基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法，本发明将发根农杆菌中的rol基因(A，B，C，D)和目的基因构建到一个位点特异性重组载体系统(Cre/Loxp)中，rol基因作为筛选标记。用包含Cre/Loxp载体系统的农杆菌液体浸泡幼嫩植株切段；切段伤口处在黑暗中诱导出发根后转入光下诱导再生植株，并化学处理，rol基因在植株化学处理的过程中被敲除，这样就获得了只含有目的基因的转化植株。本发明的方法在有菌条件下进行，不需要组织培养，省去了选选择压力筛选、转染、除菌等步骤，应用前景广泛。
【专利说明】基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基于发根植株再生的植物免组织培养转 基因方法。
【背景技术】
[0002] 农杆菌介导的植物遗传转化技术，是把外源基因导入植物体内的最有效途径。基 于该技术的植物转基因方法主要是通过组织培养来实现的，其不足之外非常明显：1.植物 受体材料必须建立起高效的植株再生系统；2.转基因过程中包括植株再生、选选择压力筛 选、转染，除菌、生根、炼苗、移栽等步骤，过程非常繁琐，工作量巨大。
[0003] 目前真正建立起高频率植株再生体系的植物非常少，然而，绝大多数植物却很容 易被诱导出发根，并且通过发根获得再生植株。目前发根来源的植株再生途径不能应用到 植物转基因技术中，因为rol基因的导入使得再生植株失去顶端优势不能正常生长。如果 能将发根来源植株中的rol基因删除，则可利发根来源的植株再生途径实现大部分植物的 外源基因遗传转化。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术中的缺陷，提供一种基于发根植株再生的植物免组织培养转 基因方法。本发明的方法实现了从发根再生植株中除掉rol基因，获得恢复顶端优势的正 常转基因植株；省去组织培养、选择压筛选、除菌等繁琐步聚。
[0005] 本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明的方法包括如下步骤：
[0006] 步骤一，构建包含目的基因和rol基因的Cre/Loxp载体系统，将该系统转入农杆 菌C58C1中，并通过震荡培养使菌液的0D值达到0. 4-0. 9备用；
[0007] 步骤二，取长度为10-30cm的植物幼嫩带叶枝条切段，浸泡于步骤一所得的农杆 菌的溶液中，浸泡时间为2-4小时；
[0008] 步骤三，取出浸泡过的植物切段，清洗，放置于装有营养土的透明玻璃花盆中，避 光培养30-60天；
[0009] 步骤四，待植物切段生根后，铲掉表面土层，将部分根裸露于空气中，把花盆转入 光下，诱导植株再生；
[0010] 步骤五，用雌二醇喷洒光下诱导出来的植株敲除rol基因，最后获得只含目的基 因的转化株系；
[0011] 步骤六，对步骤五所得转基因株系进行分子检测和转基因功能验证，从而得到纯 合阳性转化子。
[0012] 步骤一中，所述Cre/Loxp载体系统，包括P1，P2，P3，P4四个部分，其中ro 1基因为 筛选标记。β -雌二醇诱导下，处于两个LoxP之间的rol基因和Cre基因最终被删除掉。
[0013] 步骤三中，所述营养土成分为添加加1/10MS培养液的基质。
[0014] 步骤五中，所述雌二醇的浓度为1-15 μ mol/L。当β -雌二醇诱导XVE表达时，Cre 被XVE激活，Loxp序列之间的转录单元被切除，下游的目的基因在G10-90启动子的控制下 表达。
[0015] 本发明方法将发根农杆菌中的rol基因（A，B，C，D)和目的基因构建到一个位点 特异性重组载体系统（Cre/Loxp)中，rol基因作为筛选标记。rol基因属已知基因，rol基 因（A，B，C，D)中的A，B，C，D四个序列整体发挥作用，本发明将rol基因构建到重组载体并 作为筛选标记，是一种创新性实验操作。然后用包含Cre/Loxp载体系统的农杆菌浸泡幼嫩 植物切段；切段伤口处在黑暗中诱导出发根后转入光下诱导植株再生，最后用化学处理敲 除掉rol基因，这样就获得了只含有目的基因的转化植株。该方法不需要组织培养，省去了 选择压力筛选、转染、除菌、生根、炼苗、移栽等步骤，而且适用于常规途径植株再生困难的 植物，具有很大的应用前景。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：（1)可以从发根再生植株中除掉 rol基因，获得恢复顶端优势的正常转基因植株；(2)省去组织培养、选择压筛选、除菌等繁 琐步聚。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0018] 图1为本发明操作流程图；
[0019] 图2为Cre/LoxP载体系统。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如 Sambrook 等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0021] 实施例
[0022] 本实施例涉及基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法（如图1所示），包 含如下步骤：
[0023] 步骤一，参考文献（周洁等杨树，无选择标记转基因体系的建立），构建一个包含 G10h和rol基因的Cre/Loxp载体系统（如图2所示），并将该系统转入0D值为0. 4 (第1 组）、0. 6 (第2组）、0. 9 (第3组）的发根农杆菌；本实施例中采用的发根农杆菌为发根农 杆菌C58C1，通过公开的市售渠道可以获得；
[0024] 图2中：G10_90,35S，OlexA-46分别为不同的启动子；Nos为终止子；LoxP为切除 位点；XVE为雌激素受体反式激活因子；Cer-inter为重组酶基因 ；target gene为目的基 因；P1-P4分别代表4个不同的转录单元。
[0025] 步骤二，从大田中剪取长度为20cm左右的小蔓长春花带叶枝条（该植物由上海辰 山植物园提供，本领域通过公开的渠道可以获得），有切口的一端在步骤一所述的农杆菌溶 液中分别浸泡2小时（第1组）、3小时（第2组）、4小时（第3组）；
[0026] 步骤三，把浸泡过的小蔓长春花枝条拿出来用自来水清洗3次，洗去切口处农杆 菌，在装有营养土的透明玻璃花盆中避光培养30天（第1组）、48天（第2组）、60天（第 3组）；所述营养土成分为添加1/10MS培养液的基质；所述1/10MS培养液可从公开渠道购 买得到；
[0027] 步骤四，待发根长出来后，铲掉上面土层将部分发根裸露在外面；然后把花盆转入 自然光下诱导植株再生；
[0028] 步骤五，用 lymol/L(第 1 组）、15μπι〇1/1(第 2 组）、8μπι〇1/1(第 3 组）的雌二 醇喷洒诱导出来的小蔓长春花植株，获得不含rol基因的植株；
[0029] 步骤六，对转基因株系进行分子检测和转基因功能验证，从而得到纯合阳性转化 子。
[0030] 实施结果，发明人对以上三组实验获得的再生小蔓长春花植株进行检测，均为不 含rol基因的植株，且均获得了阳性转化子。综上所述，本发明方法将发根农杆菌中的rol 基因（A，B，C，D)和目的基因构建到一个位点特异性重组载体系统（Cre/Loxp)中，rol基 因作为筛选标记。然后用包含Cre/Loxp载体系统的农杆菌浸泡幼嫩植物切段；切段伤口 处在黑暗中诱导出发根后转入光下诱导植株再生，最后用化学处理敲除掉rol基因，这样 就获得了只含有目的基因的转化植株。本发明的方法不需要组织培养，省去了选择压力筛 选、转染、除菌、生根、炼苗、移栽等步骤，而且适用于常规途径植株再生困难的植物，具有很 广泛的应用前景；显然，本发明的方法并不限于本发明实施例中列举的小蔓长春花，实施例 不限制本发明的保护范围。
[0031] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【权利要求】
1. 一种基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法，其特征在于，包括如下步 骤： 步骤一，构建包含目的基因和rol基因的Cre/Loxp载体系统，将该系统转入农杆菌 C58C1中，并通过震荡培养使菌液的0D值达到0. 4-0. 9备用； 步骤二，取长度为10-30cm的植物幼嫩带叶枝条切段，浸泡于步骤一所得的农杆菌的 溶液中，浸泡时间为2-4小时； 步骤三，取出浸泡过的植物切段，清洗，放置于装有营养土的透明玻璃花盆中，避光培 养30-60天； 步骤四，待植物切段生根后，铲掉表面土层，将部分根裸露于空气中，把花盆转入光下， 诱导植株再生； 步骤五，用雌二醇喷洒光下诱导出来的植株敲除rol基因，最后获得只含目的基因的 转化株系； 步骤六，对步骤五所得转基因株系进行分子检测和转基因功能验证，从而得到纯合阳 性转化子。
2. 根据权利要求1所述的植物免组织培养转基因方法，其特征在于，步骤一中，所述 Cre/Loxp载体系统，包括Pl，P2, P3, P4四个部分，其中rol基因为筛选标记。
3. 根据权利要求1所述的植物免组织培养转基因方法，其特征在于，步骤三中，所述营 养土成分为添加1/10MS培养液的基质。
【文档编号】C12N15/82GK104120144SQ201410323880
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】王贵荣, 李斌连, 唐克轩 申请人:上海交通大学