一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法，包括以下步骤：制备产番茄红素的大肠杆菌菌株，将大肠杆菌菌株中的野生型crp基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-crp，通过碱基替换：得到优化的重组载体pKSC-crp1；最后用pKSC-crp1中的crp1基因替换野生型crp基因，得到番茄红素高产量的菌株。本发明通过对大肠杆菌菌株中的野生型crp基因的碱基替换A26T，影响其所调控的各种基因的转录水平，调节番茄红素合成直至整个菌体的代谢网络，进而提高番茄红素在大肠杆菌中的合成能力。此方法能有效提高大肠杆菌合成番茄红素的能力，对利用大肠杆菌工业化生产番茄红素具有重要的意义。
【专利说明】一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工领域，特别涉及一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法。
【背景技术】
[0002]番茄红素是一种长链不饱和碳氢化合物，是自然界中抗氧化性最强的类胡萝卜素。番茄红素广泛存在于红色的水果蔬菜中，具有抗氧化、抗癌、降血脂、提高免疫力等功能，在新型保健食品、化妆品和药品中都具有广阔的应用前景，是一种很有发展前途的新型功能性天然色素。
[0003]番茄红素生产方法主要有天然提取法、化学合成法和微生物发酵法三种。从生产原料和成本、工艺以及产品活性和纯度等方面综合考虑，微生物发酵法具有明显的优势，是番茄红素理想的产业化生产方法。特别是随着转基因技术的迅速发展，利用基因工程菌生产番茄红素已成为研究的热点。
[0004]转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，它控制着基因转录的开关、增强或减弱。其中，全局转录因子处于整个转录调控网络的顶端，是一类可以调节不同代谢途径中大量基因的转录因子。大肠杆菌中共有七个全局转录因子，它们能直接调控菌体内超过50%基因的转录。不仅如此，全局转录因子还能通过调控其它的转录因子，来间接控制被调控因子所负责的基因的转录表达。CRP (碳代谢总体调控蛋白)是大肠杆菌的一个重要的全局转录因子，研究表明大肠杆菌中超过95%的基因都能被CRP所直接或间接的调控。因此，可通过调控CRP这个全局转录因子，优化大肠杆菌中番茄红素合成的整体代谢网络，提高番茄红素在大肠杆菌中的合成能力。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法，包括以下步骤:
1.制备产番爺红素的大肠杆菌菌株:crtE、crtB、crtl是合成番爺红素所需的酶,将这三种酶的基因通过同源重组(λ-red)转入大肠杆菌(BW25113)，得到产番茄红素的大肠杆菌菌株BW25113-BIE ；
2.将大肠杆菌菌株中的野生型crp基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-crp ； crp的基因序列如SEQ ID N0.1所示；crp的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；pKSC质粒的基因序列如SEQ ID N0.3所示；重组载体pKSC-crp的基因序列如SEQ ID N0.4所示；
3.碱基替换:将步骤(2)得到的重组载体pKSC-crp上的crp基因进行碱基替换:A26T，得到优化的重组载体pKSC-crpl ；pKSC-crpl的基因序列如SEQ ID N0.11所示；4.用pKSC-crpl中的crpl基因替换步骤(1)得到的产番茄红素的大肠杆菌菌株BW25113-BIE中的野生型crp基因，得到番茄红素高产量的菌株BW25113-BIE crp:: crp I ；crpl的基因序列如SEQ ID N0.5所示；
本发明的有益效果是:通过对大肠杆菌菌株中的野生型crp基因的碱基替换A26T，影响其所调控的各种基因的转录水平，主要调控了代谢合成相关基因、膜合成相关基因、转运相关基因、氧化还原相关基因和其它一些转录因子，从而优化番茄红素合成直至整个菌体的代谢网络，进而提高番茄红素在大肠杆菌中的合成能力，对利用大肠杆菌工业化生产番茄红素具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1:重组载体pKSC-crp结构示意图；
图2:本发明菌株BW25113-BIE crp:: crp I生产番茄红素结果图。
【具体实施方式】
[0008]该野生型crp的DNA序列及氨基酸序列分别在SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2中给出。
[0009]本发明的转化细胞可以使用大肠杆菌细胞。上述转化细胞可以通过电穿孔法、氯化钙法等公知的方法将重组载体导入细胞进行制备。作为重组载体及转化细胞的具体例中，可以举出下列实施例中给出的重组载体pKSC-crp和用此载体得到的转化大肠杆菌BW25113/pKSC-crp。
[0010]番茄红素在大肠杆菌中是在胞内积累的，这使得产番茄红素的大肠杆菌在平板上呈现红色。
[0011]基于以上原理，本发明一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法，包括以下步骤:
1.制备产番爺红素的大肠杆菌菌株:crtE、crtB、crtl是合成番爺红素所需的酶,将这三种酶的基因通过同源重组(λ-red)转入大肠杆菌(BW25113)，得到产番茄红素的大肠杆菌菌株(BW25113-BIE)；
2.将大肠杆菌菌株BW25113中的野生型crp基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-crp ;野生型crp的基因序列如SEQ ID N0.1所示,野生型crp的氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示，pKSC质粒的基因序列如SEQ ID N0.3所示,重组载体pKSC-crp的基因序列如SEQ ID N0.4 所示；
3.碱基替换:将步骤(2)得到的重组载体pKSC-crp上的crp基因进行碱基替换:A26T，得到优化的重组载体pKSC-crpl ；pKSC-crpl的基因序列如SEQ ID N0.11所示；
4.用pKSC-crpl中的crpl基因替换步骤(1)得到的产番茄红素的大肠杆菌菌株中的野生型crp基因，得到番茄红素高产量的菌株BW25113-BIE crp:: crp I ；crpl的基因序列如SEQ ID N0.5 所示。
[0012] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0013]实施例1，一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素的方法，包括以下步骤:1.制备产番爺红素的大肠杆菌菌株:crtE、crtB、crtl是合成番爺红素所需的酶,将这三种酶的基因通过同源重组(λ-red)转入大肠杆菌(BW25113)，得到产番茄红素的大肠杆菌菌株(BW25113-BIE)；
2.将大肠杆菌菌株中的野生型CRP基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-crp；野生型crp的基因序列如SEQ ID N0.1所示，野生型crp的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，pKSC质粒的基因序列如SEQ ID N0.3所示，重组载体pKSC-crp的基因序列如SEQ IDN0.4所示；
3.碱基替换:将步骤(2)得到的重组载体pKSC-crp上的crp基因通过以下三种方式进行碱基替换:
1)A26T，得到优化的重组载体pKSC-crpl ；crpl的基因序列如SEQ ID N0.5所示；crpl的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示；pKSC-crpl的基因序列如SEQ ID N0.11所示；
2)A159C，得到优化的重组载体pKSC-crp2;crp2的基因序列如SEQ ID N0.7所示；crp2的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示；pKSC-crp2的基因序列如SEQ ID N0.12所示；
3)G424A，得到优化的重组载体pKSC-crp3;crp3的基因序列如SEQ ID勵.9所示，(:印3的氨基酸序列如SEQ ID N0.10所示；pKSC-crp3的基因序列如SEQ ID N0.13所示；
4.将步骤(2)得到的重组载体pKSC-crp以及步骤3得到的三个优化的重组载体pKSC-crpl、pKSC-c rp2、pKSC_crp3分别转入步骤(1)得到的产番茄红素的大肠杆菌菌株中，得到 4 个大肠杆菌菌株，分别为 BW25113-BIE/pKSC-crp、BW25113-BIE/pKSC-crp I,BW25113-BIE/pKSC-crp2、BW25113_BIE/pKSC_crp3。
[0014]5.检测步骤(4)的得到的4个大肠杆菌菌株番茄红素产量，挑选番茄红素产量最高的大肠杆菌菌株，步骤如下:
5.1将步骤(4)的得到的4个大肠杆菌菌株分别接种于5ml LB培养基中，所述LB培养基中含34 μ g/ml氯霉素、50 μ g/ml卡那霉素，37 °C培养12 h ；
5.2分别取步骤(5.1)得到的4种培养液1ml，分别接种到100 ml的LB培养基中，37
°C培养24 h ;所述LB培养基中含34 μ g/ml氯霉素、50 μ g/ml卡那霉素；
5.3将步骤(5.2)得到的4种培养液，分别用小型离心机离心，12000rpm离心5min后收集菌体，并用去离子水清洗；
5.4用丙酮在55°C，黑暗环境中萃取番茄红素，并在OD472条件下测量其吸光度值；
4 个大肠杆菌菌株，BW25113-BIE/pKSC-crp、BW25113-BIE/pKSC-crp I, BW25113-BIE/
pKSC-crp2、BW25113-BIE/pKSC-crp3的番茄红素产量测定结果如表1所示:
表1:大肠杆菌菌株的番爺红素产量碱基替换I大肠杆菌菌株I番茄红素产量(mg/g)—
_BW25113-BIE/pKSC-crp19.39_
A26T BW25113-BIE/pKSC-crpl~21.24
A159C BW25113-BIE/pKSC-crp2~20.56
~G424A |BW25113-BIE/pKSC-crp320.17
由表1可知，通过A26T碱基替换后得到的菌株BW25113-BIE/pKSC-crpl具有最高的番茄红素产量。
[0015]6.用菌株BW25113-BIE/pKSC-crpl中的crpl基因替换步骤(1)得到的产番茄红素的大肠杆菌菌株中的野生型crp基因，替换方法如下:6.1在BW25113-BIE/pKSC-crpl菌株的crpl基因连接卡那霉素抗性基因，并用重组同源臂引物扩增含有crpl基因及卡那霉素抗性基因的基因盒，重组同源臂引物crp_RED_for的基因序列如SEQ ID N0.14所示；重组同源臂引物crp_RED_rev的基因序列如SEQ IDN0.15 ;所示基因盒序列如SEQ ID N0.16所示；
6.2此基因盒通过大肠杆菌重组系统(λ -red)重组到步骤(1)得到的产番茄红素的大肠杆菌菌株中的野生型crp基因上，得到菌株BW25113-BIE crp:: crp I ；
7.检测菌株BW25113-BIEcrp:: crpl与原始菌株番茄红素产量，步骤如下:
7.1把菌株BW25113-BIE crp::crpl和原始菌株分别接种于5ml LB培养基中，所述LB培养基中含34 μ g/ml氯霉素，37 °C培养12 h ；
7.2分别取步骤(7.1)得到的2种培养液4mL，分别接种到400 ml LB培养基中，所述LB培养基中含34 μ g/ml氯霉素，37 °C培养，培养到生长对数期，作为二级种子液；
7.3将步骤(7.2)得到的两种二级种子液400 ml接种到两个1L发酵罐中，进行发酵；
7.4每隔2h取步骤(7.3)的发酵液5mL，用小型离心机离心，12000rpm离心5min后收集菌体，并用去离子水清洗一遍菌体；
7.5用丙酮在55°C，黑暗环境中萃取番茄红素，并在OD472条件下测量其吸光度值；产量测定结果如图2所示。
【权利要求】
1.一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备产番爺红素的大肠杆菌菌株:crtE、crtB、crtl是合成番爺红素所需的酶，将这三种酶的基因通过同源重组转入大肠杆菌，得到产番茄红素的大肠杆菌菌株BW25113-BIE ； (2)将大肠杆菌菌株中的野生型crp基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-crp；野生型crp的基因序列如SEQ ID N0.1所示，野生型crp的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，pKSC质粒的基因序列如SEQ ID N0.3所示，重组载体pKSC-crp的基因序列如SEQ IDN0.4所示； (3)碱基替换:将步骤2得到的重组载体pKSC-crp上的crp基因进行碱基替换:A26T，得到优化的重组载体pKSC-crpl ;crpl的基因序列如SEQ ID N0.5所示,crpl的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，pKSC-crpl的基因序列如SEQ ID N0.11所示； (4)用pKSC-crpl中的crpl基因替换步骤I得到的产番茄红素的大肠杆菌菌株BW25113-BIE中的野生型crp基因，得到番茄红素高产量的菌株BW25113-BIE crp::crpl。
【文档编号】C12N1/21GK104073459SQ201410311356
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】黄磊, 濮悦, 徐志南, 蔡谨 申请人:浙江大学