一种IgA1酶及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备IgA1酶的方法，包括以下步骤：1)以细菌作为发酵菌株，发酵完成后，得到发酵液；所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌或变异链球菌；2)分离纯化发酵液，得IgA1酶。本发明提供的IgA1酶在模型小鼠体内对IgA1及含IgA1免疫复合物有显著的分解效果，并且效果明显好于商品化IgA1酶，为IgAN的临床治疗提供了一种和药物筛选提供重要参考。
【专利说明】—种IgAI酶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶，特别是IgAl酶及其制备方法，以及其在制备治疗IgA肾病的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]IgA肾病(IgAN)是全球范围内最为常见的原发性肾小球疾病，大约25%~50%的患者在疾病诊断后25年内发展到终末期肾衰竭(ESRD);患者即使接受肾移植，仍有超过50%的患者在肾移植术后两年内IgAN复发。因此，对IgAN的发病机制及其防治研究具有重要的临床价值和社会意义。
[0003]现有研究表明，IgAN作为一种自身免疫性疾病，是以IgA或以IgA为主的免疫球蛋白在肾小球系膜区及毛细血管袢呈弥漫颗粒状或团块状沉积所引起一系列临床及病理改变。半乳糖缺失的IgA暴露其铰链区抗原决定簇，使得针对异常IgA的自身IgG和IgA抗体产生，形成的免疫复合物沉积于系膜区，激活系膜细胞及补体系统导致肾脏损伤。
[0004]目前，在原治疗基础上从自身免疫发病机制角度出发，探索新的IgAN治疗思路成为了研究热点。现有研究发现(IgAl蛋白酶的生物学作用，生物医学工程学杂志，2011年4月第28卷第2期，张紫媛等，P423-427)，一些微生物因其产生IgA酶对人类有致病性，但是由于IgA酶能够降解IgA分子,使得研究人员希望使用IgA酶来对IgAN进行治疗。不过，由于缺乏可靠的动物模型，这个领域的研究主要集中在体外实验上，IgA酶是否能够有潜在的治疗用途还不能客观的评价。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的缺陷，本发明的一个方面是提供一种制备IgAl酶的制备方法，它包括以下步骤:
[0006]I)以细菌作为发酵菌株，发酵完成后，得到发酵液；所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌或变异链球菌；
[0007]2)分离纯化发酵液，得IgAl酶。
[0008]优选的，所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌。
[0009]进一步优选的，所述淋球菌为菌株号为ATCC49226的菌株；所述流感嗜血杆菌为菌株号为ATCC49247或ATCC10211的菌株；所述肺炎链球菌为菌株号为ATCC_? 6303?(血清3型)的菌株；脑膜炎球菌为菌株号为ATCC13090的菌株。
[0010]更优选的细菌为淋球菌，其菌株号为ATCC49226 ;或者为流感嗜血杆菌，其菌株号为 ATCC49247。
[0011]最优选的细菌为流感嗜血杆菌，其菌株号为ATCC49247。
[0012]本发明所述制备IgAl酶的方法中，步骤I)中所述的发酵方法是:
[0013]将细菌复苏后接种于液体培养基中，置37°C 200r/min震荡培养18h，使菌悬液的光吸收值A600为1.0 ；
[0014]将菌悬液以体积比10%的比例接种于液体培养基中，37°C 200r/min震荡培养15-24h后，离心，收集上清液备用；
[0015]步骤2)中所述的分离纯化方法是:
[0016]取步骤I)得到的上清液，在4°C搅拌条件下加入饱和硫酸铵(NH4)2SO4至终浓度为50%，之后静置2h，于4°C离心，收集沉淀，用Tris-HCl缓冲液溶解，即获得IgA蛋白酶粗制品，透析、浓缩后即得。
[0017]本发明的另一个目的是提供一种IgAl酶，其最适作用温度为35_45°C ;最适作用PH值为6-10 ;其底物为正常糖基化或异常糖基化的IgAl ；PMSF和SDS可完全抑制IgAl酶活性，DTT和EDTA则无影响；Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+和Fe2+均可抑制IgAl酶的活性，Ca2+和Mg2+对酶活性影响不明显，而Co2+、Mn2+和Al3+对不同菌种分泌的酶活性影响存在差异性；IgAl酶对底物IgAl的分解作用不受其低糖基化程度的影响。
[0018]并且它是由权利要求1~6任意一项所述的方法制备的。
[0019]本发明的再一方面是提供所述的IgAl酶在制备治疗IgAN的药物中的用途。
[0020]在一个具体的实施例中，本发明制备了稳定的动物模型，制备方法简单，能够用于评价本发明的IgAl酶对沉积于肾组织中的免疫复合物的消化能力。
[0021]在一个具体的实施例中，采用商品化的IgAl酶和从流感嗜血杆菌ATCC49247中提取的IgAl酶注射到动物模型中，评价不同的IgAl酶对体内IgAl的消化能力。
[0022]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0023]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1 IgA患者血清中Jacalin结合蛋白的SDS-PAGE电泳:
[0025]1.1gAl标准品；2.稀释血清；3.50 %饱和(MM)2SO4沉淀；4.Jacalin穿透液；
5.PBS流出液；6.蜜二糖洗脱液I ;7.蜜二糖洗脱液2 ；8.蜜二糖洗脱液3 ；9.蜜二糖洗脱浓缩液
[0026]图2 Western blot鉴定提取的IgAl蛋白:
[0027]1.1gA患者血清；2.过Jacalin纯化柱穿透液；3.PBS流出液；4.过Jacalin柱蜜二糖洗脱液；5.PBS流出液；6-9.过S^hadex G-200分子筛层析流出液
[0028]图3 Jacalin结合蛋白过Sephadex G-200分子筛层析:
[0029]第I峰为plgA，第2峰为mlgA，第3峰为非IgA峰
[0030]图4 IgAl蛋白过Sephadex G-200分子筛层析:
[0031]第I 峰为 plgAl，第 2 峰为 mlgAl
[0032]图5-1商品化的IgAl形成的免疫复合物I的免疫荧光观察图
[0033]图5-2 IgAN患者血清中提取的低糖基化IgAl形成的免疫复合物2的免疫荧光观察图
[0034] 图5-3阴性对照组的免疫荧光观察图
[0035]图5-4同源对照组的免疫荧光观察图
[0036]图6 ELISA法检测不同菌种分泌的IgAl酶活性
[0037]图7-1低糖基化IgAl形成的免疫复合物与NaCl (对照)作用后的免疫荧光观察图
[0038]图7-2低糖基化IgAl形成的免疫复合物与提取自流感嗜血杆菌ATCC49247的IgAl酶作用后的免疫荧光观察图
[0039]图7-3商品化IgAl形成的免疫复合物与NaCl (对照)作用后的免疫荧光观察图
[0040]图7-4商品化IgAl形成的免疫复合物与商品化的IgAl酶作用后的免疫荧光观察图
[0041]图5-1至图5-4，以及图7-1至图7-4中，图a为荧光抗体2:检测IgAl的Fe段；图b为荧光抗体1:检测IgAl的F(ab)段；图(:为荧光抗体3:检测羊抗人抗体的F(ab)段，即免疫复合物中的IgAl的Fab段。
【具体实施方式】
[0042]用于形成免疫复合物的抗原:
[0043]抗原1:购买商品化的人多发性骨髓瘤血衆IgAl, Myeloma (Fitzgrald公司)
[0044]抗原2:从IgAN患者血清中提取的低糖基化IgAl
[0045]用于形成免疫复合物的抗体:
[0046]抗体1:AffiniPure F (ab，)2Fragment Goat Ant1-Human IgG, F (ab，)2FragmentSpecific (Jackson 公司)为特异抗 IgAl 的 IgG
[0047]抗体2:ChromPure Goat IgG.F(ab’)2Fragment (Jackson 公司)，为非特异抗 IgAl的普通的IgG
[0048]荧光抗体:
[0049]荧光抗体1:检测IgAl的F(ab)段
[0050](FITC)-conjugated AffiniPure Rabbit Ant1-Human IgG,F(ab，)2FragmentSpecific (Jackson 公司)
[0051]荧光抗体2:检测IgAl的Fe段
[0052]Mouse monoclonal B35064B4Anti_Human IgAlFc (FITC) ab99793 (abeam 公司)
[0053]荧光抗体3:检测羊抗人抗体的F (ab)段
[0054]Rhodamine (TRITC) - conjugated AffiniPure Rabbit Ant 1-GoatIgG，F(ab，) 2Fragment Specific (Jackson 公司)
[0055]8-10W的Babl/c雌性小鼠购自成都达硕生物科技有限公司
[0056]实施例1本发明IgAl酶的制备
[0057]实验材料:
[0058]流感嗜血杆菌ATCC49247购自上海复祥生物公司；
[0059]商品用IgAl 酶(IgA Protease (Igase Pro-Pro-Y-Pro),商品号:EP0205,MObitec公司)
[0060]1、细菌IgAl酶的制备
[0061]取出甘油保存的流感嗜血杆菌ATCC49247菌种管，室温下解冻，然后接种于哥伦比亚巧克力琼脂平板上，37°C孵箱培养18-24h ;取菌苔进行革兰染色检查，如为无污染的纯培养物，则挑取平板中数个单菌落，接种于3ml加入含有Hemin (终浓度为10 μ g/ml)和β -NAD (终浓度为10 μ g/ml)的心脑浸液液体培养基中，置37°C全温震荡培养箱200r/min培养18h，镜检无污染后用比浊管调整菌液的浊度，使光吸收值A600为1.0 ;取2ml菌悬液接种于200ml的心脑浸液液体培养基中，37°C全温震荡培养箱200r/min培养15_24h。将培养一定时间的细菌悬液在冷冻离心机上以3000r/min的转速离心10min，收集上清备用。
[0062](2)硫酸铵盐析
[0063]取细菌培养上清液100ml，在4°C搅拌条件下缓慢加入饱和硫酸铵(NH4)2SO4至终浓度为50%,注意搅拌过程中不要搅出气泡,之后静置2h于4°C 6000r/min离心15min,收集沉淀，用少量Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L, pH8.2)溶解，即获得IgA蛋白酶粗制品。
[0064](3) IgAl蛋白酶粗制品的透析与浓缩
[0065]将IgA蛋白酶粗制品加入1KD的透析卡中，在Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH8.2)中4°C透析24h，其间更换透析液1_2次并搅动，将透析后的样品于4°C 8000g离心20min,弃去沉淀，收集上清转移入预冷的Amicon-Ultra_15超滤管中(50KD), 5000g离心15min,收集浓缩液，BCA法测蛋白浓度，_20°C冻存。
[0066]实施例2:本发明制备IgAl酶的方法
[0067]菌株号为ATCC49226的淋球菌购自上海复祥生物公司；
[0068](I)取出甘油保存的利用菌种管，室温下解冻，然后接种于哥伦比亚巧克力琼脂平板上，37°C孵箱培养18-24h ;取菌苔进行革兰染色检查，如为无污染的纯培养物，则挑取平板中数个单菌落，接种于3ml的心脑浸液液体培养基中，置37°C全温震荡培养箱200r/min培养18h，镜检无污染后用比浊管调整菌液的浊度，使光吸收值A600为1.0 ;取2ml菌悬液接种于200ml的心脑浸液液体培养基中，37°C全温震荡培养箱200r/min培养15_24h。将培养一定时间的细菌悬液在冷冻离心机上以3000r/min的转速离心10min，收集上清备用。
[0069](2)硫酸铵盐析
[0070]取细菌培养上清液100ml，在4°C搅拌条件下缓慢加入饱和硫酸铵(NH4)2SO4至终浓度为50%,注意搅拌过程中不要搅出气泡,之后静置2h于4°C 6000r/min离心15min,收集沉淀，用少量Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L, pH8.2)溶解，即获得IgA蛋白酶粗制品。
[0071](3) IgAl蛋白酶粗制品的透析与浓缩
[0072]将IgAl蛋白酶粗制品加入1KD的透析卡中，在Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH8.2)中4°C透析24h，其间更换透析液1_2次并搅动，将透析后的样品于4°C 8000g离心20min,弃去沉淀，收集上清转移入预冷的Amicon-Ultra_15超滤管中(50KD), 5000g离心15min，收集浓缩液，BCA法测蛋白浓度，_20°C冻存。
[0073]实施例3本发明IgAl酶的制备
[0074](I)脑膜炎球菌(ATCC13090)/肺炎链球菌(ATCC? 6303?(血清3型))/流感嗜血杆菌(ATCC10211)的培养
[0075]以上菌株均购自购自上海复祥生物公司；
[0076]取出甘油保存的脑膜炎球菌/肺炎链球菌/流感嗜血杆菌菌种管，室温下解冻，然后接种于哥伦比亚巧克力琼脂平板上，37°C孵箱培养18-24h ;取菌苔进行革兰染色检查，如为无污染的纯培养物，则挑取平板中数个单菌落，接种于3ml的心脑浸液液体培养基中，而流感嗜血杆菌的心脑浸液液体培养基于临用前在无菌条件下加入lmg/ml的Hemin贮存液(终浓度为10 μ g/ml)和10mg/ml的β -NAD贮存液(终浓度为10 μ g/ml)，置37°C全温震荡培养箱200r/min培养18h，镜检无污染后用比浊管调整菌液的浊度，使光吸收值A600为1.0 ;取2ml菌悬液接种于200ml的心脑浸液液体培养基中，37°C全温震荡培养箱200r/min 培养 15-24h。
[0077](2)变异链球菌的培养
[0078]取出甘油保存的变异链球菌菌种管，室温下解冻，接种于BHI琼脂平板，置于厌氧培养箱中于37°C、混合气(80% N2,10% CO2,10% H2)条件下培养48h ;涂片及革兰染色检查为纯培养物后，无菌接种环刮取平板上的各种变链菌株，接种于3ml BHI液体培养基中，将厌氧罐置于37°C全温震荡培养箱200r/min培养18h，镜检无污染后用比浊管调整菌液浊度，使光吸收值A600为1.0 ;取2ml菌悬液按照1:100比例(v/v)分别接种于BHI液体培养基中，37°C全温震荡培养箱200r/min培养15_24h。
[0079]将培养一定时间的细菌悬液在冷冻离心机上以3000r/min的转速离心1min,收集上清备用。
[0080](3)硫酸铵盐析
[0081]取细菌培养上清液100 ml，在4°C搅拌条件下缓慢加入饱和硫酸铵(NH4)2SO4至终浓度为50%,注意搅拌过程中不要搅出气泡,之后静置2h于4°C 6000r/min离心15min,收集沉淀，用少量Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L, pH8.2)溶解，即获得IgA蛋白酶粗制品。
[0082](4) IgAl蛋白酶粗制品的透析与浓缩
[0083]将IgAl蛋白酶粗制品加入1KD的透析卡中，在Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH8.2)中4°C透析24h，其间更换透析液1_2次并搅动，将透析后的样品于4°C 8000g离心20min,弃去沉淀，收集上清转移入预冷的Amicon-Ultra_15超滤管中(50KD), 5000g离心15min,收集浓缩液，BCA法测蛋白浓度，_20°C冻存。
[0084]实施例4制备IgAN动物模型
[0085]制备免疫复合物I
[0086]将抗原I (商品化的IgAl)与抗体I按照1:1浓度比例形成免疫复合物1:
[0087]将商品化IgAl 稀释至 lmg/ml 与 lmg/ml Goat ant1-human F (ab) 2 抗体，即抗体 I混合，室温放置5min后，取5 μ I滴在洁净载玻片上，显微镜下观察可见有明显复合物形成，将形成的复合物置4°C保存备用。
[0088]制备免疫复合物2
[0089]1、从IgAN患者血清中提取低糖基化IgAl
[0090]将IgAN患者IgAl血清样品通过硫酸铵沉淀、阴离子交换进行初步分离纯化后，利用凝集素Jacalin对IgAl的糖链末端特异结合的特性,通过Jacalin亲和层析柱制备IgAl亚型纯品，利用葡聚糖凝胶S^hadex G-200可分离5-600KD分子量范围内的蛋白质原理，将IgAl通过Sephadex G-200分子筛层析柱进一步分离获得不同形式的IgAl。(用于形成免疫复合物的是包含单体和多聚体两种形式的总IgAl，即混合不同形式的IgAl)
[0091]1.1硫酸铵沉淀
[0092]步骤:取血清5.0ml于小试管中，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵5.0ml，防止形成团块降低沉淀物的特异性，混匀后室温静置30min或置4°C冰箱过夜，高速低温离心10000rpm，10分钟，将上清液(含白蛋白)弃去，取沉淀物(含球蛋白)溶于0.02mol/L Tris缓冲液(pH8.0)中，重复洗涤一次，加入2ml0.02mol/L Tris缓冲液(ρΗ8.0)溶解，此液即为粗提的Y —球蛋白溶液，将溶解的粗提液转移到1KD的透析卡中，置于盛适量Tris缓冲液的大烧杯中，4°C搅拌情况下透析过夜，用纳氏试剂检测水中的NH4+，直到阴性为止。
[0093]1.2DEAE52-纤维素离子交换层析
[0094]材料:样品(经pH8.0,0.02Μ Tris缓冲液透析过的正常人血清)，DEAE —纤维素(阴离子交换剂)，2.5 X 25cm层析柱及不同离子强度的Tris洗脱剂。
[0095]步骤:用0.02M Tris缓冲液(pH8.0)平衡柱子，将透析袋内的蛋白质溶液用
0.22um的过滤器过滤后缓慢加入层析柱上，开下端出口，使样品进入柱床，吸附的蛋白质，用连续增加NaCl的浓度来洗脱，用线性梯度缓冲液(20-200mmol/L NaCl)洗脱，流速Iml/min,分部收集洗脱液1.5ml/管。
[0096]1.3 Jacalin 亲和层析
[0097]试剂
[0098](1)0.1M, PH7.4 磷酸盐缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline, PBS)。(2)0.1M蜜二糖/PBS Elut1n Buffer:,
[0099](3)0.02% NaN3
[0100]实验步骤:
[0101](I)用5倍柱体积的PBS液平衡层析柱；
[0102](2)将样品手动加入Immobilized Jacalin亲和层析柱，4°C孵育30min ；
[0103](3)用10倍柱体积的PBS洗柱(或直至洗脱液在280nm的光吸收度低于0.01)，血清中的IgAl将吸附于层析柱上，不与柱子结合的蛋白质随缓冲液流出柱外，弃去洗脱液；
[0104](4)用5倍柱体积的0.1M蜜二糖/0.1M PBS (PH7.4)0.5ml/min洗脱层析柱至紫外分光光度仪280nm波长下光吸收度低于0.01，吸附于柱上的血清IgAl将随溶液流出，2ml/管子收集洗脱液；
[0105](5)再用10倍柱体积PBS平衡层析柱，柱子保存于含0.02% NaN3的超纯水中:
[0106](6)将洗脱液转移入分子限量1KD的透析袋中，结扎，用相对分子质量为20000的聚乙二醇(PEG)4°C浓缩。
[0107]1.4Superdex200 凝胶柱层析
[0108]试剂
[0109]0.05M PB/0.15M NaCl 缓冲液(PH7.2)
[0110]实验步骤:
[0111](I)将浓缩洗脱液上样于S^hacryl S200分子筛层析柱；
[0112](2)用 3 倍柱体积的 0.05M PB/0.15M NaCl 缓冲液(PH7.2) 0.5ml/min 洗柱，每种IgAl中含有不同分子量成分将按照分子量由大到小的顺序随缓冲液流出柱外，共有3个洗脱峰，分别为多聚 IgAl (polymeric IgAl,plgAl)、单体 IgAl (monomeric IgAl’mlgAl)和其他非IgAl蛋白；
[0113](3)收集峰I和峰2洗脱液，PEG20000浓缩后，重复上样，再次洗脱，此次有2个洗脱峰，收集各峰洗脱液，混合后得到纯品IgAl，PEG20000浓缩后保存于EP管中，BCA法测蛋白浓度。
[0114](4)胶体的再生与保存:用0.5mol/L NaCl溶液浸泡胶体30min，倾去NaCl溶液，蒸馏永冲洗数次，再用缓冲液充分平衡即可。
[0115]1.5western blot 法验证提取的 IgAl
[0116]SDS-PAGE电泳后，转膜，5%脱脂牛奶封闭lh，加入TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgAl抗体(a链，SouthernB1tech公司)，37°C杂交袋中孵育2h，TBST洗3次，进行化学发光反应。
[0117]纯化提取结果:分离纯化血清IgA的SDS-PAGE电泳结果如图1所示。WesternBlot法鉴定提取的血清IgAl如图2所示。Jacalin结合蛋白过Sephadex G-200分子筛层析分离结果如图3所示。不同形式IgAl过Sephadex G-200分子筛层析分离结果如图4所示。
[0118]2、制备免疫复合物
[0119]将抗原2 (按照上述方法从患者血清提取的低糖基化IgAl)与抗体I按照2:1的浓度比例体外形成免疫复合物2:
[0120]将制备的IgAl 稀释至 2mg/ml 与 lmg/ml Goat ant1-human F(ab)2 抗体混合,室温放置5min后，取5μ I滴在洁净载玻片上，显微镜下观察可见有明显复合物形成，将形成的复合物置4°C保存备用。
[0121]动物模型的制备
[0122]将免疫复合物I和免疫复合物2尾静脉注射到小鼠体内，构建类似于IgAN患者的免疫复合物沉积的动物模型。
[0123]3.1实验分组:
[0124]随机选取8-10W的Babl/c雌性小鼠30只，进行分组，每组5只。
[0125]3.2尾静脉注射:
[0126]实验组I注射750 μ I的免疫复合物I (商品化IgAl+抗体I);实验组2注射750μ1的免疫复合物2 (血清提取的低糖基化IgAl+抗体I);阴性对照组分别为注射商品化IgAl或血清提取的低糖基化IgAl+NaCl ;同源对照组分别为注射商品化IgAl或血清提取的低糖基化IgAl与抗体2形成的免疫复合物3 ；
[0127]3.3检测免疫荧光，判断免疫复合物的沉积程度
[0128](I)分别在lh、4h、8h、16h、24h，颈处死小鼠，取小鼠肾组织，做冰冻切片；
[0129](2)免疫荧光检测各时间点肾脏IgAl及含IgAl的免疫复合物沉积情况(通过三种荧光来检测IgAl的沉积，这里的IgAl包括游离的IgAl，也包括复合物中的IgAl)。通过荧光抗体I和荧光抗体2来检测IgAl沉积情况，另用荧光抗体3来检测免疫复合物中抗体的沉积情况。
[0130](3)动物实验荧光染色方法
[0131 ] I)取各组织切片，每只小鼠选取3个标本，双蒸水脱胶后用圈存笔圈存组织，冷丙酮 4°C固定 5 - lOmin, PBST 洗 5minX3 次。
[0132]2)封闭:各标本加入即用型兔血清30 - 40 μ 1,37度温箱湿盒内孵育lh，PBST洗5minX 3 次。
[0133]3)避光下，将按1:50稀释的兔抗人IgG-Fab和兔抗羊IgG-Fab30ul共同加入一标本上，1:50稀释的鼠抗人IgA - Fc30ul加入另一标本，第三个标本则加入PBS做阴性对照，37°C温箱湿盒内孵育45min，PBST洗5minX7次。
[0134]4)各标本上加入1:5000稀释的DAPI30 - 40 μ 1，室温湿盒内孵育3min，PBST洗3min。
[0135]5)封片:各标本上加入15 μ I抗焚光淬灭剂，倾斜盖上盖玻片，正置焚光显微镜下观察。
[0136]实验结果:在荧光显微镜下，与阴性对照组(如图5-3)和同源对照组(如图5-4)相比，无论是免疫复合物I (如图5-1)还是免疫复合物2 (如图5-2)均能明显观察到免疫复合物在肾小球系膜区的沉积现象。在注入小鼠体内Ih到8h内，荧光强度无明显差别，16h时荧光强度有逐渐增强趋势，24h时的荧光强度明显强于8h，差异有统计学意义(P < 0.05)。
[0137](表1为4h时的荧光面积和强度)
[0138]表1免疫荧光分析结果(5=s)
[0139]
【权利要求】
1.一种制备IgAl酶的方法，包括以下步骤: 1)以细菌作为发酵菌株，发酵完成后，得到发酵液；所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌或变异链球菌； 2)分离纯化发酵液，得IgAl酶。
2.根据权利要求1所述的制备IgAl酶的方法，其特征是:所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌。
3.根据权利要求1~2任一一项所述的制备IgAl酶的方法，其特征是:所述淋球菌为菌株号为ATCC49226的菌株；所述流感嗜血杆菌为菌株号为ATCC49247或ATCC10211的菌株；所述肺炎链球菌为菌株号为ATCC? 6303?(血清3型)的菌株；脑膜炎球菌为菌株号为ATCC13090的菌株。
4.根据权利要求3所述的制备IgAl酶的方法，其特征是:所述的细菌为淋球菌，其菌株号为ATCC49226 ;或者为流感嗜血杆菌，其菌株号为ATCC49247。
5.根据权利要求4所述的制备IgAl酶的方法，其特征是:所述的细菌为流感嗜血杆菌，其菌株号为ATCC49247。
6.根据权利要求1所述的制备IgAl酶的方法，其特征是: 步骤I)中所述的发酵方法 是: 将细菌复苏后接种于液体培养基中，置37°C 200r/min震荡培养18h，使菌悬液的光吸收值A600为1.0 ； 将菌悬液以体积比10%的比例接种于液体培养基中，37°C 200r/min震荡培养15_24h后，离心，收集上清液备用； 步骤2)中所述的分离纯化方法是: 取步骤I)得到的上清液，在4°C搅拌条件下加入饱和硫酸铵(NH4)2SO4至终浓度为50%，之后静置2h，于4°C离心，收集沉淀，用Tris-HCl缓冲液溶解，即获得IgA蛋白酶粗制品，透析、浓缩后即得。
7.—种IgAl酶，其特征是:其最适作用温度为35-45°C ;最适作用PH值为6_10。
8.根据权利要求7所述的IgAl酶，其特征是:其底物为低糖基化的IgAl。
9.根据权利要求7所述的IgAl酶，其特征是:它是由权利要求1~6任意一项所述的方法制备的。
10.权利要求7所述的IgAl酶在制备治疗IgAN的药物中的用途。
【文档编号】C12R1/46GK104073474SQ201410299797
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】樊均明, 王丽, 文集, 李雪英 申请人:樊均明