一种猪脑心肌炎病毒hb10株感染性克隆质粒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种猪脑心肌炎病毒HB10株感染性克隆质粒及其构建方法与应用，提供人工合成5′UTR和3′UTR序列并在中间加入多克隆位点(MCS)的方法，得到中间质粒pOK12-EMCV-5′UTR-MCS-3′UTR。本发明在合成EMCV5′UTR时，将polyC的碱基设定为15个。本发明利用设计的特异引物和特定的PCR反应条件，快速扩增EMCV基因组F1片段(6699bp)，并成功地连接到pOK12-5′UTR-MCS-3′UTR质粒，得到pOK12-rEMCV-H10B质粒，该cDNA感染性克隆质粒命名为pOK12-rEMCV-H10B。利用该质粒成功拯救出病毒-rEMCV-HB10，该拯救毒与母本病毒相比毒力减弱。利用EMCV-HB10的cDNA感染性克隆可以研究EMCV病毒致弱机理及开发EMCV低毒力的减毒疫苗。利用该病毒的cDNA感染性克隆为载体插入不同病毒保护性抗原基因，构建不同嵌合病毒，以及由此开发出双价或多价疫苗及其他可能的应用。
【专利说明】一种猪脑心肌炎病毒HB10株感染性克隆质粒
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及一种EMCV-HB10株cDNA感染性克隆质粒 及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 猪脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV)属于小RNA病毒科，心病 毒属，无囊膜单股正链RNA病毒。该病毒主要引起多种哺乳动物发生心肌炎和脑炎等疾病。 1958年，该病毒首次在巴拿马分离。EMCV基因组长约为7. 8kb，编码一个大的开放性阅读 框（0RF)，该0RF共编码4个结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4)和8个非结构蛋白（2A、2B、2B*、 2C、3A、3B、3C、3D)。
[0003] 已有报道证明EMCV的主要宿主是猪，对不同年龄的猪都能感染，通常引起仔猪突 然死亡以及母猪繁殖障碍。欧洲、亚洲、北美洲、南美和非洲均有猪感染EMCV的报道，该病 毒对欧洲（包括德国、意大利、比利时、希腊等国家）养猪业的危害最为严重。目前，已经从 我国多个猪群中分离到EMCV，通过对我国部分地区规模猪场（2006?2007年）保留的血 清样品的中和试验分析，我国猪群EMCV血清抗体阳性率平均为52. 45% (35%?70. 81% ) 说明我国养猪产业已经受到EMCV的威胁。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种EMCV-HB10株cDNA感染性克隆质粒及其构建方法与 应用，旨在通过研究EMCV病毒的致弱机制、复制机制及弱毒疫苗的研制和嵌合病毒的构建 以实现在EMCV防控中的应用。
[0005] 本发明是这样实现的，一种EMCV-HB10株感染性克隆质粒的构建方法，包括以下 步骤：
[0006] ⑴根据EMCV HB10基因序列设计扩增引物：
[0007] EMCV-F1-F :GACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTC(含 Hind III 酶切位点）
[0008] EMCV-F1-R :TTAGCATTGAGGTCGCTGCACAAC (含 Afe I 酶切位点）；
[0009] (2)将合成的 EMCV5 ' UTR-MCS-3 ' UTR 片段用 EcoR I、BamH I 从 pGH-EMCV-5^ UTR-MCS-3^ UTR-质粒上酶切，回收纯化产物与p0K12载体进行连接，得到质 粒 pOKU-EMCV-S' UTR-MCS-3，UTR;
[0010] (3)用特异引物EMCV-F1-F、EMCV-F1-R对EMCV基因的cDNA进行扩增，得到F1目 的片段，用出11(11114€6 1双酶切？1片段和质粒口01(124]\1〇^^1?-]\?^-3,^1?，回收、 连接，得到全长P〇K12-rEMCV-HB10克隆质粒。
[0011] 优选地，在步骤（2)中，所述合成的5' UTR-MCS-3' UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0012] 优选地，在步骤（3)中，所述F1目的片段为5'端和3'端分别加入Hind III、 Afe I酶切位点后的EMCV-HB10株基因组的F1片段，该基因在基因库中的序列号为 GenBank:JQ864080. 1。
[0013] 本发明进一步提供了上述EMCV-HB10株cDNA感染性克隆质粒在病毒拯救方面的 应用。
[0014] 本发明克服现有技术的不足，提供一种EMCV-HB10株感染性克隆质粒及其构建方 法与应用，通过人工合成的EMCV5' UTR和3' UTR，如序列表SEQIDN0. 1所示，人为减少 了 5' UTR中Poly C的长度，同时利用病毒粒子中提取的RNA和设计的特异引物，成功扩增 到了 EMCV基因组F1片段（6699bp)的开放阅读框核苷酸，能够实现快速简便的构建EMCV 的cDNA感染性克隆，得到的感染性克隆也由于PolyC长度的改变，毒力得到减弱。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是本发明实施例1中EMCV-HB10全基因组序列的结构示意图；
[0016] 图2是本发明实施例1中p0K12-rEMCV-HB10全长质粒的构建过程示意图；
[0017] 图3是本发明中实施例1中EMCVHB10株基因组全长cDNA克隆到p0K12载体构建 酶切图；其中，图A是人工合成的5' UTR-MCS-3' UTR构建到p0K12载体酶切示意图，图A 泳道1为pGH-5^ UTR-MCS-3^ UTR质粒EcoR I、BamH I双酶切鉴定示意图，其中1117bp 片段为人工合成的5' UTR-MCS-3' UTR;2916bp片段为酶切后的pGH载体，图A泳道2为 P0K12-5' UTR-MCS-3^ UTR质粒EcoRI、BamHI双酶切鉴定示意图，其中1117bp片段为 人工合成的5' UTR-MCS-3' UTR;2192bp片段为酶切后的p0K12载体。图B是F1片段构 建到P0K12-EMCV-5^ UTR-MCS-3' UTR载体酶切示意图；图B泳道1为PCR扩增6699bp的 F1片段；图B泳道2为p0K12-rEMCV-HB10质粒Hind III、Afe I双酶切鉴定示意图，其中 6699bp片段为F1片段，3170bp为载体片段。
[0018] 图4是本发明实施例2中EMCV拯救病毒（rEMCV-HB10-F4)感染BHK-21细胞的结 果图；其中，图A是亲本毒HB10(EMCV-HB10-F5)感染BHK-21细胞引起病变示意图；图B是 本发明质粒拯救病毒（rEMCV-HB10-F4)感染BHK-21细胞引起病变示意图；图C为对照组正 常BHK-21细胞。
[0019] 图5是本发明实施例2中拯救病毒（rEMCV-HB10-F4)RT-PCR特异性鉴定结果 图；其中，图A是从亲本毒（EMCV-HB10-F5)和本发明质粒拯救病毒（rEMCV-HB10-F4)提取 RNA反转录扩增1D基因片段结果图，图B是本发明拯救病毒特异性分子标签位置示意图； p0K12-rEMCV-HB10质粒测序序列中的编码1D基因区域处存在两个A1909G、G2059C核苷酸 突变；
[0020] 图6是本发明实施例2中亲本毒株（EMCV-HB10-F5)和拯救病毒（rEMCV-HB10-F4) 的VP1表达水平结果图；
[0021] 图7是本发明实施例2中拯救病毒的IFA检测结果图；其中，图A为亲本毒F5 代（EMCV-HB10-F5)感染BHK-21细胞的IFA示意图，图B为本发明质粒拯救病毒F4代 (rEMCV-HBl-F4)感染BHK-21细胞的IFA示意图；图C为未感染EMCV的正常BHK-21细胞。
[0022] 图8是本发明实施例2中拯救病毒株rEMCV-HB10-F4和亲本株EMCV-HB10-F5的 生长曲线比较示意图。
【具体实施方式】
[0023] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0024] 在以下实施例中，涉及的材料、试剂、引物合成如下所示，以下实施例中未提供具 体操作过程的，均为依照所购产品的使用说明进行操作，不再赘述。
[0025] 1、生物材料
[0026] EMCV HB10病毒株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家重点实验室提供，其 第5代病毒（EMCV-HB10-F5)用于本发明；低拷贝载体p0K12由中国农业科学院哈尔滨兽医 研究所国家重点实验室提供；菌株E. coli DH5a感受态细胞、细胞株和BHK-21细胞以及 PGH载体均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家重点实验室保存。
[0027] 2、主要试剂
[0028] RiboMAX? Large ScaleRNA Production Systems_SP6andT7 购自 Promega 公 司；RNA 提取试剂 TRIzol Reagent、Superscript III First-Strand Synthesis System、 lipofectamine2000均购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自QIAGEN 公司；Phusion High-Fidelity DNA Polymerase、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司 产品；抗EMCV VP1蛋白的抗体由哈尔滨兽医研究所国家重点实验室提供。羊抗鼠 FITC-IgG 购自中山金桥公司。5' -UTR-MCS-3' UTR序列由博仕公司进行全基因合成于pGH载体上， 5' UTR-MCS-3^ UTR5' UTR序列如序列表SEQIDN0:1所示，其中PolyC的设计长 度为15nt，在上游中预先加入T7RNA聚合酶启动子核心序列。
[0029] 3、引物的设计及合成
[0030] 根据EMCV HB10全基因序列，用Primer5软件设计了 5条引物，引物由上海英俊合 成，如下表1所示：
[0031] 表1本研究所用的扩增和鉴定引物
[0032]
【权利要求】
1. 一种猪脑心肌炎病毒HB10株cDNA感染性克隆质粒及其构建方法，其特征在于，包括 以下步骤： (1)根据EMCVHB10基因序列设计特异性的PCR引物： EMCV-F1-F :GACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTC(含 Hind III 酶切位点） EMCV-F1-R :TTAGCATTGAGGTCGCTGCACAAC (含 Afe I 酶切位点）； ⑵将合成的 EMCV5 ' UTR-MCS-3 ' UTR 片段用 EcoR I、BamH I 从 PGH-EMCV5' UTR-MCS-3' UTRR质粒上酶切，回收纯化产物与pOK12载体进行连接，得到质 粒 pOKU-EMCV-S' UTR-MCS-3，UTR; (3)用特异引物EMCV-F1-F、EMCV-F1-R对EMCV基因的cDNA进行扩增，得到EMCV基因 组的 F1 片段，用 Hindlll、Afel 双酶切 F1 片段和质粒 P0K12-EMCV-5' UTR-MCS-3' UTR， 回收、连接，得到全长P〇K12-rEMCV-HB10克隆质粒。
2. 如权利要求1所述的EMCV-HB10株感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于，在步骤 (2) 中，所述合成的5' UTR-MCS-3' UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 如权利要求2所述的EMCV-HB10株感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于，在步骤 (3) 中，所述F1目的片段是EMCV-HB10株（序列号为GenBank:JQ864080.1)。
4. 权利要求1?3任一项所述的EMCV-HB10株cDNA感染性克隆质粒在病毒拯救、病毒 致弱机理及利用该病毒的cDNA感染性克隆为载体插入不同病毒保护抗原基因，构建不同 病毒的嵌合病毒来表达外源蛋白，以及由此开发出双价或多价疫苗及其他可能的应用。
【文档编号】C12N7/00GK104232668SQ201410330789
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】翁长江, 崔尚金, 黄丽, 李江南 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所