一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法
【专利摘要】一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法属病毒的分离接种【技术领域】。按照以下步骤进行：收获样品接种鸡胚的尿囊液、胚体，混合研磨，2500～4500rpm离心10～20min；取上清，继续尿囊腔途径盲传，接种样品0.1～0.3ml/胚。本发明在鸡胚水平的流感病毒分离的传统传代方法基础上，通过增加处理病毒可感染的靶组织，采用胚体与尿囊液混合研磨接种的传代方式，成功提高了野外样品的流感病毒分离率，尤其对因高温、强紫外线等特殊生境难以新鲜采集或质量不太理想的野外样本进行“挽救性”的病毒分离，提供了一个有效、可明显提高病毒分离率的处理方法。
【专利说明】一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒的分离接种技术，特别涉及一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚 体分离方法。
【背景技术】
[0002] 鸡胚分离病毒是一种经典的病毒分离方法，来自禽类的病毒，均可在鸡胚中繁殖， 哺乳动物的病毒如蓝舌病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中增殖，近期发现CCHFV病毒也可 在鸡胚中增殖。目前鸡胚尤其是SPF鸡胚被广泛利用于分离病毒、制造疫苗和抗原等，其来 源丰富，操作简便。除病毒外，衣原体、立克次氏体也可用鸡胚来培养。常用的鸡胚接种的 途径一般分为3种：绒毛尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种、尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接 种。其中尿囊腔接种的方法适用于新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、腺病毒、禽流感病毒 等病原的分离。近年来，H5N1、H1N1、H7N9等流感病毒肆虐，WHO历年在应对全球性流感病 毒防控时，都推荐使用接种鸡胚尿囊腔的方法来进行流感病毒的分离。
[0003] 传统禽流感病毒鸡胚尿囊腔传代方法般采用孵化9-11日龄的鸡胚，暗室内画 出气室边缘和胚头位置，气室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚头一侧气室边缘上方 0. 5cm处打一针孔；进针至尿囊腔内接种样品0. 1-0. 2ml/胚，以融化的石蜡封孔，气室朝 上立于卵架上继续孵化，弃去24h内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4°C冰箱过夜。收毒 ： 无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变 化，尿囊液进行HA效价测定。对于HA效价〈1:8的样品，取上一代收获尿囊液继续以相同 接种方式和剂量盲传3代。在实际应用中，我们发现对于野外样品（迁徙鸟粪、禽粪等），存 在外部环境的不可控性，样本质量良莠不齐，即便对于同样的一批样本，因为各种不同的因 素的影响，病毒分离率不尽相同。
【发明内容】
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[0004] 针对上述问题，本发明提供一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法，采 用增加处理病毒可感染的靶组织从而达到增加病毒分离几率的目的，因此提高了病毒的分 离率。
[0005] 本发明一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法，按照以下步骤进行：收 获样品接种鸡胚的尿囊液、胚体，混合研磨，2500?4500rpm离心10?20min ;取上清，继续 尿囊腔途径盲传，接种样品〇. 1?〇. 3ml/胚。
[0006] 所述的尿囊液、胚体混合时，尿囊液的体积与胚体组织的质量比为1?3ml/g。
[0007] 本发明在鸡胚水平的流感病毒分离的传统传代方法基础上，通过增加处理病毒可 感染的靶组织，采用胚体与尿囊液混合研磨接种的传代方式，成功提高了野外样品的流感 病毒分离率，尤其对因高温、强紫外线等特殊生境难以新鲜采集或质量不太理想的野外样 本进行"挽救性"的病毒分离，提供了一个有效、可明显提高病毒分离率的处理方法。
【具体实施方式】
[0008] 实施例1
[0009] 采用传统鸡胚尿囊腔传代法和本发明鸡胚胚体混合传代法，进行禽流感病毒分离 率比较。同一份样品同时采用两种方法，分别各接种一枚鸡胚。
[0010] 样品为2008年青海省某县新鲜疑似禽流感野鸟样品196份。具体操作方法如下： 采用孵化9-11日龄的鸡胚63枚，经照视后划出气室及胚胎位置，于气室侧方打一针孔；胚 胎位置朝上横置卵架上，直接进针尿囊腔内接种样品〇. 2ml/胚，以融化的石蜡封孔闭两个 针孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4°C冰 箱过夜。收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观 察鸡胚病理变化（如胚体发育不良、有出血点、充血或出血等），同时收获鸡胚胚体组织，尿 囊液进行HA效价测定。传代：HA实验阴性的样品，无菌取第1代尿囊液1. 5ml，取胚体组织 约lg，研磨，3000rpm离心15min，取上清0. 2ml直接进针尿囊腔内接种样品，作为第2代； 96小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液及胚胎 组织，按上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。结果见表1。
[0011] 比较例1
[0012] 样品为2008年青海省某县新鲜疑似禽流感野鸟样品196份。具体操作方法如下： 采用孵化9-11日龄的鸡胚63枚，经照视后划出气室及胚胎位置，于气室侧方打一针孔；胚 胎位置朝上横置卵架上，直接进针尿囊腔内接种样品〇. 2ml/胚，以融化的石蜡封孔闭两个 针孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4°C冰 箱过夜。收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观 察鸡胚病理变化（如胚体发育不良、有出血点、充血或出血等），尿囊液进行HA效价测定。 传代：HA实验阴性的样品，无菌取第1代尿囊液0. 2ml按上述同样方式进行盲传第2代，96 小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液0. 2ml按 上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。结果见表1。
[0013] 表1 :2008年青海省某县新鲜疑似禽流感野鸟样品病毒分离方法比较实验结果
[0014]
【权利要求】
1. 一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法，其特征在于按照以下步骤进行： 收获样品接种鸡胚的尿囊液、胚体，混合研磨，2500?4500rpm离心10?20min ;取上清，继 续尿囊腔途径盲传，接种样品〇. 1?〇. 3ml/胚。
2. 按照权利要求1所述的一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法，其特征在 于所述的尿囊液、胚体混合时，尿囊液的体积与胚体组织的质量比为1?3ml/g。
【文档编号】C12R1/93GK104046595SQ201410292500
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】唐霜, 张忠, 夏菡, 范兆军, 李天宪 申请人:中国科学院武汉病毒研究所