早期膀胱癌的多靶标检测方法

文档序号:480990阅读:268来源:国知局
早期膀胱癌的多靶标检测方法
【专利摘要】本发明早期膀胱癌的多靶标检测方法,属于生物检测【技术领域】。包括下述步骤:(1)提取患者尿液中所含的DNA;(2)对步骤(1)获得的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理;(3)通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154这七个标志物基因进行检测,以ALU-C4作为内参基因;(4)以步骤(3)中的CT值来判定患者是否为早期膀胱癌。本发明具有以下优点:采用多个生物标志物基因联合检测,在每个标志物的特异性都比较高的前提下,使用多个标志物联用的方式来提高检测的敏感性和特异性;根据多个生物标志物基因设计了特异性引物。
【专利说明】早期膀胱癌的多靶标检测方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】,具体涉及早期膀胱癌的多靶标检测方法。

【背景技术】
[0002] 膀胱癌在全球发病率位列第五。在大多数情况下,约75%的患者处于Ta或T1期, 即非肌肉浸润性膀胱:癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC),而剩下的25%肿 瘤处于肌肉入侵阶段T2-T4癌症(muscle invasive bladder cancer,MIBC)。约605^-70% 的匪IBC肿瘤患者的切除后3年内复发[h]。复发病人中大部分会周期性复发而癌症级别 不会进一步恶化,但约25%的病人会发展为MIBC。由于高复发率和恶化的风险,早诊断,早 治疗,频繁的长期监测对于膀胱癌患者提高生存率十分重要。
[0003] 传统的膀胱癌检查是膀胱镜检查和细胞学活检,但膀胱镜检查属于有创检查,费 用高且会给患者带来一定痛苦,其结果可能会受操作者主观判断而带来一定的误差;而细 胞学活检则存在灵敏度低的缺陷(34%左右)。因此无创检测,高灵敏高特异性是未来膀胱 癌检测和监控手段发展的方向。
[0004] 膀胱癌无创检测的关键在于寻找高灵敏高特异性生物标记物,目前这也是膀胱癌 研究的一大热点,研究报道很多,目前已有部分标记物已在临床上使用,如下表(Cheung et al.BMC Medicine 2013, 11:13)
[0005]

【权利要求】
1. 早期膀胱癌的多靶标检测方法,包括下述步骤: (1) 、提取患者尿液中所含的DNA ; (2) 、对步骤(1)获得的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理; (3) 、通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、⑶F15、NID2、PCDH17、P0U4F2、TCF21、 ZNF154这七个标志物基因进行检测,以ALU-C4作为内参基因; (4) 、以步骤(3)中标志物基因的相对甲基化水平值与其检出限之间的大小判定患者 是否为早期膀胱癌,当任何一个标志物基因的相对甲基化水平值高于其检出限,该患者为 早期膀胱癌患者。
2. 根据权利要求1所述的早期膀胱癌的多靶标检测方法,其特征在于,步骤(1)中的 DNA总量>500纳克,片段大小>10kb。
3. 根据权利要求1所述的早期膀胱癌的多靶标检测方法,其特征在于,步骤(3)中的针 对ALU-C4的上游引物序列为SEQ No. 1,下游引物序列为SEQ No. 2 ;针对EOMES的上游引物 序列为SEQ No. 3,下游引物序列为SEQ No. 4;针对⑶F15的上游引物序列为SEQ No. 5,下游 引物序列为SEQ No. 6 ;针对NID2的上游引物序列为SEQ No. 7,下游引物序列为SEQ No. 8 ; 针对P⑶H17的上游引物序列为SEQ No. 9,下游引物序列为SEQ No. 10 ;针对P0U4F2的上 游引物序列为SEQ No. 11,下游引物序列为SEQ No. 12 ;针对TCF21的上游引物序列为SEQ No. 13,下游引物序列为SEQ No. 14 ;针对ZNF154的上游引物序列为SEQ No. 15,下游引物序 列为 SEQ No. 16。
4. 根据权利要求1或3所述的早期癌症的多靶标检测方法,其特征在于,步骤⑶中针 对 E0MES、⑶F15、NID2、PCDH17、P0U4F2、TCF21、ZNF154 和 ALU-C4 的引物联合使用。
5. 根据权利要求1所述的早期膀胱癌的多靶标检测方法,其特征在于,步骤(4)的具体 过程为: (a) 、用 8 个基因 ALU-C4、E0MES、⑶F15、NID2、PCDH17、P0U4F2、TCF21、ZNF154 的每对 引物纯化后的qPCR产物制作标准曲线,做出每对引物的标准曲线;通过标准曲线定出每个 基因的实际甲基化的拷贝数; (b) 、将(a)得到的每个拷贝数代入公式一,计算出每一个标志物基因的相对甲基化水 平值; 公式一:相对甲基化水平值=[(gene/ALU) sample/ (gene/ALU) Standard] X 1000 (c) 、步骤(b)所得的标志物基因的相对甲基化水平值高于对应标志物基因的检出限 判定为阳性,等于或低于检出限判定为阴性;任一标志物基因为阳性则判定该患者为早期 膀胱癌患者。
【文档编号】C12Q1/68GK104141009SQ201410310846
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】蔡志明, 吴松, 于源, 叶睿, 李巧玲, 王永强 申请人:蔡志明, 吴松
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1