一种依赖大肠杆菌发酵生产堇菜黄素的方法

一种依赖大肠杆菌发酵生产堇菜黄素的方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种依赖大肠杆菌发酵生产堇菜黄素的方法。本发明通过原核表达系统表达可溶重组拟南芥玉米黄素环氧化酶的方法，克服了直接从植物组织中分离纯化该蛋白的困难，降低了应用成本。本发明利用遗传背景清晰、安全无毒的分子克隆常用菌种作为发酵菌种，通过基因工程转化重组载体、诱导蛋白可溶表达直至发酵生产堇菜黄素，成本低廉，易于实行，发酵直接获得的堇菜黄素就具有较高的纯度，可应用于食品工业、保健品行业，以及作为高纯度的化合物标准品等科研领域。
【专利说明】【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种依赖大肠杆菌发酵生产堇菜黄素的 方法。 一种依赖大肠杆菌发酵生产堇菜黄素的方法 【背景技术】
[0002] 堇菜黄素（violaxanthin)是一种在高等植物中广泛存在的天然类胡萝卜素，存 在于大多数高等植物的叶片、花、果实等器官中，例如菠菜的叶片、三色堇的花瓣以及橙子 的果皮等。
[0003] 在绝大多数高等植物体内，堇菜黄素是叶黄素循环的下游终产物，也是叶黄素循 环中的主要积累色素。叶黄素循环的色素组分有3种：玉米黄素（zeaxanthin)、花药黄素 (antheraxanthin)和堇菜黄素（violaxanthin)。这3种组分在不同的光照条件下，通过环 氧化反应或者去环氧化反应相互转化。堇菜黄素在堇菜黄素去环氧化酶（VDE)的催化下， 依次生成花药黄素和玉米黄素；在氧气以及铁氧还蛋白或NADPH存在的情况下，玉米黄素 环氧化酶（ZEP)将玉米黄素环氧化，依次生成花药黄素和堇菜黄素。在黑暗或者不饱和光 下，堇菜黄素是叶黄素循环中的主要色素，当正午叶片中吸收的光能超过光合作用的最大 利用能力时，堇菜黄素转变为花药黄素和玉米黄素，将过剩的光能以热能形式耗散；反之当 进入夜晚，玉米黄素又变为花药黄素和堇菜黄素。因此，堇菜黄素在植物体内具有重要的光 保护功能。除此之外，堇菜黄素及其异构体新黄素（neoxanthin)是重要的植物抗逆激素脱 落酸的生物合成前体，在植物抗旱、抗盐等生理过程中发挥极其重要的作用。
[0004] 克隆拟南芥玉米黄素环氧化酶的编码基因，对于更好地开发拟南芥资源具有重要 的现实意义。一方面，通过植物基因工程手段，增强植物体内玉米黄素环氧化酶基因的表 达，有利于提高植物内源堇菜黄素的含量，并进而提高内源脱落酸的含量，增强植物的抗逆 性；另一方面，将能够利用大肠杆菌内源前体催化合成玉米黄素的质粒pAC-ZEAX以及本发 明构建的重组质粒pMAL-C5X-AtZEP共同转化大肠杆菌，可以通过发酵生产大量高纯度的 堇菜黄素。
[0005] 现有的生产堇菜黄素的技术，因其在天然植物组织中的含量较少、化学合成成本 高且副产物多等诸多原因而价格昂贵，极大地限制了其在食品工业和科研领域中的应用。 例如从10千克新鲜的菠菜叶片中仅能提取出约200毫克堇菜黄素。而利用基因工程技术， 选择遗传背景明确、安全无毒性、科学研究和微生物发酵工程中最为广泛应用的模式生物 大肠杆菌，通过发酵以及成本低廉的纯化过程，得到大量高纯度的堇菜黄素是促进其在食 品工业和科研中应用的有效途径。
【发明内容】

[0006] 本发明需要解决的问题是提供一种通过大肠杆菌发酵生产堇菜黄素的方法，主 要内容包括拟南芥玉米黄素环氧化酶基因 AtZEP的克隆，AtZEP融合麦芽糖结合蛋白标签 (MBP-tag)原核表达载体的构建，载体的共转化，玉米黄素环氧化酶在大肠杆菌体内的可溶 性表达以及通过发酵生产堇菜黄素并提取总色素。
[0007] 本发明的技术方案包含如下步骤：（1)从拟南芥叶片中提取总RNA，并通过逆转录 反应合成cDNA第一链；（2)根据拟南芥信息资源网站(http://www. arabidopsis. orfi)提 供的拟南芥玉米黄素环氧化酶基因的编码区序列，设计包含酶切位点的扩增引物（SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2) ;(3)以步骤（1)中逆转录得到的cDNA第一链为模板，通过PCR的方 法扩增获得目的基因，并克隆至pMD19-T(TaKaRa BIO INC.，Japan)载体，测序正确后将 其克隆到原核表达载体PMAL-C5X(New England Biolabs，UK)的多克隆位点，获得重组质 粒pMAL-C5X-AtZEP;(4)通过化学转化或者电转化等合适的方法转化步骤（3)中获得的 重组质粒至大肠杆菌R〇setta2(DE3)pLysS (Merck Novagen, Germany)菌株或者大肠杆菌 DH5 a (Promega，USA)菌株，挑取阳性克隆在含有相应抗生素的TB培养基中培养，并以IPTG 诱导或连续培养的方法诱导重组蛋白表达，通过变性聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE) 以及蛋白质免疫印迹法（Western Blot)检测目的蛋白的表达；（5)通过化学转化或者 电转化等合适的方法将步骤（3)中获得的重组质粒与pAC-ZEAX质粒共同转化大肠杆菌 DH5a (Pr〇mega，USA)菌株。两个质粒同时转化的阳性克隆在含有相应抗生素的改良TB培 养基中培养，以IPTG诱导或者连续培养的方法诱导蛋白表达，并在28°C下继续通气培养 24?72小时以积累类胡萝卜素。离心收集得到的大肠杆菌菌体沉淀呈现橙黄色，以1%? 10% SDS溶液重悬菌体，乙酸乙酯萃取总色素，并经高效液相色谱（HPLC)检测，堇菜黄素是 主要产物，占总类胡萝卜素的80%以上，其余为少量玉米黄素以及环氧化反应的中间产物 花药黄素等组分。
[0008] 本发明的有益效果是：本发明利用遗传背景清晰、安全无毒的分子克隆常用菌种 作为发酵菌种，通过基因工程转化重组载体、诱导蛋白可溶表达直至发酵生产堇菜黄素，成 本低廉，易于实行，发酵直接获得的堇菜黄素就具有较高的纯度，可应用于食品工业、保健 品行业，以及作为高纯度的化合物标准品等科研领域。 【专利附图】

【附图说明】
[0009] 图1为本发明构建的原核表达载体pMAL-C5X-AtZEP图谱。
[〇〇1〇] 图2为重组拟南芥玉米黄素环氧化酶在大肠杆菌R〇setta2(DE3)pLysS菌株中表 达的SDS-PAGE电泳图。
[0011] 重组大肠杆菌经IPTG诱导后在相对分子量约为120kDa处有显著增加的蛋白条 带，与预期的蛋白分子量一致（拟南芥玉米黄素环氧化酶相对分子量为73.8kDa，pMAL-C5X 载体所携带的麦芽糖结合蛋白融合标签相对分子量为42kDa)。
[0012] 泳道1为37°C培养条件下未加 IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白，作为阴性对照；
[0013] 泳道2为28°C培养条件下，以0. 4mM IPTG诱导表达的大肠杆菌总蛋白。
[0014] 图3为通过蛋白质免疫印迹法检测重组拟南芥玉米黄素环氧化酶在大肠杆菌 DH5a菌株中的可溶表达结果。
[0015] 泳道1为蛋白分子量标准；
[0016] 泳道2为DH5 a菌体经裂解离心获得的可溶组分。
[〇〇17] 图4为pAC-ZEAX质粒转化大肠杆菌DH5 a菌株的阳性克隆合成的总类胡萝卜素 的HPLC检测图谱。峰1为全反式玉米黄素，峰2和3为含有顺式双键的玉米黄素，峰4为 β-胡萝卜素。
[0018] 图5为pAC-ZEAX质粒和pMAL-C5X-AtZEP质粒共同转化大肠杆菌DH5 α菌株的阳 性克隆以IPTG诱导时合成的总类胡萝卜素的HPLC检测图谱。峰1为含有顺式双键的堇菜 黄素，峰2为全反式堇菜黄素，峰3为花药黄素，峰4为未知组分，峰5为玉米黄素。 【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例与附图对本发明进行进一步的描述。
[0020] 实施例1拟南芥玉米黄素环氧化酶基因重组表达载体的构建
[0021] 以拟南芥哥伦比亚野生型（Arabidopsis thaliana Col-Oecotype)幼嫩的新鲜叶 片为材料，依据RNAiso Plus(TaKaRa BIO INC.，Japan)试剂的说明书步骤提取总RNA，依据 PrimeScriptTMlst Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa BIO INC.，Japan)试剂盒的说明书 步骤逆转录拟南芥总RNA为cDNA第一链，并作为PCR扩增模板。根据拟南芥信息资源网站 (http://www. arabidopsis. orfi)提供的拟南芥玉米黄素环氧化酶的编码区序列，设计包含 酶切位点的引物。引物两端分别引入Nco I和BamH I酶切位点，引物序列如下：
[0022] 上游：5' -CATGCCATGGCAATGGGTTCAACTCCGTTTTGCTAC-3'，引入 Nco I 酶切位点 (SEQ ID NO. 1)
[0023] 下游：5' -CGGGATCCTCAAGCTGTCTGAAGTAATTTA-3'，引入 BamH I 酶切位点（SEQ ID NO. 2) 〇
[0024] 以 PrimeSTAR 高保真 DNA 聚合酶（TaKaRa BIO INC.，Japan)PCR 扩增拟南芥玉 米黄素环氧化酶基因，对PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测，切下符合预期大小 的目的条带纯化回收，将回收到的DNA片段进行腺苷酸加尾并克隆至pMD 19-T (TaKaRa BIO INC.，Japan)载体上，转化大肠杆菌（Escherichiacoli)DHlOB感受态细胞 (Invitrogen，USA)，经单菌落PCR筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后，再将单克隆 测序，得到含有Nco I和BamH I酶切位点及编码拟南芥玉米黄素环氧化酶的基因序列的质 粒 pMD19-T-AtZEP。
[0025] 将质粒pMD19-T-AtZEP和质粒pMAL-C5X在37°C条件下分别用DNA限制性内切 酶Nco I和BamHI双酶切3小时，酶切产物分别进行1 %琼脂糖凝胶电泳分析，回收含有 AtZEP以及pMAL-C5X载体的片段，用T4DNA连接酶16°C连接过夜。连接产物转化大肠杆菌 DH10B感受态细胞，挑取含有100 μ g/ml羧苄青霉素抗性平板上长出的单克隆，进行单克隆 PCR鉴定，阳性菌落提取质粒后进行酶切图谱鉴定和测序。将获得的重组表达载体命名为 pMAL-C5X-AtZEP，如图 1 所示。
[0026] 实施例2使用IPTG诱导重组载体pMAL-C5X-AtZEP的原核表达
[0027] 将实施例1中构建的重组表达载体pMAL-C5X_AtZEP转化大肠杆菌Rosetta2 (DE3) pLysS感受态细胞，挑取含有100 μ g/ml羧苄青霉素和34 μ g/ml氯霉素的抗性平板上长出 的单菌落PCR检测目的基因。PCR检测结果表明单克隆菌落中含有目的基因片段，可用于蛋 白的诱导表达实验。
[0028] 将鉴定正确的克隆于5ml TB培养基中37°C培养过夜，以1:100的比例将培养过 夜的菌液接种到5ml含有100 μ g/ml羧苄青霉素和34 μ g/ml氯霉素的TB培养基中进行培 养，待至〇· 6?0· 8时，加入IPTG至终浓度0· 1?0· 4mM，28°C震荡培养3?6小时。 取lml菌液，12000RPM离心2min收集菌体，以100 μ 1去离子水重悬菌体，取10 μ 1样品加 入等体积2XLaemmli缓冲液，99°C变性5min待冷却后上样至10% SDS-PAGE蛋白胶进行电 泳分析，电泳完毕的凝胶以考马斯亮蓝进行染色并脱色拍照。蛋白电泳结果如图2所示。
[0029] 实施例3通过连续培养的方法原核表达重组载体pMAL-C5X_AtZEP
[0030] 将实施例1中构建的重组表达载体pMAL-C5X_AtZEP转化大肠杆菌DH5 α感受态 细胞，挑取含有100 μ g/ml羧苄青霉素的抗性平板上长出的单菌落PCR检测目的基因。PCR 检测结果表明单克隆菌落中含有目的基因片段，可用于蛋白诱导表达实验。
[0031] 将鉴定正确的克隆于5ml含有100 μ g/ml羧苄青霉素的改良TB培养基（表1)中 28°C培养24小时。取lml菌液，12000RPM离心2min收集菌体，加入200 μ 1 BugBuster试 剂（Merck Novagen, Germany)和1 μ 1 DNA酶重悬菌体，室温下轻柔混合10?20min，4°C、 16000g离心20min。取10 μ 1上清样品加入等体积2XLaemmli缓冲液混勻，99°C变性5min, 待冷却至室温后上样至10% SDS-PAGE蛋白胶进行电泳分离，电泳完毕的凝胶以半干转膜 法转移蛋白至硝酸纤维素膜，以特异性识别MBP标签的小鼠单克隆抗体进行蛋白质免疫印 迹检测，结果如图3所示。
[0032] 表1改良的TB培养基配方
[0033]
【权利要求】
1. 一种生产堇菜黄素的方法，其特征是由以下步骤构成： (1) 克隆拟南芥玉米黄素环氧化酶基因 AtZEP ; (2) 构建含有重组拟南芥玉米黄素环氧化酶基因的载体； (3) 通过IPTG诱导在大肠杆菌体内大量表达重组拟南芥玉米黄素环氧化酶； (4) 通过连续培养的方法在大肠杆菌体内表达可溶重组拟南芥玉米黄素环氧化酶。
2. 根据权利要求1所述生产堇菜黄素的方法，其特征在于使用下列序列的引物扩增拟 南芥玉米黄素环氧化酶基因： 上游:5' -CATGCCATGGCAATGGGTTCAACTCCGTTTTGCTAC-3' (SEQ ID NO. 1), 下游:5' -CGGGATCCTCAAGCTGTCTGAAGTAATTTA-3' (SEQ ID NO. 2)。
3. 根据权利要求1所述生产堇菜黄素的方法，其特征在于将权利要求2扩增得到的片 段克隆至PMAL-C5X载体，获得的重组质粒名为pMAL-CX5-AtZEP。
4. 根据权利要求1所述生产堇菜黄素的方法，其特征在于将携带权利要求3所述重组 质粒的大肠杆菌R〇setta2 (DE3) pLysS菌株于37 °C需氧条件下，在TB培养基中培养至 为0. 6?0. 8时，加入IPTG至终浓度0. 1?0. 4mM，28°C继续培养3?6小时，诱导蛋白表 达的菌液继续在原条件下培养24?72小时，离心收集的菌体呈现橙黄色，以1 %?10%终 浓度的SDS溶液重悬菌体并以乙酸乙酯萃取总色素，主要成分为堇菜黄素。
5. 根据权利要求1所述生产堇菜黄素的方法，其特征在于将携带权利要求3所述重组 质粒的大肠杆菌DH5 α菌株于28°C需氧条件下，在改良的TB培养基中培养24?72小时， 离心收集的菌体呈现橙黄色，以1%?10%终浓度的SDS溶液重悬菌体并以乙酸乙酯萃取 总色素，主要成分为堇菜黄素。
6. 根据权利要求1所述生产堇菜黄素的方法生产的堇菜黄素在食品工业、保健品行业 或作为高纯度的化合物标准品在科研领域中的应用。
【文档编号】C12R1/19GK104109656SQ201410330875
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】卢山, 黄惺祺, 赵蕾 申请人:南京大学