一株d型氨基酸生产菌的细胞固定化及用其制备d-苯丙氨酸的制作方法
【专利摘要】一种一株D型氨基酸生产菌的细胞固定化及用其制备D-苯丙氨酸，属于生物化工【技术领域】，固定化方法是：细胞培养，上述菌接种到NADF液体培养基诱导酰化酶产生。培养基组成为：N-酰基-DL-苯丙氨酸（NADF）。细胞固定化，细胞培养及菌体收集，细胞固定化；其用途是：利用固定化的D型氨基酸生产菌的细胞制备D-苯丙氨酸。有益效果是：化学拆分都使用大量的酸碱，具有对环境影响较大，对设备要求高的特点。而生物法可以实现在温和条件下对氨基酸进行拆分，在氨基酸生产中逐步受到人们的重视，利用N-酰基-D-氨基酸酰基水解酶特异降解N-酰基-D-型氨基酸的酰基的特点，用于D-型氨基酸的生产具有能耗低、污染小的优点。
【专利说明】—株D型氨基酸生产菌的细胞固定化及用其制备D-苯丙氨酸
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物化工【技术领域】。
【背景技术】
[0002]目前D-型氨基酸的生产主要使用化学法，通过氨基酸与手性有机酸或碱反应生成消旋DL-氨基酸盐，利用溶解度的差异结晶分离，然后用普通酸或碱中和得到所需旋光性D、L氨基酸。另一种方法是使用手性的酸或醇使氨基酸酰化或酯化，分离后，用化学法去掉酰基或烷氧基，得到D-氨基酸。以上的化学拆分都使用大量的酸碱，具有对环境影响较大，对设备要求高的特点。而生物法可以实现在温和条件下对氨基酸进行拆分，在氨基酸生产中逐步受到人们的重视，利用N-酰基-D-氨基酸酰基水解酶特异降解N-酰基-D-型氨基酸的酰基的特点，用于D-型氨基酸的生产具有能耗低、污染小的优点，回收的氨基酸重新消旋化后，理论上能够达到百分之百的利用。
[0003]D-型氨基酸为中间体合成抗生素、生理活性肽，还可作为农药、食品添加剂等的重要原料。D-氨基酸为骨架可作为生产医药品等的原料，或以D-氨基酸为中间体可以诱导合成农药或食品添加剂。目前一致认为可利用的D-氨基酸如下:D-苯丙氨酸(bacitracin杆菌肽，gramicidin短杆菌肽，polymyxin多粘菌素，tyrocidine短杆菌酪肽)等。目前多种L-氨基酸通过发酵法制备的工业化大规模生产已经得到应用。但是，发酵法直接生产D-氨基酸还存在很多困难，主要是活性高的水解酶没有找到。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是:提供一种一株D型氨基酸生产菌的细胞固定化及用其制备D-苯丙氨酸，它通过固定化法固定Microbacterium natoriense sp.nov TNJL143-2菌,提供用一种生物法制备D-型苯丙氨酸。
[0005]本发明利用我们从土壤中分离得到一株杆状的，革兰氏阳性菌crobac teri umnatoriense sp.nov TNJL143-2菌株,它具有较高的#-酰基-D-苯丙氨酸、天冬氨酸等的酸基水解活性，利用ift'croAacteritt? natoriense sp.nov TNJL143-2菌株进行D-型氨基酸的生产，目前国内未见报道。本发明teria? natoriense sp.novTNJL143-2菌株TNJL143-2菌株入手，利用细菌能够使培养基中的N-酰基-D-型氨基酸的N-酰基水解的特性，来制备D-型氨基酸。
[0006]Microbacterium natoriense sp.nov TNJL143-2 菌具有生产 N-酸基-D-型氨基酸的N-酰基水解酶的独特特性，而对于N-酰基-L-型氨基酸的N-酰基不起作用。通过固定化法固定Microbacterium natoriense sp.nov TNJL143-2菌,提供一种生物法制备D-型苯丙氨酸的方法，通过与常用的悬浮细胞法相比，固定化细胞具有很明显的优点，经过研究表明，固定化的细胞对于N-酰基-D-型苯丙氨酸的N-酰基的水解率达到77%以上，而且酶活保持时间达到70小时以上，该生产方法的研究、开发和应用于D-型苯丙氨酸的生产具有极大的价值。
[0007]本发明的细胞培养基固定化方法是:
一、细胞培养
1、-80°C保存的菌种接种到LB液体培养基30°C，150rpm/min, 24h培养。
[0008]2、上述菌接种到NADF液体培养基诱导酰化酶产生。培养基组成为:N_
酰基-DL-苯丙氨酸(NADF)，0.01% (v/v)；酵母浸膏，0.5% ;NaCl，0.5% ； KH2PO4,
0.1% ； MgS047H20, 0.0005%。
[0009]二、细胞固定化
1、细胞培养及菌体收集
A、细胞培养:将活化的菌种接到20mL种子NADF培养基中于28_30°C、150 r/min振荡培养24 h，以此为种子液再按10%(v/v)的接种量接种于装有50mLNADF培养基的200 mL三角瓶中，28-300C、150r/min摇床振荡培养48h。
[0010]B、发酵液于4°C、5000 r/min离心10min，弃上清液，并用去离子水3次洗涤、离心去上清液，以减少培养基中的杂质，减少对后续分离纯化的影响，并收集菌体备用。
[0011]2、细胞固定化:
A、海藻酸钠固定化细胞:称0.5g海藻酸钠加1mL水，加热搅拌溶化；同时配制4%CaCl2+BaCl2,121°C,20min 灭菌，冷却至室温。
[0012]B、取湿菌体与海藻酸钠混合均匀，通过蠕动泵滴入4%CaCl2+BaCl2溶液中，制成直径为1-3 mm的固定化颗粒。
[0013]C、4°C保存，用于氨基酸的转化。
[0014]本发明的用途是:
利用固定化的D型氨基酸生产菌的细胞制备D-苯丙氨酸。
[0015]本发明分离的这株细菌对N-酰基-L-氨基酸不发生作用，只特异水解N-酰基-D-氨基酸，具有特异性强，降解效率高，易于放大，对设备要求低，对环境影响小的特点。本发明通过对Microbacterium natoriense sp.nov TNJL143-2细胞的固定化,对D-型氨基酸的生物发酵生产有实际意义。
[0016]本发明的有益效果是:
化学拆分都使用大量的酸碱，具有对环境影响较大，对设备要求高的特点。而生物法可以实现在温和条件下对氨基酸进行拆分，在氨基酸生产中逐步受到人们的重视，利用N-酰基-D-氨基酸酰基水解酶特异降解N-酰基-D-型氨基酸的酰基的特点，用于D-型氨基酸的生产具有能耗低、污染小的优点，回收的氨基酸重新消旋化后，理论上能够达到百分之百的利用。对D-型氨基酸的生物发酵生产有实际意义。
[0017]【专利附图】
【附图说明】:
图1.本发明的D-苯丙氨酸的生物发酵生产工艺流程图；
图2.TLC法检测D-型氨基酸图；
图3.D-苯丙氨酸转化时程图；
图4.转化批次实验图；
图5.最适温度及温度稳定性图；
图6.最适pH及pH稳定性图。
【具体实施方式】
[0018]实施例1:
一、检测方法的建立:
1、定性检测(薄层层析TLC法)；
取反应液上清(5 μ I)在薄层层析板上点样层析。展开液为正丁醇:醋酸:水=4:1:1。层析完毕，在烘箱中使层析板干燥，用水合茚三酮鉴定D-氨基酸(见图2)。
[0019]2、定量检测(DA0法)
Α、显色液组成:Α液:30mM/L磷酸缓冲液(pH7.4),2.5mg/ml
苯酚，2.4U/mlD-氨基酸氧化酶(用前溶解)。B液:70U/ml辣根过氧化物酶，1mg/ml4_氨酰安替比林。A:B=19:1。
[0020]Β、50 μ I反应液与50 μ I显色液混合，经过20min显色后，加入100 μ I Mill1-Q水，505nm测定吸光值。
[0021]C、用同样方法制作不同浓度D-型氨基酸的标准曲线(本实验以D-苯丙氨酸制作准曲线)。
[0022]二、固定化细胞用于N-酰基-D-苯丙氨酸的N-酰基水解。
[0023]1、反应液组成:20 mM/LNADF0.02 mM/L HEPES-NaOH 缓冲液(pH 7.0)
2、悬浮菌体反应:称取Ig湿菌体，用1ml反应液悬浮菌株，
在25-35 °C进行菌体反应。
[0024]3、15000rpm/min、10分钟离心后取上清。
[0025]4、固定化菌体反应:lg湿菌体制作的固定化细胞，加入1ml上述反应液，在25-35 0C，50rpm/min 进行反应。
[0026]通过悬浊细胞和固定化细胞对20mM/L的N-酰基-D-苯丙氨酸进行的降解实验可以看到，两种方法都可以有效水解N-酰基，悬浮细胞的水解率可以达到90%，固定化细胞水解率可以达到77% (见图3)，但是悬浮细胞经过I次反应后效率下降50%以上，而固定化细胞经过6次还可以保持80%的活性，且活性保持达到70小时以上(见图4)。本发明使用的细菌在30-50°C都保持较高的酶催化活性(见图5)。本发明使用的细菌pH6.0-9.0范围内都保持较高的酶催化活性(见图6)。
【权利要求】
1.一种一株D型氨基酸生产菌的细胞固定化，其方法: 第一步细胞培养 (1)_80°C保存的菌种接种到LB液体培养基30°C，150rpm/min, 24h培养； (2)上述菌接种到NADF液体培养基诱导酰化酶产生，培养基组成为N- 酰基-DL-苯丙氨酸即 NADF, 0.01% v/v ；酵母浸膏，0.5% ;NaCl, 0.5% ； KH2PO4,0.1% ； MgSO4 7H20, 0.0005% ； 第二步细胞固定化 (1)细胞培养及菌体收集 A、细胞培养，将活化的菌种接到20mL种子NADF培养基中于28_30°C、150r/min振荡培养24 h，以此为种子液再按10%v/v的接种量接种于装有50mLNADF培养基的200 mL三角瓶中，28-300C、150r/min摇床振荡培养48h ； B、发酵液于4°C、5000r/min离心10min，弃上清液，并用去离子水3次洗涤、离心去上清液，以减少培养基中的杂质，减少对后续分离纯化的影响，并收集菌体备用； (2)细胞固定化: A、海藻酸钠固定化细胞:称0.5g海藻酸钠加1mL水，加热搅拌溶化；同时配制4%CaCl2+BaCl2,121°C,20min 灭菌，冷却至室温； B、取湿菌体与海藻酸钠混合均匀，通过蠕动泵滴入4%CaCl2+BaCl2溶液中，制成直径为1-3 mm的固定化颗粒； C、4°C保存，用于氨基酸的转化。
2.如权利要求1所述的用一株D型氨基酸生产菌的细胞固定化的制备D-苯丙氨酸，其特征是:利用固定化的D型氨基酸生产菌的细胞制备D-苯丙氨酸。
【文档编号】C12P13/22GK104178476SQ201410321706
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】刘建, 李明堂, 孙立志, 李洪广 申请人:长春理工大学