一种重组人cytl1蛋白的表达方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种重组人CYTL1蛋白的表达方法，所述方法为将SEQ?ID:NO.1进行原核表达。本发明首次采用基因重组技术进行规模制备CYTL1蛋白，表达的重组人类源类细胞介素1-CYTL1蛋白为可溶性蛋白，并且证明了该重组蛋白能够促进软骨细胞的增殖。
【专利说明】-种重组人CYTL1蛋白的表达方法和用途 【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白质的表达方法，具体涉及一种重组人CTYL1蛋白的表达方法 和用途。 【背景技术】
[0002] 关节软骨是一种独特的结缔组织，由软骨细胞和软骨基质组成，软骨损伤的修复 依赖软骨细胞分泌来完成。由于软骨组织内无血管，软骨细胞被嵌入由II型胶原和蛋白多 糖组成的致密的固体基质中，无法移动到缺损部位，因此，即使是很小的缺损也难以自行修 复。关节软骨损伤在临床上较常见，目前对其治疗分为预防和对症治疗两种，有症状的病人 可用药物和手术治疗进行干预，但这些手段并不能从根本上阻止病情的发展，因此人们一 直在积极寻找更有效的治疗与预防措施。
[0003] 细胞因子是由造血系统、免疫系统或炎症反应中的活化细胞产生，能调节刺激细 胞分化增殖和诱导细胞发挥功能，是高活性多功能的多肽、蛋白质或糖蛋白，对机体抗御疾 病、维持生理功能及促进组织器官的修复与再生等方面具有重要意义。自从1957年世界 上第一种高效干扰病毒繁殖的细胞因子-干扰素被发现以后，细胞因子以其高度生物学活 性、高特异性作用等优点受到医学及生物学领域的高度重视，至今相继发现了几十种生长 因子并应用于临床，获得了良好的防治效果。
[0004] 在软骨修复研究领域中，主要应用的细胞因子包括骨形态发生蛋白（BMP)、胰岛素 样生长因子（IGF)、血小板源性生长因子（PDGF)、软骨调节素（ChM)等。目前，该种类细胞 因子作用复杂，并具有多重调节作用，在促进软骨组织修复的同时，也容易做成其他组织的 增生（如纤维组织），导致新生软骨组织骨化或纤维化，影响再生组织的生物学功能。此外， 商品化的外源性细胞因子多依赖国外进口，价格十分昂贵。
[0005] 在鼠的动物模型研究中发现了 一种新型的生长因子-类细胞介素 1 (Cytokine-likel，CYTL1)对软骨的生成具有独特的调控作用，主要在软骨细胞和软骨组 织中表达，在骨髓间充质干细胞中（Mesenchymal Stem Cells, MSC)表达量很低，能诱导MSC 向软骨细胞方向转化，在软骨形成后CYTL1含量明显增加 （Kim JS等，J Biol Chem. 2007)。 CYTL1通过刺激Sox9转录活性来增加软骨生成；并能提高胰岛素样生长因子的表达，进一 步促进软骨组织再生。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种重组人CYTL1蛋 白的表达方法，还提供了采用该方法表达的重组人CYTL1蛋白以及所述重组人CYTL1蛋白 的用途。
[0007] 为实现上述目的，所采取的技术方案：一种重组人CYTL1蛋白的表达方法，所述方 法为将SEQ ID:N0. 1进行原核表达。SEQ ID:N0. 1为人CYTL1蛋白⑶S中去除信号肽序列 后剩余的DNA序列，SEQ ID:N0. 1如下：
[0008] ACTCCCCCGACCTGCTACTCCCGCATGCGGGCCCTGAGCCAGGAGATCACCCGCGACTTCAACCTCCTG CAGGTCTCGGAGCCCTCGGAGCCATGTGTGAGATACCTGCCCAGGCTGTACCTGGACATACACAATTACTGTGTGCT GGACAAGCTGCGGGACTTTGTGGCCTCGCCCCCGTGTTGGAAAGTGGCCCAGGTAGATTCCTTGAAGGACAAAGCAC GGAAGCTGTACACCATCATGAACTCGTTCTGCAGGAGAGATTTGGTATTCCTGTTGGATGACTGCAATGCCTTGGAA TACCCAATCCCAGTGACTACGGTCCTGCCAGATCGTCAGCGCTAG〇
[0009] 其对应的氨基酸序列如下：
[0010] TPPTCYSRMRALSQEITRDFNLLQVSEPSEPCVRYLPRLYLDIHNYCVLDKLRDFVASPPCWKVAQVDS LKDKARKLYTIMNSFCRRDLVFLLDDCNALEYPIPVTTVLPDRQR
[0011] 优选地，所述原核表达中PCR扩增引物是：
[0012] 正向引物：5 ' -GAAAAGCTTCACACTCCCCCGACCTGCTACT-3 ' ；
[0013] 反向引物：5 ' -TATAGAATTCCTAGCGCTGACGATC-3 '。
[0014] 优选地，所述原核表达中选用的双酶切位点分别为Xmn I和EcoR I酶切位点。
[0015] 优选地，所述原核表达中原核表达载体为pFL-B13cl。
[0016] 优选地，所述原核表达中宿主菌为Ε· coli BL21 (Gold) (DE3)。
[0017] 优选地，所述原核表达中采用IPTG诱导表达，IPTG终浓度为0. 05?0. ImM，培养 温度为37 V。
[0018] 优选地，所述原核表达中采用镍亲和层析法纯化重组人CYTL1蛋白。
[0019] 优选地，所述镍亲和层析中洗脱缓冲液含250mM咪唑。
[0020] 本发明还提供了一种重组人CYTL1蛋白，所述重组人CYTL1蛋白采用上述所述方 法表达而得。
[0021] 本发明还提供了上述所述重组人CYTL1蛋白在制备促进软骨细胞增殖药物中的 用途。
[0022] 本发明的有益效果在于：本发明首次采用基因重组技术进行规模制备CYTL1蛋 白，表达的重组人类源类细胞介素 1-CYTL1蛋白为可溶性蛋白，并且证明了该重组蛋白能 够促进软骨细胞的增殖。 【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为本发明所述人软骨细胞CYTL1蛋白cDNA的PCR扩增产物的电泳图；
[0024] 图2为本发明所述PFL_B13cl载体双酶切后的电泳图，1为酶切前，2为酶切后；
[0025] 图3为双酶切后的载体与目的片段的连接示意图；
[0026] 图4为本发明所述转化子菌落PCR的电泳图；
[0027] 图5为本发明所述阳性转化子PCR鉴定图，1为CYTL1特异性引物扩增，2为B13 通用引物扩增；
[0028] 图6为本发明所述重组pFL-B13cl_CYTLl成熟蛋白原核表达的蛋白电泳图；
[0029] 图7为本发明所述重组人CYTL1蛋白质纯化后的蛋白电泳图；
[0030] 图8为本发明所述重组人CYTL1蛋白在不同浓度下促进人软骨细胞增殖的柱状 图。 【具体实施方式】
[0031] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。
[0032] 实施例1
[0033] -种重组人CYTL1蛋白的表达方法，具体步骤如下：
[0034] 1、人软骨细胞CYTL1蛋白cDNA的制备
[0035] 1. 1RNA抽提：将人软骨细胞系C28112细胞充分震荡混匀至细胞完全裂解，室温放 置10分钟左右后，每lml TRIzol中加入氯仿为200 μ 1，盖上盖子，剧烈振荡约1分钟，室温 静置2?5分钟，然后12000g制冷离心15分钟（6°C )，小心取出样品，通过观察可以发现 样品分三层，其中最上层含有RNA样品。
[0036] 1. 2RNA沉淀：小心吸取上清液约450 μ 1 (每lml TRIzol的吸取量）至含有600 μ 1 冷冻异丙醇的新RNase Free的离心管中，混匀，-20°C放置约10分钟，12000g冷冻离心10 分钟)。去上清，再加入冷冻的75%乙醇，弹起沉淀后12000g冷冻离心5分钟)， 弃上清，风干约5?10分钟以后再加入DEPC水制成RNA样品（浓度调整到1 μ g/ml)，可-80 度保存。质量以琼脂糖凝胶电泳观察来确认。
[0037] 1. 3反转录（RT)制备cDNA样品：用下列组份配制RT反应液（所有反应都在冰上 进行操作）。
[0038] 在预冷的RNase Free的PCR反应管内加入以下试剂进行RT反应
[0039]
【权利要求】
1. 一种重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述方法为将SEQID: NO. 1进行原 核表达。
2. 根据权利要求1所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中 PCR扩增引物是： 正向引物：5 ' -GAAAAGCTTCACACTCCCCCGACCTGCTACT-3 ' ； 反向引物：5 ' -TATAGAATTCCTAGCGCTGACGATC-3 '。
3. 根据权利要求1所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中 选用的双酶切位点分别为Xmn I和EcoR I酶切位点。
4. 根据权利要求1所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中 原核表达载体为pFL-B13cl。
5. 根据权利要求1所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中 宿主菌为 E. coli BL21 (Gold) (DE3)。
6. 根据权利要求1所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中 采用IPTG诱导表达，IPTG终浓度为0. 05?0. ImM，培养温度为37°C。
7. 根据权利要求4所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中 采用镍亲和层析法纯化重组人CYTL1蛋白。
8. 根据权利要求7所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述镍亲和层析 中洗脱缓冲液含250mM咪唑。
9. 一种采用如权利要求1-8任一方法表达的重组人CYTL1蛋白。
10. -种如权利要求9所述的重组人CYTL1蛋白在制备促进软骨细胞增殖药物中的用 途。
【文档编号】C12N5/077GK104087608SQ201410317157
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】杨小红, 李斯明, 崔树良, 梁伟国 申请人:广州市红十字会医院