传变异。
9.权利要求7所述的SNP标记在检测梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth及其SNP多态性中的应用。
10.权利要求7所述的SNP标记用于检测梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth的SNP标记方法，其特征在于:利用权利要求1所述的SNP标记引物对梨基因组DNA进行HRM反应，如果扩增产物序列大小在249bp，表明存在一个与梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth ；PCR循环结束后进行熔解，最后，在LightCyclers 480II的Gene Scanning软件中1.5vers1n自动生成扩增产物的不同颜色和线型的熔解曲线，分别以已知梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth上表达果皮光滑的品种和表达果皮粗糙的品种为对照，检测QTL位点qSmooth上的多态性表达果皮光滑度的差异，如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨果皮光滑度主效QTL位点qSmooth上的多态性表达的果皮光滑度和对照相似；其中 所述的已知具有与梨果皮光滑度相关的QTL位点qSmooth上表达果皮粗糙的品种为‘砀山酥梨’，表达果皮光滑的品种为‘八月红’。
【文档编号】C12N15/11GK104032018SQ201410272786
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】吴俊 , 张绍铃, 李雷廷, 孙江妹, 张全军, 刘伦, 齐开杰 申请人:南京农业大学