一种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法
【专利摘要】一种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法，属于生物制剂检测【技术领域】。其包括：根据茶毛虫核型多角体病毒的A13-1基因设计引物；从感染茶毛虫核型多角体病毒的虫体中提取茶毛虫核型多角体病毒基因组DNA，通过PCR扩增得到A13-1基因片段；制备质粒标准品并测定其浓度；荧光定量PCR反应建立标准曲线；样品检测。本发明突破了传统的生物测定技术，解决了茶毛虫核型多角体病毒的准确定性问题。与传统生物测定方法相比，本发明毒力指标检测更为精细，毒力评价周期大大缩短，可广泛用于病毒制剂质量的评定，规范茶毛虫核型多角体病毒的生产应用。
【专利说明】-种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制剂检测【技术领域】，具体涉及一种茶毛虫核型多角体病毒的定量 检测方法。
【背景技术】
[0002] 茶毛虫核型多角体病毒nuclear polyhedrosis ν?η?8，/--/75·ΝΡν)属杆状病毒科，核型多角体病毒属。是茶毛虫的病原性天敌，通 过幼虫取食后在虫体内迅速增殖，致使其感染发病而死亡。目前这种病毒已可以通过室内 大量增殖，经配制形成产品，进行商业化生产，近年来，及//zsNPV作为一种高效病毒杀虫剂在 各省茶区广泛推广使用，对茶毛虫进行有效的生物防治，产生了良好的社会、经济和生态效 益。因为这种病毒产品不同于一般的农药，它是一个活体，目前只有通过生物测定的方法进 行检测。即用病毒产品喂饲茶毛虫幼虫，观察其是否发病来确定，因为病毒是专一的，茶毛 虫病毒只能感染茶毛虫幼虫。这种传统的生物测定的方法使得目前在及//^NPV病毒制剂的 生产、使用过程中存在毒力指标检测粗放、评价周期过长、制剂质量难以有效监控等问题。 为了快速有效检测出生物杀虫剂中的含量，建立灵敏、特异而又简易的病毒检测 方法至关重要。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种茶毛虫核型多角体病 毒的定量检测方法的技术方案。
[0004] 所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 根据茶毛虫核型多角体病毒的J13-1基因设计引物及//zsNPV J13-1 F和引物 及//zsNPV J13-1 R，所述的引物及//zsNPV J13-1 F核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述的 引物及//zsNPV J13-1 R核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示； 2) 从感染茶毛虫核型多角体病毒的虫尸中提取茶毛虫核型多角体病毒基因组DNA，获 取目的片段，以目的片段为模板，用步骤1)中设计的一对引物进行PCR扩增得到J13-1基 因片段； 3) 将步骤2)扩增获得的J13-1基因片段与载体pGEM-T连接，转化入大肠杆菌DH5a中， 挑单克隆菌株，摇菌，再采用PCR鉴定单菌落质粒DNA，将鉴定为阳性的重组质粒测序并测 定质粒标准品浓度，保存于_20°C冰箱中，备用，所述的重组质粒核苷酸序列如SEQ ID N0: 3所示； 4) 将质粒标准品按梯度稀释成不同浓度的模板，进行荧光定量PCR，以其模板数的对数 值为X轴，CT值为Y轴做回归曲线，建立检测茶毛虫核型多角体病毒的标准曲线； 5) 提取待测样品基因组，进行荧光定量PCR反应，根据步骤4)中建立的标准曲线求出 待测样品的拷贝数，确定待测样品的浓度。
[0005] 1所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤2) 中PCR扩增的程序：先94°C预变性3min ;然后94°C变性30s，60°C变性45s ;循环35次，最 后延伸72°C延伸7min。
[0006] 所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤4) 中荧光定量 PCR 采用 20ul 体系：质粒模板 2μ?，SYBR Premix Ex TaqTM (2X) 1〇μ?，R0X Reference Dyell 0·4μ?，引物及//7SNPVJ13-1 F 和引物及//7SNPVJ13-1 R 各 0·8μ?，加灭 菌双蒸水6ul至2〇μ? ;反应程序为：95°C 30s ;95°C 5s，60°C 34s ;共40个循环，阴性对照 使用灭菌双蒸水。
[0007] 所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤4)中 梯度为 1. 0X107、1. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、1. 0X103 和 1. 0X102 拷贝 /ML。
[0008] 上述的一种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法，设计合理，突破了传统的生 物测定技术，解决了茶毛虫核型多角体病毒的准确定性问题。与传统生物测定方法相比，本 发明毒力指标检测更为精细，毒力评价周期大大缩短，可 广泛用于病毒制剂质量的评定，规范茶毛虫核型多角体病毒的生产应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1为J13-1基因的PCR扩增产物电泳图； 图 1 中：M-DL 2000 Marker ; 2- J13-1 基因 PCR 扩增产物； 图2为重组质粒pGEMTeasy- A3-1PCR扩增产物电泳图； 图 2 中：M-DL 2000 Marker ; 2-重组质粒 pGEMTeasy- A3-1PCR 扩增产物； 图3为及识sNPV J13-1基因扩增的熔解曲线图； 图4为及识sNPV PCR扩增产物的扩增曲线图； 图5为J13-1基因不同稀释梯度的荧光定量PCR标准曲线图。
【具体实施方式】
[0010] 以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0011] 实施例1 :及/ASNPV病毒样品的获得及其基因组DNA的提取 以茶毛虫核型多角体病毒感染茶毛虫幼虫，收集虫尸，以PBS溶液作缓冲液反复匀浆， 缓冲液体积与虫尸体积比为10:1，l〇〇〇〇g离心l〇min，重复3次，上清液即为病毒粗提液； 病毒粗提液经35000g离心2小时，沉淀即为经纯化的病毒粒子；用1 XPBS反复洗涤纯化的 病毒粒子，至乳白色为止；用 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0 试剂盒进行茶毛虫核型多角体病毒基因组的提取。步骤如下：1)病毒的裂解①取200μ 1的 病毒原液。②加入 200 μ 1 的 Buffer VGB、20 μ 1 的 Proteinase Κ 和 1. 0 μ 1 的 Carrier RNA，充分混匀于56°C水浴温浴10分钟。③离心，取上清；向上清中加入200 μ 1无水乙醇， 充分吸打混勻。2)将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中， 12.000 rpm离心2分钟，弃滤液。3)将500μ1的Buffer RWA加入至Spin Column中， 12.000 rpm离心1分钟，弃滤液。4)将700μ1的Buffer RWB加入至Spin Column中， 12.000 rpm离心1分钟，弃滤液。注）请确认Buffer RWB中已经加入了指定体积的100% 乙醇。请沿Spin Column管壁四周加入Buffer RWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的 盐份。5)重复操作步骤 4)。6)将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12, 000 rpm 离心 2 分钟。7)将 Spin Column 安置于新的 1. 5ml RNase free collection tube 上，在 Spin Column膜的中央处加入30?50μ 1的RNase free dH20,室温静置5分钟。8) 12，000 rpm离心2分钟洗脱DNA/RNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到Spin (：〇11111111膜的中央或再加入30?5(^1的8似86^66(1!120，室温静置5分钟后，12,000卬111 离心2分钟洗脱DNA。4°C保存备用。
[0012] 实施例2 :目的片段PCR扩增 根据及//zsNPV基因组序列（NC_012639. 1)的J13-1基因，采用DNAStar软件，设计 了一对特异性引物及//^NPV X13-1 F和引物及识sNPV X13-1R，由上海生工生物技术有限 公司合成，引物序列分别为：5'_ GTCCCATGAAACCCAATCGC -3'（如SEQ ID N0:1所示）和 5'-CGATACTCGTTGTTGCTGCC -3'（如 SEQ ID N0:2 所示），扩增 J13-1，PCR 反应采用 25μ? 体 系（模板 2PL，10Xbuffer 2. 5PL，dNTP 2μ?，正反引物各(λ 5PL，Tag 酶(λ 25μ?，加灭菌双蒸 水至25PL)，PCR扩增使用两步法，程序如下：先94°C预变性3min ;然后94°C 30s，62°C45s ; 循环35次，最后72°C延伸7min。取PCR产物10ul于1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见 图1，与预计大小相一致。最后，用琼脂糖凝胶DNA试剂盒纯化回收扩增片段，按说明书操作 进行。
[0013] 实施例3 :质粒标准的制备及其浓度测定 将实施例2中扩增的J13-1基因片段与载体pGEM-T连接，转化入大肠杆菌DH5a中，挑 单克隆菌株，摇菌。使用试剂盒抽提单菌落质粒DNA，进行PCR鉴定。将鉴定为阳性的重组 质粒送至上海生工生物技术有限公司测序。与参考序列进行比较，确认构建结果，构建完毕 后用紫外分光光度计测定其浓度，将1KL阳性质粒稀释100倍测定其0D 26(I和0D28(I值，计算 重组质粒浓度及0D26(i/0D 28(i比例，将重组质粒稀释至1(Γ1(Ι拷贝/>L，保存于-20°C冰箱中。
[0014] 重组质粒PCR鉴定结果见图2,片段大小为130bp，与预期结果相符。重组质粒的 测序结果如下： 5'-GTCCCATGAAACCCAATCGCTGTTATCGGTTTTTGGCTCAGCACGCTCTTCGTTGTGATCACGATTACGT TCCGCACGAAATAATTAGAATCGTTGAACCTTCGTACGTGGGCAGCAACAACGAGTATCG -3'（如 SEQ ID N0: 3所示)。
[0015] 实施例4 :突光定量PCR反应 采用 2〇μ? 体系：模板 2μ?，SYBR Premix Ex Taq? (2 X) 1〇μ?，R0X Reference Dye II 0. 4μ?，引物及//zsNPV J13-1 F和引物及//zsNPV J13-1 R各0. 8μ?，加灭菌双蒸水至2〇μ?。反 应程序为：95°C 30s;95°C 5s，60°C 34s;共40个循环，阴性对照使用灭菌双蒸水。荧光定 量实验中的 SYBR Premix Ex Taq (2X)和 R0X Reference Dye II均为 Takara 公司产品， 荧光定量PCR仪型号为ABI PRISM 7500。
[0016] 实施例5 :标准曲线的建立及其灵敏性 将含有目的片段的质粒标准品按10倍系列稀释成1. 0X107、1. 0X106、1. 0X105、 1. ΟΧ ΙΟ4、1. ΟΧ ΙΟ3、1. ΟΧ 102拷贝/>L的模板，将各浓度标准重组质粒的扩增产物进行定 量PCR熔解曲线分析，结果见图3,与预期完全相符，均为单峰，无非特异性扩增，说明反应 特异，表明该方法有良好的特异性。
[0017] 将以上各浓度的质粒标准品进行荧光定量PCR，扩增的荧光曲线见图4,表明该方 法检测灵敏度可达到1. οχ 1〇2拷贝/μ?。反应结束后取PCR反应液，用琼脂糖凝胶电泳进 行鉴定。
[0018] 实验结束后，使用excel进行数据分析，以其实模板数的对数为X轴，CT值为Y 轴做回归曲线，建立检测及/AsNPV的标准曲线，标准曲线见图5,斜率为-3. 081，截距为 36. 534, R2=0. 9983,从而可以得出标准曲线为：y = -3. 081x + 36. 534。通过标准曲线，可 以求出待测样品的拷贝数。
[0019] 实施例6 :FQ_PCR重复性 将质粒标准品稀释成3个浓度，模板DNA含量为1. OX 107、1. OX 106、1. OX 105拷贝/ μ?，对每个浓度的样品经荧光定量PCR进行定量分析，分别重复3次检测，批内和批间重复 性通过计算CT值的标准差（SD)和变异系数（CV)进行评价。
【权利要求】
1. 一种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 根据茶毛虫核型多角体病毒的J13-1基因设计引物及//zsNPV J13-1 F和引物 及//zsNPV J13-1 R，所述的引物及//zsNPV J13-1 F核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述的 引物及//zsNPV J13-1 R核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 2) 从感染茶毛虫核型多角体病毒的虫尸中提取茶毛虫核型多角体病毒基因组DNA，获 取目的片段，以目的片段为模板，用步骤1)中设计的一对引物进行PCR扩增得到J13-1基 因片段； 3) 将步骤2)扩增获得的J13-1基因片段与载体pGEM-T连接，转化入大肠杆菌DH5a中， 挑单克隆菌株，摇菌，再采用PCR鉴定单菌落质粒DNA，将鉴定为阳性的重组质粒测序并测 定质粒标准品浓度，保存于_20°C冰箱中，备用，所述的重组质粒核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示； 4) 将质粒标准品按梯度稀释成不同浓度的模板，进行荧光定量PCR，以其模板数的对数 值为X轴，CT值为Y轴做回归曲线，建立检测茶毛虫核型多角体病毒的标准曲线； 5) 提取待测样品基因组，进行荧光定量PCR反应，根据步骤4)中建立的标准曲线求出 待测样品的拷贝数，确定待测样品的浓度。
2. 如权利要求1所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述 的步骤2)中PCR扩增的程序：先94°C预变性3min ;然后94°C变性30s，60°C变性45s ;循 环35次，最后延伸72°C延伸7min。
3. 如权利要求1所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述 的步骤4)中荧光定量PCR采用20ul体系：质粒模板2PL，SYBR Premix Ex TaqTM (2X) 1〇μ?，ROX Reference Dye Π 0·4μ?，引物及/psNPV J13-1 F 和引物及/psNPV J13-1 R 各 0. 8μ?，加灭菌双蒸水6ul至2〇μ? ;反应程序为：95°C 30s ;95°C 5s，60°C 34s ;共40个循 环，阴性对照使用灭菌双蒸水。
4. 如权利要求1所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述 的步骤 4)中梯度为 1. ΟΧΙΟ7、1. ΟΧΙΟ6、1. ΟΧΙΟ5、1. ΟΧΙΟ4、1. 0X103 和 1. 0X102 拷贝/>L。
【文档编号】C12Q1/68GK104099429SQ201410340772
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】肖强, 袁志军, 付建玉, 唐美君, 葛超美 申请人:中国农业科学院茶叶研究所